辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用

摘要

本发明公开了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。该病毒颗粒在体外可感染多种细胞，感染后可复制增殖，并且能在鼠脑神经环路进行顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。

背景技术

在中枢神经系统中拥有非常多不同类型的神经元，它们的树突及轴突共同组成了复杂的神经网络。这些复杂的神经网络，能够使机体进行正常的生理活动，如学习、认知、记忆、恐惧等。神经网络出现异常也会造成相应的神经疾病，如帕金森、老年痴呆和自闭症等。解析大脑神经环路是更加深入了解大脑功能及神经疾病的基础，而病毒示踪工具能够帮助解析大脑神经环路。因此，病毒示踪工具的开发为绘制大脑连接图谱提供了更多的选择。

辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)属于披膜病毒科、甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb，共编码5个结构蛋白(capsid、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)。辛德毕斯病毒在自然界中主要是通过蚊虫叮咬在脊椎动物，如鸟类、哺乳动物中进行传播，具有广泛的宿主范围，包括人、鼠、猴等，能够感染神经系统。这种感染特性可以使其成为介导外源基因到宿主体内的载体。另外，辛德毕斯病毒感染脑神经系统的特性使其具备解析神经环路的能力。但是因为存在一系列工艺和技术改造方面的问题，所以目前其还没有应用到解析大小鼠神经环路和灵长类神经环路的标记上。目前辛德毕斯病毒颗粒的获取方法多为先体外转录，然后用RNA转染细胞，利用细胞产生出辛德毕斯病毒颗粒，步骤繁琐，操作复杂，目前亟需一种可以快速简单获得辛德毕斯病毒颗粒的载体和方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。

本发明提供一种辛德毕斯病毒载体，所述辛德毕斯病毒载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有荧光蛋白基因EGFP；所述辛德毕斯病毒载体上依次连接有启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR；所述辛德毕斯病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述启动子为UBC启动子。

本发明还提供一种制备辛德毕斯病毒颗粒的方法，使用所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞。

进一步的，所述细胞为BHK-21细胞或神经元细胞。

本发明还提供一种辛德毕斯病毒颗粒，由所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞后制备得到。

本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在顺向跨多级突触传播中的应用。

本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在非人灵长类神经细胞的标记和神经环路示踪中的应用。

本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在研究神经科学问题中的应用。

进一步的，所述神经科学问题包括但不限于以下：

药物抑制病毒作用机制、病毒复制和致病机制的分析。

本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在制备标记神经元药物中的应用。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷的表达外源蛋白的辛德毕斯病毒系统，无需体外转录和RNA转染细胞的步骤，直接用本发明的辛德毕斯病毒载体转染细胞即可，节省时间和操作步骤。该系统制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。

2.本发明对于开展在体标记神经元、解析神经环路具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、非人灵长类神经细胞的标记、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装和致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在24小时内快速标记鼠神经细胞。

4.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好的用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。辛德毕斯病毒能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的辛德毕斯病毒载体的构建示意图。

图2为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体转染后荧光表达示意图。

图3为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒感染原代培养的神经元细胞及BHK-21细胞。

图4为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在小鼠视网膜进行注射后的标记情况。

图5为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑内标记外侧膝状体后顺向跨突触传播。

图6为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑上丘的神经环路标记。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1

本发明的辛德毕斯病毒载体，通过下述步骤制备得到：

SINV-WT(结构如图1A和1D所示)和SINV-EGFP(结构如图1B和1C所示)均由UBC启动子启动病毒结构蛋白及非结构蛋白的转录和翻译，完成病毒的包装。使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物扩增片段扩增UBC启动子SEQ ID NO.4，由SacI和PacI插入载体中。使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物扩增EGFP基因片段SEQ ID NO.7，EGFP基因由SINV载体上第二个病毒亚基因组启动子(26S)启动，使用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示引物扩增26S，并与EGFP基因融合在一段DNA片段中(即为SEQ ID NO.10)，经由ApaI和NotI插入载体中。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用SacI和PacI酶切pTE-3'2J载体(Hahn,C,S,et al.Infectious Sindbisvirus transient expression vectors for studying antigen processing andpresentation.Proceedings of the National Academy of Sciences,1992,89(7):2679-2683)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO.4片段插入到pTE-3'2J，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSINV-WT。使用ApaI和NotI酶切pSINV-WT，采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ IDNO.10片段插入到pSINV-WT，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSINV-EGFP，其序列如SEQ ID NO.1所示。

