用于与抗原无关地从头预测与癌症相关联的TCR组库的计算机化系统和方法

摘要

公开了用于泛癌早期检测工具的系统和方法，该工具能够通过分析和理解血液T细胞受体(TCR)组库中的变化来增强从早期和/或晚期癌症发出的小信号。所公开的系统和方法实施了一种基于免疫的癌症检测技术，该技术可以从外周免疫组库的签名中检测癌症信号，该技术即使在疾病的早期阶段也可以高准确度地执行。采用了改进的框架，其通过新颖的机器学习算法实施，该算法可以基于患者的外周血TCR组库预测癌症状态，使得对白血细胞的基因组DNA进行深度TCR测序，从而使得能够与肿瘤抗原无关地进行与癌症相关联的TCR的检测(预测或确定)。这为在各种疾病中的早期和晚期癌症提供了鲁棒的生物标志物。

说明书

本申请包含受版权保护的材料。版权所有者不反对任何人按照本专利公开登载在专利商标局的文件或记录中那样传真复制本专利公开，但在其他方面保留所有版权。

相关应用的交叉引用

本申请要求于2019年3月28日提交的美国临时专利申请No.62/825,235的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入。

政府利益

这项工作没有政府的利益或支持。

技术领域

本公开一般而言涉及基于免疫组库(repertoire)的癌症诊断技术，更特别地涉及一种用于诊断癌症患者并利用外周血T细胞受体(TCR)组库确定他/她的癌症状态的新颖系统和方法。

背景技术

免疫组库测序数据在癌症诊断和预后方面的临床效用尚未得到充分探索。当前的技术主要集中在检测人体内与癌症相关的物质的大阈值。例如，传统的癌症检测方法依赖于癌症生物标志物(例如，血清中的CA抗原)、循环脱氧核糖核酸(DNA)、癌细胞、癌症病变的成像扫描等的识别。但是，这些不仅很大程度上不准确且效率低下，而且它们仅限于在疾病后期检测癌症的范围。

发明内容

本公开提供了一种改进的计算机化框架，用于与抗原无关地从头预测与癌症相关联的TCR组库。所公开的框架是一种泛癌早期检测工具，其能够通过分析和理解血液T细胞组库中的变化来增强早期癌症发出的小信号。所公开的系统和方法提供了在最早阶段检测许多当前技术无法识别的癌症—例如肾癌、卵巢癌和胰腺癌的能力。如本文所讨论的，除了用于早期癌症检测的改进能力之外，所公开的框架还提供用于改进检测患者晚期癌症的准确度的能力，例如，它可以与放射线图像一起使用以增加它们的诊断准确性(包括上面提到的现有传统方法)。

所公开的系统和方法实施了第一种基于免疫的癌症检测技巧或技术。即，当个体患有癌症时，免疫系统会通过癌症特异性T细胞的增殖做出反应，并使它们在血液和淋巴系统中循环。虽然这种身体反应是自然发生的，但它在血液数据中的呈现和分析不是，因此需要改进的自动化框架来执行此类分析。所公开的框架使用特定的自动化技巧从外周免疫组库的签名中检测癌症信号，该特定的自动化技巧即使在疾病的早期阶段，也可以比目前的自动化方法以更高的准确度执行。

根据本公开的一些实施例，所公开的框架执行一种新颖的机器学习算法，该算法可以基于患者的外周血TCR组库预测癌症状态。如下文更详细讨论的，从正常量的血样(例如，3-10ml)开始，所公开的框架可以对白细胞的基因组DNA进行深度TCR测序，这使得能够与肿瘤抗原无关地检测(预测或确定)与癌症相关联的TCR。然后利用它来识别反映患者免疫组库的患者的“癌症分数”。该分数是自动化处理的输出，该自动化处理输出表示各种疾病中早期和晚期癌症的稳健生物标志物，并且预测患者对检查点封锁疗法的反应。因此，所确定的分数是患者是否患有癌症以及癌症程度的有力指标。

根据一个或多个实施例，本公开提供了用于利用外周血TCR组库诊断癌症状态的新颖框架的计算机化方法。根据一个或多个实施例，本公开提供了一种用于执行框架功能的上述技术步骤的非暂态计算机可读存储介质。该非暂态计算机可读存储介质在其上有形地存储或有形地编码有计算机可读指令，该指令在由设备执行时，使至少一个处理器执行用于利用外周血TCR组库诊断癌症状态的新颖且改进的框架的方法。

根据一个或多个实施例，提供了一种系统，该系统包括一个或多个计算设备，该计算设备被配置为提供根据这些实施例的功能。根据一个或多个实施例，功能实施在由至少一个计算设备执行的方法的步骤中。根据一个或多个实施例，由计算设备的(一个或多个)处理器执行以实现根据一个或多个此类实施例的功能的程序代码(或程序逻辑)实施在非暂态计算机可读介质中、由非暂态计算机可读介质实施和/或实施在非暂态计算机可读介质上。

附图说明

本公开的前述和其它目的、特征和优点将从以下对附图中所示的实施例的描述中变得明显，在附图中，在各个视图中，附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是强调图示本公开的原理：

