同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法及其应用

摘要

本发明提供了一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱‑DAD‑串联质谱法及其应用，该方法包括，将待测样品溶于色谱级无水乙醇中得到检测液，采用液相色谱‑DAD‑串联质谱技术对检测液进行检测；其中，所述液相色谱采用反相液相色谱，流动相为不含水的醇类溶液，质谱采用搭配DAD‑紫外检测器。本发明通过选用无水乙醇为流动相，能保证四个对映异构体的最大分离效果和手性色谱柱不可以使用任何水相体系的要求；通过往流动相中加入0.2‑0.45 v%的氨水，使得氟氯苯氰菊酯离子化，提高检测灵敏度；通过采用搭配DAD‑紫外检测器，提高了其质谱响应，同时优化了碰撞能等参数，实现了氟氯苯氰菊酯4个对映异构体的定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法及其应用。

背景技术

迄今为止，农业生产中超过25 %的化合物都具有手性中心；其中，绝大多数均以外消旋体生产、销售、施用并排放到环境中。因此，手性农药的环境安全问题是当前环境科学的一个研究热点，需要在对映体水平上对其进行研究和完善，而目前关于手性药剂的立体选择性特性在蜂学上的报道还较少。

氟氯苯氰菊酯条是包括我国在内的许多国家广泛使用的一种治螨药物，其商品名为Bayvarol，中文商品名为蜂螨清，由德国拜耳公司生产，20世纪90年代即已在我国登记使用；但由于价格过高使得其在我国蜂业上的推广应用受到限制，而主要应用于牛、羊、马、狗和猫等动物体外寄生虫和环境蚊虫的防治，具有抑制成虫产卵和抑制卵孵化的活性。近年来，随着蜂螨对氟胺氰菊酯抗性的显著增长和在蜂产品中残留问题的日益严重，氟氯苯菊酯在我国蜂螨防治上的应用得到了快速发展。

氟氯苯氰菊酯，化学名称为α-氰基-4-氟-3-苯氧基苄基-3-（β，4-二氯苯乙烯基）-2，2-二甲基环丙烷羧酸酯，其结构如下所示：

与其他菊酯类化合物相比，氟氯苯氰菊酯结构复杂，分子结构中含有三个苯环、N、O、F、Cl杂原子、环丙烷基团以及碳碳双键、三键等结构，其中含有3个手性碳原子，在环丙烷基团及烯烃碳碳双键位置存在一个顺反异构中心，故氟氯苯菊酯理论上具有16种不同的立体构型。商品化的氟氯苯氰菊酯有效成分主要含两类构型，一种是92 % trans-Z构型，另一种是8 %的cis-Z构型，Schnitzerling等人发现二者在牛蜱幼虫上的沉积率和代谢率相近，但均比trans-氯氰菊酯低约3倍；Lisseter与Hambling采用Pickle柱检测到氟氯苯氰菊酯四个不同峰，猜测均为cis-构型异构体，具体结构信息尚未见报道。

氟氯苯氰菊酯在蜂巢系统中存在一定的残留隐患且对蜜蜂具有一定的毒性风险，且其对映异构体的结构相似太高，从而导致对氟氯苯氰菊酯中的对映异构体的检测挑战性很大。

截止到目前，在对映异构体水平上研究氟氯苯氰菊酯的环境行为规律还尚未开展，也未见到有关氟氯苯氰菊酯中的对映异构体的定性和定量的检测。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法及其应用。

本发明采用如下技术方案：

同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法，所述4种对映异构体分别为：

包括如下步骤：

将待测样品溶于色谱级无水乙醇中得到检测液，采用液相色谱-DAD-串联质谱技术对检测液进行检测；

其中，所述液相色谱采用反相液相色谱，且流动相为不含水的醇类溶液。

在上述技术方案中，所述流动相为含氨水的无水乙醇溶液；

在本发明的优选实施方式中，所述流动相中氨水的加入量为0.2- 0.45 v%。

在上述技术方案中，所述质谱条件具体为：

在MRM模式下，采用搭配DAD-紫外检测器，调整紫外检测器的紫外波长为190-330nm。

在本发明的一个具体实施方式中，所述紫外检测器的紫外波长调整为210 nm。

进一步地，在上述技术方案中，所述液相色谱中采用的色谱柱为CHIRALPAK AD-H手性色谱柱；

在本发明的一个具体实施方式中，所述CHIRALPAK AD-H手性色谱柱的规格型号为0.46 cm I.D. * 25 cm L。

具体地，在上述技术方案中，所述液相色谱条件为：

流动相为含0.3 v%氨水的无水乙醇溶液；

流动相流速为0.4-0.6 ml/min，柱温为35-45 ℃，进样量为20 μl；

等度洗脱。

再进一步地，在上述技术方案中，所述质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为12-18 L/min，鞘气气流量为10-15L/min，鞘气温度340-375 ℃，毛细管电流3800-4500 V，加热块温度320-480 ℃；