图1为本实施例的辛德毕斯病毒载体的构建示意图。图1A为不携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体pSINV-WT的构建示意图；图1B为携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体pSINV-EGFP的构建示意图。图1C为pSINV-EGFP的载体结构图。图1D为pSINV-WT的载体结构图。图中可见pSINV-EGFP载体上依次连接有启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR。构建完成的辛德毕斯病毒载体pSINV-EGFP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。NSP1～4、C、E3、E2、6K和E1均为辛德毕斯病毒蛋白。

实施例2

本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体转染后荧光表达情况及一步生长曲线：

用质粒提取试剂盒提取实施例1的SINV-EGFP质粒后，利用lipofectamine 2000转染BHK-21细胞，37℃，5％(v/v)CO

实施例3

实施例2制备的辛德毕斯病毒颗粒感染体外培养的多种细胞，并可在细胞中进行复制传播：

分别在BHK-21细胞和原代培养的神经元细胞中感染实施例2收集的病毒上清，取5μl转染后2天的上清感染原代培养的神经元细胞和BHK-21细胞，在感染后1天(24小时)观察绿色荧光的表达情况。结果如图3所示，图3A为原代培养的神经元细胞，图3B为BHK-21细胞。实施例2已经证明本发明的辛德毕斯病毒载体能够转染BHK-21细胞生产辛德毕斯病毒颗粒，因此图3B的结果可以作为阳性对照。图3B中BHK-21细胞均被辛德毕斯病毒感染并表达绿色荧光，进一步验证了上述辛德毕斯病毒可以感染BHK-21细胞，并在其中进行复制。图3A中原代神经元细胞也均被病毒感染，且表达大量绿色荧光蛋白，表明辛德毕斯病毒具有感染神经元的能力，可以运用于体内的神经环路标记，且本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在24小时内快速标记鼠神经细胞。

实施例4

携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在小鼠视网膜进行注射后的标记情况：

取2μl辛德毕斯病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3×10

实施例5

本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑内标记外侧膝状体后顺向跨突触传播：

取150nl的辛德毕斯病毒颗粒(病毒滴度是3×10

实施例6

本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑上丘的神经环路标记：

取150nl的辛德毕斯病毒颗粒(病毒滴度是3×10

由于辛德毕斯病毒载体的高表达特性，可以应用在生物医学的多个领域。利用辛德毕斯载体作为疫苗载体传递抗原表位，以激活机体的免疫性应答；利用其高表达特性，携带一些特殊的细胞因子，如白细胞介素7、白细胞介素12、干扰素β等，可用于制备标记神经元的药物和发展基于辛德毕斯病毒的基因治疗。

综合以上实施例，本发明提供了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用SEQ ID NO.1所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。该病毒感染后可复制增殖，在体外可感染多种细胞，并且能在鼠脑神经环路进行顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1