图1是图示根据本公开的一些实施例的可以在其中实现本文公开的系统和方法的网络的示例的示意图；

图2是图示根据本公开的一些实施例的示例性系统的组件的框图；

图3A是图示根据本公开的一些实施例的所公开的系统和方法的示例数据流的示意图；

图3B图示了根据本公开的一些实施例的所选择特征的非限制性示例实施例；

图4描绘了图示根据本公开的一些实施例的所公开的系统和方法的非限制性数据流的示意图；

图5A、图5B和图5C图示了根据本公开的一些实施例的预测癌症相关性数据的非限制性示例；

图6图示了根据本公开的一些实施例的训练和测试数据的数据资源表；

图7图示了根据本公开的一些实施例的序列保守模式的非限制性示例；

图8图示了根据本公开的一些实施例的TCR的生化特征的非限制性示例；

图9图示了根据本公开的一些实施例的ROC曲线的非限制性示例；

图10图示了根据本公开的一些实施例的-6残基的3维位置变化的非限制性示例；

图11A、图11B和图11C图示了根据本公开的一些实施例的癌症分数和香农熵的性能评估的非限制性示例；

图12图示了根据本公开的一些实施例的预测癌症状态的非限制性示例；

图13A和图13B图示了根据本公开的一些实施例的癌症分数的随机波动的非限制性示例；以及

图14图示了根据本公开的一些实施例的癌症患者的癌症分数分布的非限制性示例。

具体实施方式

现在将在下文中参考附图更全面地描述本公开，附图形成本公开的一部分并且以非限制性说明的方式示出了某些示例实施例。但是，主题可以以各种不同的形式实施，因此，所涵盖或要求保护的主题旨在被解释为不限于本文阐述的任何示例实施例；提供示例实施例仅仅是为了说明。同样，要求保护或涵盖的主题的范围相当广泛。其中，例如，主题可以实施为方法、设备、组件或系统。因此，实施例可以例如采用硬件、软件、固件或其任何组合的形式(软件本身除外)。因此，下面的详细描述不应被理解为限制性的。

在整个说明书和权利要求中，术语可能具有超出明确陈述含义的上下文中暗示或隐含的细微含义。同样，如本文使用的短语“在一个实施例中”不一定指代相同的实施例，并且如本文使用的短语“在另一个实施例中”不一定指代不同的实施例。例如，所要求保护的主题旨在整体或部分地包括示例实施例的组合。

一般来说，术语可以至少部分地从上下文中的用法来理解。例如，如本文所用的诸如“和”、“或”或“和/或”之类的术语可以包括多种含义，其可以至少部分地取决于其中使用此类术语的上下文。通常，“或”如果用于关联列表，诸如A、B或C，那么旨在表示A、B和C，这里以包含的意义使用，以及A、B或C，这里以排除的意义使用。此外，如本文所用的至少部分地取决于上下文的术语“一个或多个”可以用于描述任何单一意义上的特征、结构或特性，或者可以用于描述复数意义上的特征、结构或特性的组合。类似地，诸如“一”或“该”的术语可以理解为表达单数用法或表达复数用法，至少部分地取决于上下文。此外，术语“基于”可以被理解为不一定旨在表示一组排他性的因素，而是可以允许存在不一定明确描述的附加因素，同样至少部分地取决于上下文。

下面参考方法和设备的框图和操作图示来描述本公开。应该理解的是，框图或操作图示的每个方框，以及框图或操作图示中的方框的组合可以通过模拟或数字硬件和计算机程序指令来实现。可以将这些计算机程序指令提供给通用计算机的处理器(以如本文中详述的改变其功能)、专用计算机、ASIC或其它可编程数据处理装置，使得经由计算机的处理器或其它可编程数据处理装置执行的指令实现框图或一个或多个操作方框中指定的功能/动作。在一些替代实现中，方框中标注的功能/动作可以不按照操作图示中标注的顺序发生。例如，取决于所涉及的功能/动作，连续显示的两个方框实际上可以基本上同时执行，或者这些方框有时可以以相反的顺序执行。

为了本公开的目的，非暂态计算机可读介质(或一个或多个计算机可读存储介质)存储计算机数据，该数据可以包括以机器可读形式的可由计算机执行的计算机程序代码(或计算机可执行指令)。作为示例而非限制，计算机可读介质可以包括用于数据的有形或固定存储的计算机可读存储介质，或用于包含代码的信号的瞬时解释的通信介质。如本文所使用的，计算机可读存储介质是指物理或有形存储(与信号相对)并且包括但不限于以任何方法或技术实现的用于诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据之类的信息的有形存储的易失性和非易失性、可移除和不可移除介质。计算机可读存储介质包括但不限于RAM、ROM、EPROM、EEPROM、闪存或其它固态存储器技术、CD-ROM、DVD或其它光存储、云存储、磁盒、磁带、磁盘存储装置或其它磁存储设备，或可以用于有形地存储期望信息或数据或指令并且可以由计算机或处理器访问的任何其它物理或材料介质。

出于本公开的目的，术语“服务器”应该理解为指提供处理、数据库和通信设施的服务点。作为示例而非限制，术语“服务器”可以指具有相关联通信和数据存储以及数据库设施的单个物理处理器，或者它可以指处理器和相关联网络和存储设备的联网或集群复合体，以及支持服务器提供的服务的操作软件和一个或多个数据库系统和应用软件。云服务器是示例。

出于本公开的目的，“网络”应该被理解为指可以耦合设备使得可以诸如在服务器和客户端设备或其它类型的设备之间，包括例如在经由无线网络耦合的无线设备之间交换通信的网络。网络还可以包括大容量存储，诸如例如网络附接存储(NAS)、存储区域网络(SAN)、内容交付网络(CDN)或其它形式的计算机或机器可读介质。网络可以包括互联网、一个或多个局域网(LAN)、一个或多个广域网(WAN)、有线类型连接、无线类型连接、蜂窝或其任何组合。同样，可能采用不同体系架构或者可能符合或兼容不同协议的子网也可以在更大的网络内互操作。

出于本公开的目的，“无线网络”应该理解为将客户端设备与网络耦合。无线网络可以采用独立的自组织网络、mesh网络、无线LAN(WLAN)网络、蜂窝网络等。无线网络还可以采用多种网络接入技术，包括Wi-Fi、长期演进(LTE)、WLAN、无线路由器(WR)mesh，或第2、第3、第4或第5代(2G、3G、4G或5G)蜂窝技术、蓝牙、802.11b/g/n等。网络接入技术可以为诸如例如具有不同移动性程度的客户端设备之类的设备实现广域覆盖。

简而言之，无线网络几乎可以包括任何类型的无线通信机制，通过这些机制，信号可以在诸如客户端设备或计算设备之类的设备之间、在网络之间或网络内等进行通信。

计算设备可以能够诸如经由有线或无线网络发送或接收信号、或者可以能够处理信号或者诸如在存储器中将信号存储为物理存储器状态，并且因此可以作为服务器操作。因此，能够作为服务器操作的设备可以包括例如专用机架式服务器、台式计算机、膝上型计算机、机顶盒、组合各种特征(诸如上述设备的两个或更多个特征)的集成设备等。