质谱检测参数为：

对映异构体P1、P2、P3和P4的保留时间分别为10.27 min、11.5 min、17.5 min和45.89 min。

在本发明的具体实施方式中，可以使用本领域中常用的方法来得到各对映异构体的具体浓度值。具体为：

结合液相色谱-DAD-串联质谱法得到的检测结果和对映异构体P1、P2、P3和P4对应的标准工作曲线，得到各对映异构体的含量值。

详细地，在上述技术方案中，所述对映异构体的标准工作曲线的绘制步骤包括：

准确称量各对映异构体标准品10 mg，用色谱级无水乙醇溶解定容至10 mL容量瓶，得到1000 mg/L 的标准储备溶液；以无水乙醇为溶剂，在1-1000 μg/L范围配置8-12 个不同浓度梯度的标准溶液，采用液相色谱-DAD-串联质谱法对标准溶液进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制得到标准工作曲线。

其中，上述液相色谱-DAD-串联质谱法中所有的参数与测定检测液的相应参数相同。

本发明另一方面还提供了上述液相色谱-DAD-串联质谱法在蜜蜂体内氟氯苯氰菊酯对映异构体的检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明所提供的同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法通过选用无水乙醇为流动相，能在反相液相色谱-DAD-串联质谱条件下保证四个对映异构体的最大分离效果，且能满足其手性色谱柱不可以使用任何水相体系的要求；

（2）本发明所提供的同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法通过往流动相中加入0.2-0.45 v%的氨水，使得整体体系偏碱性，使氟氯苯氰菊酯易于脱氢，从而使得氟氯苯氰菊酯离子化，提高检测灵敏度；

（3）本发明所提供的同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法通过采用搭配DAD-紫外检测器，并优化紫外检测器的紫外波长，从而提高了其质谱响应，并在此基础上优化了碰撞能等参数，最终实现了氟氯苯氰菊酯4个对映异构体的定量分析。

附图说明

图1为本发明实施例1的对映异构体P1的标准曲线；

图2为本发明实施例1的对映异构体P2的标准曲线；

图3为本发明实施例1的对映异构体P3的标准曲线；

图4为本发明实施例1的对映异构体P4的标准曲线；

图5为本发明实施例1的250 μg/L的混合标准工作溶液（氟氯苯氰菊酯标准工作溶液）的检测结果；

图6为本发明对比例2中采用未搭配DAD检测器的情况下的混合标准工作溶液的检测结果；

图7为本发明应用例中氟氯苯氰菊酯喂养3天后的蜜蜂样品中4种对映异构体的含量的检测结果图；

图8为本发明应用例中氟氯苯氰菊酯喂养7天后的蜜蜂样品中4种对映异构体的含量的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下所有实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法，包括以下步骤：

1、材料

氟氯苯氰菊酯标准品购自上海源叶生物科技有限公司，P1-P4标准品为由商品化氟氯苯氰菊酯中拆分制备获得。

2、仪器与试剂耗材

仪器：

安捷伦6495 UPLC-DAD-MS/MS质谱仪，高效粉碎机（OSE-Y40，天根生化科技有限公司），电子分析天平（PL602E/02型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司），高速离心机（Heraeus Fresco17，赛默飞世尔科技(中国)有限公司），涡旋震荡仪（Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries公司），真空离心浓缩仪（CV200,北京吉艾姆科技有限公司）。

试剂耗材：

色谱柱为大赛璐CHIRALPAK AD-H手性色谱柱（Daicel，0.46 cm I.D. * 25 cmL），色谱纯乙醇（赛默飞世尔科技(中国)有限公司），PSA（北京五洲东方科技发展有限公司），硫酸镁（北京五洲东方科技发展有限公司）。