现在将参考各图更详细地描述某些实施例。一般而言，参考图1，示出了根据本公开的实施例的系统100。图1示出了可以在其中实践本文讨论的系统和方法的一般环境的组件。并非需要所有组件来实践本公开，并且可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下对组件的布置和类型进行改变。

如图所示，图1的系统100包括网络104，如上所述，其可以包括但不限于无线网络、局域网(LAN)、广域网(WAN)、互联网、或其组合。

网络104可以被配置为(一个或多个)设备102及其组件与另一个网络或设备。网络104可以被配置为还可以覆盖独立自组织网络等的各种无线子网，以为(一个或多个)设备102和服务器106-108提供面向基础设施的连接。网络104能够采用任何形式的计算机可读介质或网络来将信息从一个电子设备传送到另一个电子设备。

系统100还包括(一个或多个)设备102，其可以是(一个或多个)客户端设备。例如，客户端设备可以包括台式计算机或便携式设备，诸如蜂窝电话、智能电话、显示寻呼机、射频(RF)设备、红外线(IR)设备、近场通信(NFC)设备、个人数字助理(PDA)、掌上计算机、平板计算机、平板电话、膝上型计算机、机顶盒、可穿戴计算机、智能手表、组合各种特征(诸如上述设备的特征)的集成或分布式设备等。

(一个或多个)设备102还可以包括至少一个客户端应用，该客户端应用被配置为从另一个计算设备接收内容。(一个或多个)设备102可以通过网络104与其它设备或服务器通信，并且这样的通信可以包括发送和/或接收消息、生成和提供TCR数据、搜索、查看和/或共享TCR数据、或任何各种其它形式的通信。设备102可以能够处理信号或者诸如在存储器中将信号存储为物理存储器状态，并且因此可以作为服务器操作。

系统100还包括各种服务器，诸如内容服务器108、应用(或“应用(app)”)服务器106和数据库(用于本文执行的处理的数据存储)107。

应用服务器106和内容服务器108可以包括这样的设备，该设备包括经由网络向另一个设备提供和/或生成任何类型或形式的内容的配置。可以作为应用服务器106和/或内容服务器108操作的设备包括个人计算机台式计算机、多处理器系统、基于微处理器或可编程的消费电子器件、网络PC、服务器等。应该理解的是，服务器106和108可以存储与服务器106和108在相关联数据库107中提供的内容和服务相关的各种类型的数据。

在一些实施例中，用户(例如，患者、医生、技术人员等)能够访问由服务器106和108提供的服务。在非限制性示例中，这可以包括应用服务器、认证服务器、搜索服务器、交换服务器，经由网络104使用它们的(一个或多个)各种设备102。

因此，应用服务器106例如可以存储各种类型的应用和应用相关信息，包括应用数据和用户简档信息(例如，从处理400确定或依赖于处理400的信息，如下面所讨论的，例如)。

此外，虽然图1将服务器106和108分别图示为单个计算设备，但是本公开不限于此。例如，服务器106和/或108的一个或多个功能可以分布在一个或多个不同的计算设备上。此外，在一个实施例中，在不脱离本公开的范围的情况下，服务器106和/或108可以被集成到单个计算设备中。

图2是图示用于执行本文讨论的系统和方法的组件的框图。图2包括TCR引擎200、网络104和数据库107。引擎200可以是专用机器或处理器，并且可以由应用服务器、内容服务器、web服务器、第三方服务器、用户的计算设备等或其任何组合托管。

根据一些实施例，引擎200可以实施为在设备(例如，用户设备或系统/web连接的服务器/设备)上执行的独立应用。在一些实施例中，引擎200可以用作安装在设备上的应用，并且在一些实施例中，这种应用可以是设备通过网络访问的基于web的应用。在一些实施例中，引擎200可以作为扩充脚本、程序或应用(例如，插件或扩展)安装到另一个应用，诸如，例如，聚合和共享患者相关数据的医疗保健应用。

数据库107可以是任何类型的数据库或存储器，并且可以与网络上的服务器(例如，应用和内容服务器106和108)或用户的设备(例如，(一个或多个)设备102)相关联。数据库107包括与和用户、服务、应用、内容等相关的本地和/或网络信息相关联的数据和元数据的数据集。此类信息可以独立地和/或作为链接或相关联的数据集存储在数据库107中并编索引。如本文所讨论的，应该理解的是，数据库107中的数据(和元数据)可以是已知的或未知的任何类型的信息和类型，而不脱离本公开的范围。

根据一些实施例，数据库107可以存储用户的数据，例如，用户数据。根据一些实施例，存储的用户数据可以包括但不限于例如与患者的癌症诊断相关联的信息、患者的染色体信息、患者的DNA信息、患者的血液信息、患者人口统计信息、患者传记信息等，或其某种组合。

应该理解的是，数据库107中的数据(和元数据)可以是已知的或未知的与患者、医生、内容、设备、应用、服务提供商、内容提供商相关的任何类型的信息，而不脱离本公开的范围。

在一些实施例中，存储在数据库107中的数据可以例如使用256位加密进行加密，使得数据是私有的并且根据1996年健康保险流通与责任法案(HIPPA)进行控制。

数据库107可以将数据库107中的信息存储和编索引为数据和元数据的链接集合，其中数据和元数据的关系可以存储为n维向量。这种存储可以通过任何已知或未知的向量或数组存储来实现，包括但不限于散列树、队列、堆栈、VList，或任何其它类型的已知或未知的动态存储器分配技巧或技术。应该理解的是，可以应用任何已知的或未知的计算分析技术或算法，诸如但不限于，聚类分析、数据挖掘、贝叶斯网络分析、隐马尔可夫模型、人工神经网络分析、逻辑模型和/或树分析等，以确定、导出或以其它方式识别患者和/或医疗保健提供者的向量信息。

如以上所讨论的，参考图1，网络104可以是任何类型的网络，诸如但不限于，无线网络、局域网(LAN)、广域网(WAN)、互联网或其组合。网络315促进引擎200和存储资源数据库107的连接。实际上，如图2所示，引擎200和数据库107可以通过任何已知的或未知的连接和/或启用此类设备和资源之间的通信的方法直接连接。

包括根据本文的专用功能编程的硬件的主要处理器、服务器或设备组合为方便起见称为引擎200，并且包括样本模块202、AI模块204、免疫组库模块206和评分模块208。应该理解的是，本文讨论的(一个或多个)引擎和模块不是穷尽的，因为附加的或更少的引擎和/或模块(或子模块)可以适用于所讨论的系统和方法的实施例。下面将讨论每个模块的操作、配置和功能，以及它们在本公开的实施例中的作用。

本文描述的原理可以以许多不同的形式实施。对肿瘤抗原具有反应性的T细胞是癌症免疫的核心介质和免疫疗法的关键目标，但由于大多数癌症抗原是未知的，因此癌症相关联的T细胞的实验检测仍然困难。深度免疫组库测序(TCR-seq)技术的最新发展更加强调此类T细胞的识别，因为它可能为癌症患者的无创临床诊断、预后和纵向免疫监测开辟新的机会。

但是，人类免疫组库包含公共T细胞、幼稚T细胞和记忆/效应T细胞，这些细胞对多种抗原具有特异性，这种复杂性增加了常规系统无法解决的挑战—例如，识别TCR-seq数据中的癌症相关联的T细胞。

先前关于癌症患者TCR组库的研究报告说，简单的统计数据，诸如多样性和克隆性，在某些条件下与临床结果相关联，从而证实了组库数据作为潜在预后因素的效用。但是，随着免疫疗法的快速进步和TCR-seq数据的快速积累，需要更多的计算工具来弥合基础免疫基因组学研究和对癌症患者有益的临床应用之间的差距。

所公开的系统和方法通过执行集成机器学习软件(称为TCRboost)的新颖框架提供这些所需的工具，该软件使用β链TCR-seq数据提供癌症相关联的免疫组库的从头预测。

根据一些实施例，所公开的框架利用TRUST，即一种开源算法，用于使用概括来自实体组织的未选择的RNA-seq(核糖核酸序列)数据来调用TCR转录高变CDR3区(互补确定区3)。如本领域技术人员所理解的，TRUST已经在CDR3调用中实现了高灵敏度，即使对于具有低测序深度的样品，并且在其应用于大型肿瘤群组(tumor cohorts)中已经证明了效用。

虽然本文讨论的实施例的讨论将集中于利用TRUST算法/软件，但不应将其视为限制，因为所公开的框架可以利用任何已知的或未知的机器学习或人工智能(AI)技术、算法或机制，而不脱离初始公开的范围。

根据一些实施例，执行TRUST算法以分析涵盖预定数量(例如，32个)癌症类型的一组(例如，10,000个)TCGA(癌症基因组图谱)肿瘤样本；因此，收集/确定了许多非公开完整的生产性βCDR3序列(例如，43,000个非公开完整的生产性βCDR3序列)。这将在下面参考图3A和图4进行更详细的讨论。

根据一些实施例，称为CDR3的TRUST针对扩增克隆型富集，并且因此可能与肿瘤相关联。此外，由于βCDR3来自不同的癌症类型，因此它们不太可能偏向于少数癌症抗原。

转向图7和图8，图7图示了长度范围为12-16的癌症或非癌症相关联的CDR3之间的序列保守模式，其中针对保守模式分析了每个类别的CDR3氨基酸序列。

图8描绘了显示出与非癌症TCR的显著差异的癌症相关联的TCR的生化特征。对于长度为L的CDR3，在癌症和非癌症相关联的TCR之间比较了544x(L-5)个特征，并使用双边Wilcoxon秩和测试评估了统计显著性。作为对照，与癌症相关联的TCR被随机分成两组，在两组之间估计了每个特征的p值。在分位数-分位数(Q-Q)图(-log值)上将癌症与非癌症的p值与癌症与癌症的p值进行比较，其中对于所有CDR3长度，前者始终显著高于后者。

因此，虽然癌症或非癌症CDR3之间的序列保守模式没有明显差异(图7)，但观察到氨基酸指标的显著差异(图8)，这证明了癌症相关联的TCR的独特生化签名。

因此，源自TCGA数据的βCDR3序列可以作为癌症相关联的TCR的有效训练数据集。

根据一些实施例，该框架应用机器学习元算法，诸如例如自适应提升(AdaBoost)。如本领域技术人员所理解的，AdaBoost通过仅选择和训练已知提高模型预测能力的那些特征来降低训练和执行AI系统的分类器的速度，从而降低维数同时改善执行时间。

虽然本文讨论的一些实施例的讨论将集中于利用AdaBoost，但不应将其视为限制，因为所公开的框架可以利用任何已知或未知的机器学习或人工智能(AI)技巧、算法或机制，而不偏离初始公开的范围。即，如下文更详细讨论的(例如，参考图3A和图4)，除了AdaBoost之外或作为AdaBoost的替代，可以利用任何已知的或未知的类型或形式的机器学习/AI以类似的方式—诸如但不限于人工神经网络(ANN)、深度神经网络(DNN)、卷积神经网络(CNN)等来分析T细胞、血液或肿瘤样本/类型。

根据一些实施例，AdaBoost应用于训练集成树分类器以区分癌症相关联的TCR和非癌症相关联的TCR。在一些实施例中，对于长度＝12、13、14、15和16的CDR3，应用单独发生。使用交叉验证评估分类器在预测肿瘤反应性CDR3方面的性能。

如根据ROC(接收者操作者曲线)下的面积(AUROC)测量的，对于CDR3长度＝13(AUROC＝0.71)，预测能力最高。这在图9中进行了图示，其中描绘了测量具有不同长度的单个癌症相关联的CDR3的预测能力的ROC曲线。在四重交叉验证分析中，将每个CDR3长度的集成树分类器应用于测试数据。对于每个CDR3，分类器预测其与癌症相关联的概率。使用概率作为连续参数，生成ROC曲线，图中标有AUROC。具有最高分类能力的特征显示在CDR3环中的每个氨基酸位置，其中-6位置具有最高的命中数(如图3B所示和在下面讨论的)。

对所选择的TCR/pMHC结构的分析表明，该位置位于抗原、MHC-Iα1螺旋和TCRα链的交叉点。-6位置Cα的坐标在3D空间中的变化最小(如图10所示，其中使用HLA-A*02:01结合抗原和T细胞受体进行了分析)，指示其结构保守。这些结果表明，经过训练的AdaBoost分类器(和/或深度神经分类器)捕获了在TCR/pMHC相互作用中可能重要的生化签名。