3、方法

（1）溶液的配制

准确称量各个对映异构体标准品10 mg至10 mL容量瓶，采用色谱级无水乙醇溶解定容至刻度，分别得到浓度为1000 mg/L 的四个对映异构体的标准储备溶液。

分别准确移取上述四个浓度为1000 mg/L 的对映异构体的标准储备溶液，依次稀释至1000 μg/L、500 μg/L、250 μg/L、125 μg/L、50 μg/L、25 μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5 μg/L 和1μg/L，得到各对映异构体的标准工作溶液，用于各对映异构体的标准曲线的绘制。

同时，分别准确移取适量同等体积的上述浓度为1000 μg/L的四个对映异构体的标准工作溶液，混合均匀后，得到各对映异构体的浓度均为250 μg/L的混合标准工作溶液（氟氯苯氰菊酯标准工作溶液）。

（2）绘制标准曲线

色谱条件：

流动相为含0.3 v%氨水的无水乙醇溶液，流动相流速为0.5 ml/min，柱温为40℃，进样量为20 μl，等度洗脱；

质谱条件具体为：

在MRM模式下，采用搭配DAD-紫外检测器，调整紫外检测器的紫外波长为210 nm；电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为15 L/min，鞘气气流量为12 L/min，鞘气温度350 ℃，毛细管电流3800-4500 V，加热块温度320-480 ℃；

质谱检测参数为：

得到如下标准曲线结果：

标准曲线如图1-4所示，结合上表和图1-4中可以看出，各个对映异构体在1-500 μg/L 范围内线性响应良好，最小LOQ在1μg/L，灵敏度高，准确度高。

（3）250 μg/L的混合标准工作溶液（氟氯苯氰菊酯标准工作溶液）的检测

采用上述（2）中的条件检测250 μg/L的混合标准工作溶液（氟氯苯氰菊酯标准工作溶液）（重复三次），结果如图5所示。

从图中可以看出，四种对映异构体可以完全分离；且当各个对映异构体标准品的浓度为250 μg/L时，P1、P2、P3和P4的峰面积响应分别为11217、31821、39181、10251，质谱响应高。

对比例1

本对比例提供了一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法，其具体步骤与实施例1相同，区别仅在于，流动相为无水乙醇，各对映异构体的峰面积响应如下表所示。

从上表的检测结果中可以看出，当不添加氨水时，检测灵敏度明显低于实施例1；四种对映异构体的质谱响应整体偏低，同样条件下各个对映异构体的峰面积响应低于含0.3 v%氨水的检测体系。

对比例2

本对比例提供了一种同时检测氟氯苯氰菊酯中4种对映异构体的液相色谱-DAD-串联质谱法，其具体步骤与实施例1相同（重复三次），区别仅在于，未采用搭配DAD检测器的检测仪器，检测结果如图6所示，未发现明显的质谱响应。

应用例

实验样本来自于中国农业科学院蜜蜂研究所的实验室饲喂氟氯苯氰菊酯3天和7天的蜜蜂样本。具体过程如下：

（1）样品前处理

取蜜蜂样品2g至高效粉碎机中充分破碎，随后转移至50mL离心管中，然后加入8ml正己烷，在多样品涡旋震荡仪上2500r/min充分震荡5min，然后8000r/min 离心5min，转移上清液至25mL离心管中；重复以上用正己烷提取的操作一次，合并两次的提取液。

称量0.5g PSA和0.5g MgSO

（2）将待测样本通过液相色谱-DAD-串联质谱仪进行分析检测：

色谱条件：

流动相为含0.3 v%氨水的无水乙醇溶液，流动相流速为0.5 ml/min，柱温为40℃，进样量为20 μl，等度洗脱；

质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为15 L/min，鞘气气流量为12 L/min，鞘气温度350 ℃，毛细管电流3800-4500 V，加热块温度320-480 ℃；

质谱检测参数为：

图7和图8分别为氟氯苯氰菊酯喂养3天和7天后的蜜蜂样品中4种对映异构体的含量的检测结果图。从图中可以看出，对映异构体P1、P2、P3和P4的保留时间分别为10.42min、11.66 min、17.87 min和48.59 min。根据各蜜蜂样本的检测结果，结合实施例1中各对映异构体的标准曲线，可计算得到4种氟氯苯氰菊酯对映异构体的含量。

结果如下表所示。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。