对于给定的TCR组库数据，最丰富的克隆型被分组为高度特异性簇。然后将树分类器应用于每个聚集的CDR3以预测与癌症相关联的概率。结果汇总到范围从0到1的癌症分数中。与香农的熵不同，所公开的方法几乎不受测序深度的影响，使得不同研究之间的癌症分数估计直接具有可比性。这在图11A中进行了图示，该图描绘了子采样分析的结果，表明癌症分数对可变测序深度具有鲁棒性，其中熵随着深度的降低而单调减少。

作为非限制性示例，图示了所公开框架的准确性和效率，分析了16个独立的公共TCR-seq样本群组以系统地评估TCRboost的性能，如图6的表中所示。

图6提供了用于训练和测试目的的数据集的摘要。训练数据源自从TCGA样本的肿瘤RNA-seq数据中提取的TCR，以及文献中对非癌抗原特异的T细胞。测试数据来自公共领域的16个样本群组，并标有样本大小和发布的ID。*：对于卵巢癌群组，对来自5个患者的肿瘤进行多切片采样，每个TIL样本用作独立观察。

为了探索非癌症患者中的癌症分数的行为，将TCRboost应用于没有重大诊断疾病的健康供体群组，并将该群组的癌症分数用作基线。利用了来自4个群组非癌症状况的外周血单核细胞(PBMC)样本，其中包括慢性HCMV(人巨细胞病毒)感染、黄热病病毒疫苗接种、类风湿性关节炎和多发性硬化症。

如图5A所示，在FDR＝0.01时，上述群组的癌症分数均未显示出与基线的显著偏差。图5A图示了由箱线图显示的不同疾病和组织类型的癌症分数分布，其中原始数据叠加为透明的红点。x轴标签中括号中的数字是每个群组的样本大小。在每个群组和健康供体的分数之间进行双边Wilcoxon秩和测试，其中Benjamini-Hochberg校正的FDR水平显示在每个框的顶部。

然后将TCRboost应用于患有多种癌症类型(包括乳腺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤)的患者的PBMC或肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)组库。大多数群组的癌症分数显著高于健康供体(如图5A所示)，但肾癌由于样本大小小以及可能由于有限的T细胞浸润和在脑组织中减少的抗原呈现的递胶质母细胞瘤(GBM)除外。一般而言，TIL组库的癌症分数明显高于PBMC的癌症分数，这可能是因为与癌症相关联的T细胞在TIL中富含。这些结果表明，TCRboost预测分数在癌症样本中特别高，并且可以区分多种癌症类型的患者和健康个体。

因此，确定的癌症分数可以是癌症状态的单一预测因子。

作为非限制性示例，对于每个癌症群组，将分数与健康供体的分数混合，并生成ROC曲线以测量敏感性和特异性，如图5B所示。图5B图示了分别针对TIL样本(左)和PBMC样本(右)作为癌症状态的单一变量的测量癌症分数预测能力的ROC曲线。对于这两种组织类型，健康供体的PBMC组库被用作对照。每个群组的ROC曲线下的面积(AUROC)在图例的括号中被标记。肺(P)用于原发性肺肿瘤，并且肺(B)用于肺肿瘤脑转移。

对于TIL样本，对于具有足够样本大小(n≥3)的所有群组，癌症分数几乎达到完美的预测能力(AUROC≥0.95)。对于PBMC样本，乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌的预测能力高，黑色素瘤和膀胱癌的预测能力中等，GBM的预测能力低。重要的是，上述分析中的乳腺癌样本来自两个早期乳腺癌群组，并且可以观察到AUROC为0.99(99％)。在二次采样之后，熵也可以区分早期乳腺癌和健康供体，但预测能力要差得多(AUROC＝0.79)，如图11B和图11C所示。

图11B图示了从早期乳腺癌患者的PBMC组库样本计算的熵，其显著低于健康供体。在比较之前，两个群组都被下采样到10,000个读数。图11C图示了作为早期癌症预测因子的熵的性能比公开的癌症分数要差得多。

在截止值为0.75时，癌症分数达到80.0％的敏感性和81.4％的特异性。这种性能优于许多现有的癌症筛查方法。可以使用来自健康供体的PBMC样本的另一个对照群组重复该分析，如图12所示，可以观察到非常相似的ROC。

因此，基于高预测能力，癌症分数可以用于检测与癌症相关联的血液TCR组库。

所公开的适应性免疫组库是提供准确癌症分数的动态系统。虽然免疫组库随机波动，但健康供体的癌症分数不会与癌症患者一样高(例如，所公开的系统避免了癌症诊断假阳性的变化)。

例如，对来自健康供体的PBMC样本的癌症分数的随机波动进行了超过一年的评估。在检查的三个个体中，观察到分数的纵向变化相对较小(如图13A所示)，其中所有个体的标准偏差<0.04(如图13B所示，这是显示从每个个体的时间点计算出的标准偏差的条形图)。健康供者的平均分数为0.71，并且对于早期乳腺癌患者的平均分数为0.79，这比健康供者高2个标准偏差以上。因此，健康供体不太可能由于免疫组库的随机波动具有与癌症患者一样高的癌症分数，反之亦然。

癌症免疫治疗反应的预测目前具有重要的临床意义。图5C描绘了Kaplan-Meier曲线，其显示了用Ipilimumab治疗的具有BRAF突变的两组黑色素瘤患者之间的显著生存差异。结果较好的组在其治疗前PBMC样本中的癌症分数较低。使用控制患者年龄和香农熵的Cox比例风险模型评估P值。年龄或熵的P值不显著。

图5C描绘了来自接受免疫检查点阻断(ICB)治疗的两个患者群组的TCR-seq样本确定的癌症分数。有趣的是，对于接受Ipilimumab(一种抗CTLA4 mAb(单克隆抗体))治疗的具有BRAF突变的黑色素瘤患者，源自治疗前PBMC样本的较高癌症分数显著预测更差的结果。对第二群组进行了分析，研究对象是接受Ipilimumab治疗的转移性前列腺癌患者。

在第一个治疗周期后，PBMC样本中CD8+T细胞的癌症分数在响应者中显著高于进展者(如图14所示)。这些结果表明PBMC癌症分数可能有助于监测患者在抗CTLA4免疫治疗中的结果。

因此，总而言之，本公开提供了从肿瘤基因组测序数据中检测癌症相关联的TCR的新颖生化签名，其独立于肿瘤抗原以及患者HLA等位基因型。它在不同癌症类型的TCR-seq样本群组中可重复观察到。TCRboost聚合了组库中的许多TCR来估计癌症分数，这对于癌症患者来说明显更高，并且对随机波动具有鲁棒性，使其成为非侵入性诊断生物标志物的合法候选。

此外，由于癌症分数是从免疫系统预测的，因此它与基于癌症生物标志物、成像扫描或循环肿瘤细胞(CTC)/循环肿瘤DNA(ctDNA)的大多数现代检测方法是正交的。因此，癌症分数提供了鲁棒的预测—例如，它们是有效的并且可以承受和解释TCR组库随时间的随机波动，从而提供患者是否患有癌症以及他/她的癌症状态的准确指示(例如，什么程度的癌症)。

因此，在现有方法上随机使用癌症分数有望提高癌症检测的准确度并改善临床决策。由于源自某些晚期癌症的癌症分数与患者对ICB的反应相关联，因此它还可以用于改善对这些癌症类型的临床结果的预测。本领域技术人员将理解和预期TCRboost在癌症诊断和免疫治疗预后中的广泛效用，以及临床研究中快速积累的TCR组库测序数据。

转向图3A，提供了TCRboost方法的实施例的示意图。具体而言，图3A描绘了本文讨论的TCRboost处理的一般工作流程，图4提供了每个步骤的细节(下面将更详细地讨论)。

在一些实施例中，如上文所讨论的，从未选择的肿瘤RNA-seq数据(步骤302)或从实验确定的对各种非癌抗原特异的TCR(步骤304)训练CDR3。根据一些实施例，这样的训练是经由TRUST算法—步骤306来执行的。因此，步骤302导致癌症相关联的CDR3的确定(步骤308)，并且步骤304导致非癌症CDR3的确定(步骤310)。CDR3区域的特征被定义为每个感兴趣位置的氨基酸指标(步骤312)，并且然后使用AdaBoost算法(或其它监督机器学习方法，包括深度神经网络模型)针对不同长度的CDR3训练集成树分类器)，如上文和下文更详细讨论的。步骤314-316。每个TCR-seq样本都经过预处理(步骤318)，并通过免疫相似测量(iSMART)聚类(步骤320)以识别抗原特异性组(步骤322)。然后将训练的树分类器(例如，从步骤314训练的)应用于分组的CDR3以评估与与癌症相关联的免疫组库的概率相关的癌症分数(步骤324)。

iSmart涉及执行CDR3序列的成对比对，然后基于比对确定分数。然后，基于“高”比对分数(例如，高于预定阈值的分数)构建CDR3序列的连接矩阵，然后基于此确定和形成CDR3簇。因此，iSmart(以及类似的算法，如下面所讨论的)可以将TCR分组为抗原特异性簇。

本领域技术人员将理解，虽然本文的公开内容在图3A中参考了iSMART的使用，但它不应该被视为限制性的，因为任何已知或未知形式的马尔可夫、半马尔可夫决策或强化学习(RL)处理、算法、技术可以被所公开的框架采用，而不脱离所公开的系统和方法的范围。

图3B图示了长度从12到16个氨基酸不等的CDR3序列的位置。对于每个长度，选择了最重要的分类特征并将其显示在对应的位置上(如下面关于图2所讨论的)。每个位置由带阴影的正方形表示，非阴影(例如，无阴影)表示分析中未覆盖的位置，浅灰色表示已分析但未发现重要特征，深灰色表示在分类中具有重要特征的位置。

转向图4，处理400提供了本文讨论的TCRboost方法的详细视图。根据一些实施例，处理400提供了一种基于免疫的癌症检测方法，该方法可以从外周免疫组库的签名中检测癌症信号，即使在疾病的早期阶段也可以高准确度地执行该方法。采用改进的框架，其通过新颖的机器学习算法实施，该算法可以基于患者的外周血TCR组库预测癌症状态，使得对白血细胞的基因组DNA进行深度TCR测序，从而使得能够与肿瘤抗原无关地进行与癌症相关联的TCR的检测(预测或确定)。这在各种疾病中为早期和晚期癌症提供了鲁棒的生物标志物。

根据图4的处理400的一些实施例，处理400的步骤402由引擎200的样本模块202执行；步骤404-408由AI模块204执行；步骤410由免疫组库模块206执行；并且步骤412由评分模块208执行。

处理400开始于步骤402，其中识别一组样本数据，如上文关于图3A的步骤302-304所讨论的。在一些实施例中，可以从GDC遗留档案中下载通过MapSplice与hg19人类参考基因组比对以用于肿瘤基因表达的TCGA 2级BAM文件，并由TRUST处理以提取TCR CDR3序列。其它经过验证的方法也可以用于生成与真阳性癌症相关联的TCR。在一些实施例中，还可以从例如VDJdb或从公共领域的健康供体的血液TCR-seq数据下载对非癌抗原特异的TCR组库。在一些实施例中，可以从AdaptiveBiotechnology ImmuneAccess在线数据库下载来自14个研究群组(参见图4)的TCR组库测序数据。

在步骤404中，将TRUST算法应用于这些识别出的样本以确定癌症和非癌症CDR3，如上文关于图3A的步骤306-310所讨论的。根据一些实施例，可以从来自可变基因的最后一个半胱氨酸(C)和连接基因中的FGXG基序中的苯丙氨酸(F)开始，过滤TCGA导出的CDR3以获得完整序列。可以排除在C和F之间包含终止密码子的非生产性序列。为了去除在非癌症个体中也发现的公共TCR，PBMC组库样本的群组中最丰富的CDR3(例如，满足阈值的CDR3—例如，来自666个健康或HCMV感染患者的前5,000个)可以从集合中收集和过滤掉。结果得到的CDR3序列(例如，43,000个CDR3)预期是非公开的且与癌症相关联的。

在步骤406中，识别一组氨基酸指标，如上文关于图3A的步骤312所讨论的。当前的氨基酸指标数据库记录了544个生化指标，其可以用作氨基酸功能和结构影响的替代物。从上述非公开的癌症相关联的数据中，选择长度L在12到16个氨基酸(AA)之间的CDR3序列，去除前2个和最后3个AA，而不与pMHC复合物结构接触。总特征集是每个信息AA的并集，例如，特征数量为(L-5)×544。n

在步骤408中，训练AI算法(AdaBoost或深度学习)，如上文关于图3A的步骤314所讨论的。根据一些实施例，来自两个群体(来自步骤202)的所有序列的前50％被二次采样，并且剩余的一半数据用于交叉验证。对于每个特征，将0.5n

在上述设置中，共有0.5×(n

因此，根据一些实施例，可以应用AdaBoost，如以上所讨论的，AdaBoost是一种能够将弱分类器聚合为更强分类器的集成学习方法。

在AdaBoost实施例下，AI模型204训练使用R包JOUSBoost中的adaboost()函数完成，其中推进(boosting)为50轮并且树深为10。所选择的参数基于最小化训练周期数(轮)和分类树的复杂度(深度)同时最小化交叉验证(CV)误差的标准。CV误差是通过将经训练的CDR3长度L(表示为T

例如，可以执行10轮子采样，然后选择最佳交叉验证值。对L＝12、13、15和16，除了L＝14，重复上述过程，其中应用了四倍交叉验证，因为此设置实现了更小的CV误差。因此，在一些实施例中，步骤408可以涉及总共5个分类器的训练，根据该示例，其表示为T

根据一些实施例，所公开的框架可以将AI模块204训练为深度神经网络，而不是利用AdaBoost。根据一些实施例，例如，所公开的深度学习方法采用CNN(但是，不应该被解释为将本公开限制为仅使用CNN，因为任何已知或未知的深度学习体系架构或算法都适用于本文讨论的所公开的系统和方法)。CNN由多个层组成，如本领域技术人员所理解的，其可以包括：卷积层、整流线性单元(ReLU)层、池化层、失落(dropout)层和损失层。当用于CDR3发现、识别和相似性时，CNN通过分析可以用于训练(一个或多个)分类器的小部分样本/训练数据来产生多层深度特征集合。

因此，根据这些实施例，经由步骤408(和图3A的步骤314)的神经网络实现可以提供更高效、更准确的系统，该系统以与元算法类似的方式利用深度置信网络的处理能力和资源消耗，如以上所讨论的。因此，例如，本领域技术人员将理解，可以利用神经网络来训练树分类器T

在步骤410中，免疫组库数据被预处理，如上文关于图3A的步骤318-322所讨论的。免疫组库测序数据通常包含CDR3区的DNA和氨基酸序列、TCR可变基因、连接基因，有时还包含某些调用者解析的多样性基因，以及数据中T细胞克隆型(自CDR3起)的频率。在一些实施例中，所有TCR-seq数据均由AdaptiveBiotechnology ImmunoAnalyzer生成，并且专注于由此类处理生成的格式的预处理步骤，但是本领域技术人员将理解基本原理对于其它文件格式也是如此。

在一些实施例中，可以去除对CDR3 AA序列的以下类型的低质量调用：1)序列长度<10或>24；2)序列包含非标准字符(*、+、X)；3)序列不是从C开始或不是以F结尾；4)可变基因未解决。在去除低质量调用后，剩余的CDR3按克隆型频率递减排序，并且选择以下列进行聚类分析：CDR3氨基酸、可变基因和克隆型频率。对于每个组库数据，选择预定数量的满足阈值的序列(例如，选择前10,000个序列)。如果数据包含的CDR3少于10,000个，那么将全部选择。截止值被设置为包括可能是效应/记忆细胞的大多数高丰度克隆型，同时排除低频幼稚细胞。包含过多数量的幼稚细胞将导致噪音水平增加，因为幼稚T细胞在健康个体中可能具有肿瘤特异性(灭活)。

先前开发的软件解决方案iSMART被配置为通过基于其序列相似性对CDR3进行聚类来检测抗原特异性T细胞群。抗原特异性基于最近对具有相似CDR3基序的T细胞可能识别相同抗原的研究。iSMART显示出比以前的方法具有更高的特异性，使用针对不同抗原的TCR序列进行基准测试。因此，iSMART被应用于预处理的TCR组库序列数据。聚类使用CDR3序列和可变基因信息来确保高特异性。因此，预期每个产生的CDR3簇都负责独特的抗原。

在步骤412中，进行癌症分数的确定(或计算)，如上面图3A的步骤324中所讨论的。根据一些实施例，树分类器T

根据一些实施例，TCR簇可能包含几个具有相同序列的CDR3。这是由于DNA向蛋白质的简并性，其中选择不同的TCR来拮抗相同的抗原。它们仍被计为不同的TCR样本。

此外，不同的簇可能具有可变的大小，例如，TCR的数量。因此，可以计算每个TCR的分数，而不管它属于哪个簇。

在一些实施例中，如果组库不包含足够的数据，例如，缺少具有特定长度的成簇CDR3，那么在最终分数中报告NA。这种情况通常发生在TIL样本中，其中很少T细胞被收集用于测序。对于具有深度覆盖的PBMC组库，通常有足够的数据进行估计。

从分类树中选择代表性特征

根据一些实施例，每个分类器包含预定数量(例如，50个)分类和回归树(CART)。每个CART都是二叉决策树，其中每个节点处都有特定特征的经训练的阈值。为了评估哪个(些)特征在分类中是重要的，利用了偏差的减少，这是分类错误的度量。例如，对于每个树，选择偏差减少≥0.002的特征。池化从50个树中选择的所有特征，可以对每个循环特征的频率进行计数。例如，具有前10个频率计数的特征被选择显示在图1B中。

TCR/pMHC蛋白复合物结构数据分析

2018年9月12日从rcsb.org下载了用于包含HLA-A2等位基因的结构的128个pdb文件。分析HLA-A2等位基因是因为它拥有放置在PDB上的最大的样本量。去除了既不含TCR又不含抗原肽的结构。对于剩余的30个结构中的每一个，使用了HLA重链第151位组氨酸的Cα坐标作为原点。该分析基于实验观察，即当与不同TCR和抗原肽结合时，HLA重链的结构会稳定化。识别了位于相对于位于CDR3序列末端的苯丙氨酸的-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10位置的β链CDR3氨基酸的Cα坐标。计算了所有结构的原点和每个CDR3 Cα位置之间的欧几里德距离。然后计算并显示了每个位置的距离标准偏差。使用嵌合体和PyMol对β链CDR3区的-6位置的选定PDB结构进行可视化。

根据TCR组库数据和ROC分析对癌症分数进行后处理

由于每个群组的TCR-seq样本的设计不同，因此应用了一种共识方法来选择PBMC和TIL样本以最大化可比性。如图4中所示，Emerson等人在2015年的黄热病病毒群组具有对健康志愿者接种后第1天和第14天的样本，并使用了第14天的样本，因为预计它们与健康供体的差异更大。全血的PBMC样本用于类风湿性关节炎和多发性硬化症患者。

对于具有纵向采样的癌症群组，包括Page等人，2016年、Tumeh等人，2014年、Robert等人，2014年和Snyder等人，2017年(来自图4)，使用了TIL或PBMC样本，它们或者经受预处理，或者如果没有预处理样本可用，那么使用处理后的第一个周期。在分析中合并了来自两个早期乳腺癌群组的样本(Page等人，2016年和Beausang等人，2017年)。

计算了每个患病群组和健康供体之间癌症分数值的中值差异，并使用Wilcoxon秩和测试进行了评估的统计显著性测定；并且，经由Benjamini-Hochberg(BH)过程使用了校正的p值，其中截止错误发现率(FDR)＝0.01表示显著性。为了评估癌症分数的预测能力，将样本大小大于或等于预定数量(例如，n≥5)的每个群组的分数与健康供体池化，并使用R包pROC中的函数roc()计算曲线下面积并制作ROC图。

使用香农熵对癌症状态进行子采样和预测

为了探索读取深度对癌症分数和香农熵的估计的影响，进行了经由电脑的(insilico)二次采样分析。在一些实施例中，从666个健康或HCMV感染的个体中随机采样100个个体。对于每个TCR-seq数据，执行上述相同的预处理过程以去除非生产性、低质量的CDR3调用。过滤后的数据包含每个CDR3 i的读取计数(n

G的行数是过滤后的数据中所有读取计数的总和。可以对G的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的行进行采样，其中每行表示测序读数。即，在TCR组库测序中，一个读数足以覆盖一个CDR3区域。因此，可以使用测序读取计数作为每个克隆型的CDR3计数。对于每个子采样数据，可以重新计算每个CDR3的频率，从而生成更小的TCR-seq数据集，并降低测序深度。香农的熵是使用该数据集估计的，同时可以选择满足大多数频率克隆型数量(例如，前10,000个)的最高阈值来估计癌症分数。每个测序深度(由采样率表示)之间的分数与完整数据集的分数的差异然后显示为图9A中的箱线图。

香农的熵也有一定的统计能力来区分与癌症患者相关联的免疫组库和健康个体的免疫组库。因此，研究了熵是否也可以用作早期癌症发病的预测因子。由于熵受到测序深度的系统性偏差，因此使用上述方法将早期乳腺癌和健康供体的所有PBMC TCR组库数据下采样到10,000个读数。计算了每个下采样文件的熵，并在乳腺癌和健康个体之间进行比较。以与癌症分数相同的方式进行双样本测试和ROC分析。香农的熵是使用R包熵计算的。

统计分析

所有统计分析均使用R统计编程语言执行。使用两侧Wilcoxon秩和测试执行双样本测试。如果对单个分析执行多项测试，那么BH过程可以用于校正FDR(图5除外)，因为目的是比较p值的分布，而不是报告显著性。对于图中显示的所有箱线图，中间线定义了中值，方框的边界指示数据的25％(Q1)和75％(Q3)四分位数。下须和上须对应于Q1-1.5IQR和Q3+1.5IQR，其中IQR是四分位数间距的缩写。图3C中的生存分析是使用R包生存进行的，其中p值是使用针对患者年龄校正的Cox比例风险模型评估的。

出于本公开的目的，模块是执行或促进本文所述的处理、特征和/或功能的软件、硬件或固件(或其组合)系统、处理或功能或其组件(有或没有人类交互或增强)。模块可以包括子模块。模块的软件组件可以存储在计算机可读介质上以供处理器执行。模块可以集成到一个或多个服务器，或者由一个或多个服务器加载和执行。一个或多个模块可以被分组成引擎或应用。

本领域技术人员将认识到，本公开的方法和系统可以以多种方式实现并且因此不受前述示例性实施例和示例的限制。换句话说，在硬件和软件或固件的各种组合中，由单个或多个组件执行的功能元素以及各个功能可以分布在客户端级别或服务器级别或两者的软件应用中。在这点上，本文描述的不同实施例的任何数量的特征可以组合成单个或多个实施例，并且具有少于或多于本文描述的所有特征的替代实施例是可能的。

功能也可以以现在已知或未知的方式全部或部分地分布在多个组件中。因此，在实现本文描述的功能、特征、接口和偏好方面，无数的软件/硬件/固件组合是可能的。此外，本公开的范围涵盖用于执行所描述的特征和功能以及接口的常规已知方式，以及可以对本文描述的硬件或软件或固件组件进行的那些变化和修改，如本领域技术人员现在和以后所理解的。

此外，在本公开中作为流程图呈现和描述的方法的实施例是通过示例的方式提供的，以便提供对技术的更完整的理解。所公开的方法不限于本文呈现的操作和逻辑流程。设想了替代实施例，其中各种操作的顺序被改变并且其中被描述为更大操作的一部分的子操作被独立地执行。

虽然出于本公开的目的已经描述了各种实施例，但是不应该认为这样的实施例将本公开的教导限制于那些实施例。可以对上述元素和操作进行各种改变和修改以获得保持在本公开中描述的系统和处理的范围内的结果。