ATTGACGGCGTAGTACACACTATTGAATCAAACAGCCGACCAATTGCACTACCATCACAATGGAGAAGCCAGTAGTAAACGTAGACGTAGACCCCCAGAGTCCGTTTGTCGTGCAACTGCAAAAAAGCTTCCCGCAATTTGAGGTAGTAGCACAGCAGGTCACTCCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCCAGTAAACTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATCTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCAGTATCATTGTGTCTGCCCCATGCGTAGTCCAGAAGACCCGGACCGCATGATGAAATATGCCAGTAAACTGGCGGAAAAAGCGTGCAAGATTACAAACAAGAACTTGCATGAGAAGATTAAGGATCTCCGGACCGTACTTGATACGCCGGATGCTGAAACACCATCGCTCTGCTTTCACAACGATGTTACCTGCAACATGCGTGCCGAATATTCCGTCATGCAGGACGTGTATATCAACGCTCCCGGAACTATCTATCATCAGGCTATGAAAGGCGTGCGGACCCTGTACTGGATTGGCTTCGACACCACCCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGTTCGTACCCTGCGTACAACACCAACTGGGCCGACGAGAAAGTCCTTGAAGCGCGTAACATCGGACTTTGCAGCACAAAGCTGAGTGAAGGTAGGACAGGAAAATTGTCGATAATGAGGAAGAAGGAGTTGAAGCCCGGGTCGCGGGTTTATTTCTCCGTAGGATCGACACTTTATCCAGAACACAGAGCCAGCTTGCAGAGCTGGCATCTTCCATCGGTGTTCCACTTGAATGGAAAGCAGTCGTACACTTGCCGCTGTGATACAGTGGTGAGTTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAAATCACCATCAGTCCCGGGATCACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACACACAATAGCGAGGGCTTCTTGCTATGCAAAGTTACTGACACAGTAAAAGGAGAACGGGTATCGTTCCCTGTGTGCACGTACATCCCGGCCACCATATGCGATCAGATGACTGGTATAATGGCCACGGATATATCACCTGACGATGCACAAAAACTTCTGGTTGGGCTCAACCAGCGAATTGTCATTAACGGTAGGACTAACAGGAACACCAACACCATGCAAAATTACCTTCTGCCGATCATAGCACAAGGGTTCAGCAAATGGGCTAAGGAGCGCAAGGATGATCTTGATAACGAGAAAATGCTGGGTACTAGAGAACGCAAGCTTACGTATGGCTGCTTGTGGGCGTTTCGCACTAAGAAAGTACATTCGTTTTATCGCCCACCTGGAACGCAGACCTGCGTAAAAGTCCCAGCCTCTTTTAGCGCTTTTCCCATGTCGTCCGTATGGACGACCTCTTTGCCCATGTCGCTGAGGCAGAAATTGAAACTGGCATTGCAACCAAAGAAGGAGGAAAAACTGCTGCAGGTCTCGGAGGAATTAGTCATGGAGGCCAAGGCTGCTTTTGAGGATGCTCAGGAGGAAGCCAGAGCGGAGAAGCTCCGAGAAGCACTTCCACCATTAGTGGCAGACAAAGGCATCGAGGCAGCCGCAGAAGTTGTCTGCGAAGTGGAGGGGCTCCAGGCGGACATCGGAGCAGCATTAGTTGAAACCCCGCGCGGTCACGTAAGGATAATACCTCAAGCAAATGACCGTATGATCGGACAGTATATCGTTGTCTCGCCAAACTCTGTGCTGAAGAATGCCAAACTCGCACCAGCGCACCCGCTAGCAGATCAGGTTAAGATCATAACACACTCCGGAAGATCAGGAAGGTACGCGGTCGAACCATACGACGCTAAAGTACTGATGCCAGCAGGAGGTGCCGTACCATGGCCAGAATTCCTAGCACTGAGTGAGAGCGCCACGTTAGTGTACAACGAAAGAGAGTTTGTGAACCGCAAACTATACCACATTGCCATGCATGGCCCCGCCAAGAATACAGAAGAGGAGCAGTACAAGGTTACAAAGGCAGAGCTTGCAGAAACAGAGTACGTGTTTGACGTGGACAAGAAGCGTTGCGTTAAGAAGGAAGAAGCCTCAGGTCTGGTCCTCTCGGGAGAACTGACCAACCCTCCCTATCATGAGCTAGCTCTGGAGGGACTGAAGACCCGACCTGCGGTCCCGTACAAGGTCGAAACAATAGGAGTGATAGGCACACCGGGGTCGGGCAAGTCAGCTATTATCAAGTCAACTGTCACGGCACGAGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAAGAAAATTGTCGCGAAATTGAGGCCGACGTGCTAAGACTGAGGGGTATGCAGATTACGTCGAAGACAGTAGATTCGGTTATGCTCAACGGATGCCACAAAGCCGTAGAAGTGCTGTACGTTGACGAAGCGTTCGCGTGCCACGCAGGAGCACTACTTGCCTTGATTGCTATCGTCAGGCCCCGCAAGAAGGTAGTACTATGCGGAGACCCCATGCAATGCGGATTCTTCAACATGATGCAACTAAAGGTACATTTCAATCACCCTGAAAAAGACATATGCACCAAGACATTCTACAAGTATATCTCCCGGCGTTGCACACAGCCAGTTACAGCTATTGTATCGACACTGCATTACGATGGAAAGATGAAAACCACGAACCCGTGCAAGAAGAACATTGAAATCGATATTACAGGGGCCACAAAGCCGAAGCCAGGGGATATCATCCTGACATGTTTCCGCGGGTGGGTTAAGCAATTGCAAATCGACTATCCCGGACATGAAGTAATGACAGCCGCGGCCTCACAAGGGCTAACCAGAAAAGGAGTGTATGCCGTCCGGCAAAAAGTCAATGAAAACCCACTGTACGCGATCACATCAGAGCATGTGAACGTGTTGCTCACCCGCACTGAGGACAGGCTAGTGTGGAAAACCTTGCAGGGCGACCCATGGATTAAGCAGCCCACTAACATACCTAAAGGAAACTTTCAGGCTACTATAGAGGACTGGGAAGCTGAACACAAGGGAATAATTGCTGCAATAAACAGCCCCACTCCCCGTGCCAATCCGTTCAGCTGCAAGACCAACGTTTGCTGGGCGAAAGCATTGGAACCGATACTAGCCACGGCCGGTATCGTACTTACCGGTTGCCAGTGGAGCGAACTGTTCCCACAGTTTGCGGATGACAAACCACATTCGGCCATTTACGCCTTAGACGTAATTTGCATTAAGTTTTTCGGCATGGACTTGACAAGCGGACTGTTTTCTAAACAGAGCATCCCACTAACGTACCATCCCGCCGATTCAGCGAGGCCGGTAGCTCATTGGGACAACAGCCCAGGAACCCGCAAGTATGGGTACGATCACGCCATTGCCGCCGAACTCTCCCGTAGATTTCCGGTGTTCCAGCTAGCTGGGAAGGGCACACAACTTGATTTGCAGACGGGGAGAACCAGAGTTATCTCTGCACAGCATAACCTGGTCCCGGTGAACCGCAATCTTCCTCACGCCTTAGTCCCCGAGTACAAGGAGAAGCAACCCGGCCCGGTCGAAAAATTCTTGAACCAGTTCAAACACCACTCAGTACTTGTGGTATCAGAGGAAAAAATTGAAGCTCCCCGTAAGAGAATCGAATGGATCGCCCCGATTGGCATAGCCGGTGCAGATAAGAACTACAACCTGGCTTTCGGGTTTCCGCCGCAGGCACGGTACGACCTGGTGTTCATCAACATTGGAACTAAATACAGAAACCACCACTTTCAGCAGTGCGAAGACCATGCGGCGACCTTAAAAACCCTTTCGCGTTCGGCCCTGAATTGCCTTAACCCAGGAGGCACCCTCGTGGTGAAGTCCTATGGCTACGCCGACCGCAACAGTGAGGACGTAGTCACCGCTCTTGCCAGAAAGTTTGTCAGGGTGTCTGCAGCGAGACCAGATTGTGTCTCAAGCAATACAGAAATGTACCTGATTTTCCGACAACTAGACAACAGCCGTACACGGCAATTCACCCCGCACCATCTGAATTGCGTGATTTCGTCCGTGTATGAGGGTACAAGAGATGGAGTTGGAGCCGCGCCGTCATACCGCACCAAAAGGGAGAATATTGCTGACTGTCAAGAGGAAGCAGTTGTCAACGCAGCCAATCCGCTGGGTAGACCAGGCGAAGGAGTCTGCCGTGCCATCTATAAACGTTGGCCGACCAGTTTTACCGATTCAGCCACGGAGACAGGCACCGCAAGAATGACTGTGTGCCTAGGAAAGAAAGTGATCCACGCGGTCGGCCCTGATTTCCGGAAGCACCCAGAAGCAGAAGCCTTGAAATTGCTACAAAACGCCTACCATGCAGTGGCAGACTTAGTAAATGAACATAACATCAAGTCTGTCGCCATTCCACTGCTATCTACAGGCATTTACGCAGCCGGAAAAGACCGCCTTGAAGTATCACTTAACTGCTTGACAACCGCGCTAGACAGAACTGACGCGGACGTAACCATCTATTGCCTGGATAAGAAGTGGAAGGAAAGAATCGACGCGGCACTCCAACTTAAGGAGTCTGTAACAGAGCTGAAGGATGAAGATATGGAGATCGACGATGAGTTAGTATGGATCCATCCAGACAGTTGCTTGAAGGGAAGAAAGGGATTCAGTACTACAAAAGGAAAATTGTATTCGTACTTCGAAGGCACCAAATTCCATCAAGCAGCAAAAGACATGGCGGAGATAAAGGTCCTGTTCCCTAATGACCAGGAAAGTAATGAACAACTGTGTGCCTACATATTGGGTGAGACCATGGAAGCAATCCGCGAAAAGTGCCCGGTCGACCATAACCCGTCGTCTAGCCCGCCCAAAACGTTGCCGTGCCTTTGCATGTATGCCATGACGCCAGAAAGGGTCCACAGACTTAGAAGCAATAACGTCAAAGAAGTTACAGTATGCTCCTCCACCCCCCTTCCTAAGCACAAAATTAAGAAT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CTGCTGCTCCTGCTGCCTGCCTTTTTTAGTGGTTGCCGGCGCCTACCTGGCGAAGGTAGACGCCTACGAACATGCGACCACTGTTCCAAATGTGCCACAGATACCGTATAAGGCACTTGTTGAAAGGGCAGGGTATGCCCCGCTCAATTTGGAGATCACTGTCATGTCCTCGGAGGTTTTGCCTTCCACCAACCAAGAGTACATTACCTGCAAATTCACCACTGTGGTCCCCTCCCCAAAAATCAAATGCTGCGGCTCCTTGGAATGTCAGCCGGCCGCTCATGCAGACTATACCTGCAAGGTCTTCGGAGGGGTCTACCCCTTTATGTGGGGAGGAGCGCAATGTTTTTGCGACAGTGAGAACAGCCAGATGAGTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAGCAGATTGCGCGTCTGACCACGCGCAGGCGATTAAGGTGCACACTGCCGCGATGAAAGTAGGACTGCGTATAGTGTACGGGAACACTACCAGTTTCCTAGATGTGTACGTGAACGGAGTCACACCAGGAACGTCTAAAGACTTGAAAGTCATAGCTGGACCAATTTCAGCATCATTTACGCCATTCGATCATAAGGTCGTTATCCATCGCGGCCTGGTGTACAACTATGACTTCCCGGAATATGGAGCGATGAAACCAGGAGCGTTTGGAGACATTCAAGCTACCTCCTTGACTAGCAAGGATCTCATCGCCAGCACAGACATTAGGCTACTCAAGCCTTCCGCCAAGAATGTGCATGTCCCGTACACGCAGGCCGCATCAGGATTTGAGATGTGGAAAAACAACTCAGGCCGCCCATTGCAGGAAACCGCACCTTTCGGGTGTAAGATTGCAGTAAATCCGCTCCGAGCGGTGGACTGTTCATACGGGAACATTCCCATTTCTATTGACATCCCGAACGCTGCCTTTATCAGGACATCAGATGCACCACTGGTCTCAACAGTCAAATGTGAAGTCAGTGAGTGCACTTATTCAGCAGACTTCGACGGGATGGCCACCCTGCAGTATGTATCCGACCGCGAAGGTCAATGCCCCGTACATTCGCATTCGAGCACAGCAACTCTCCAAGAGTCGACAGTACATGTCCTGGAGAAAGGAGCGGTGACAGTACACTTTAGCACCGCGAGTCCACAGGCGAACTTTATCGTATCGCTGTGTGGGAAGAAGACAACATGCAATGCAGAATGTAAACCACCAGCTGACCATATCGTGAGCACCCCGCACAAAAATGACCAAGAATTTCAAGCCGCCATCTCAAAAACATCATGGAGTTGGCTGTTTGCCCTTTTCGGCGGCGCCTCGTCGCTATTAATTATAGGACTTATGATTTTTGCTTGCAGCATGATGCTGACTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCTGTCCTACTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTCCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCTCTAGAATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCTAGACGCTACGCCCCAATGATCCGACCAGCAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAACTGATGTGCATAATGCATCAGGCTGGTACATTAGATCCCCGCTTACCGCGGGCAATATAGCAACACTAAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAAGCGCAGTGCATAATGCTGCGCAGTGTTGCCACATAACCACTATATTAACCATTTATCTAGCGGACGCCAAAAACTCAATGTATTTCTGAGGAAGCGTGGTGCATAATGCCACGCAGCGTCTGCATAACTTTTATTATTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGAATTCCTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACTTAATTAA

SEQ ID NO.2

AAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCC

SEQ ID NO.3

GTGTGTACTACGCCGTCAATTTAATTAAGTCTAACAAAAAAGCCAAAAA

SEQ ID NO.4

AAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACTTAATTAAGTCTAACAAAAAAGCCAAAAA

SEQ ID NO.5

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

SEQ ID NO.6

TAGGATCCATGGTCTAGAGTCGCGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT

SEQ ID NO.7

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCTA

SEQ ID NO.8

CTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCT

SEQ ID NO.9

TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGATTCTAGAGGTGGTGGTGTTGTAGTATTA

SEQ ID NO.10

CTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCTGTCCTACTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTCCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCTCTAGAATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCT。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳理工大学（筹）

<120> 辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用

<130> 20210906

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15693

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caattgcact accatcacaa 60

tggagaagcc agtagtaaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gtgcaactgc 120

aaaaaagctt cccgcaattt gaggtagtag cacagcaggt cactccaaat gaccatgcta 180

atgccagagc attttcgcat ctggccagta aactaatcga gctggaggtt cctaccacag 240

cgacgatctt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccagtatc 300

attgtgtctg ccccatgcgt agtccagaag acccggaccg catgatgaaa tatgccagta 360

aactggcgga aaaagcgtgc aagattacaa acaagaactt gcatgagaag attaaggatc 420

tccggaccgt acttgatacg ccggatgctg aaacaccatc gctctgcttt cacaacgatg 480

ttacctgcaa catgcgtgcc gaatattccg tcatgcagga cgtgtatatc aacgctcccg 540

gaactatcta tcatcaggct atgaaaggcg tgcggaccct gtactggatt ggcttcgaca 600

ccacccagtt catgttctcg gctatggcag gttcgtaccc tgcgtacaac accaactggg 660

ccgacgagaa agtccttgaa gcgcgtaaca tcggactttg cagcacaaag ctgagtgaag 720

gtaggacagg aaaattgtcg ataatgagga agaaggagtt gaagcccggg tcgcgggttt 780

atttctccgt aggatcgaca ctttatccag aacacagagc cagcttgcag agctggcatc 840

ttccatcggt gttccacttg aatggaaagc agtcgtacac ttgccgctgt gatacagtgg 900

tgagttgcga aggctacgta gtgaagaaaa tcaccatcag tcccgggatc acgggagaaa 960

ccgtgggata cgcggttaca cacaatagcg agggcttctt gctatgcaaa gttactgaca 1020

cagtaaaagg agaacgggta tcgttccctg tgtgcacgta catcccggcc accatatgcg 1080

atcagatgac tggtataatg gccacggata tatcacctga cgatgcacaa aaacttctgg 1140

ttgggctcaa ccagcgaatt gtcattaacg gtaggactaa caggaacacc aacaccatgc 1200

aaaattacct tctgccgatc atagcacaag ggttcagcaa atgggctaag gagcgcaagg 1260

atgatcttga taacgagaaa atgctgggta ctagagaacg caagcttacg tatggctgct 1320

tgtgggcgtt tcgcactaag aaagtacatt cgttttatcg cccacctgga acgcagacct 1380

gcgtaaaagt cccagcctct tttagcgctt ttcccatgtc gtccgtatgg acgacctctt 1440

tgcccatgtc gctgaggcag aaattgaaac tggcattgca accaaagaag gaggaaaaac 1500

tgctgcaggt ctcggaggaa ttagtcatgg aggccaaggc tgcttttgag gatgctcagg 1560

aggaagccag agcggagaag ctccgagaag cacttccacc attagtggca gacaaaggca 1620

tcgaggcagc cgcagaagtt gtctgcgaag tggaggggct ccaggcggac atcggagcag 1680

cattagttga aaccccgcgc ggtcacgtaa ggataatacc tcaagcaaat gaccgtatga 1740

tcggacagta tatcgttgtc tcgccaaact ctgtgctgaa gaatgccaaa ctcgcaccag 1800

cgcacccgct agcagatcag gttaagatca taacacactc cggaagatca ggaaggtacg 1860

cggtcgaacc atacgacgct aaagtactga tgccagcagg aggtgccgta ccatggccag 1920

aattcctagc actgagtgag agcgccacgt tagtgtacaa cgaaagagag tttgtgaacc 1980

gcaaactata ccacattgcc atgcatggcc ccgccaagaa tacagaagag gagcagtaca 2040

aggttacaaa ggcagagctt gcagaaacag agtacgtgtt tgacgtggac aagaagcgtt 2100

gcgttaagaa ggaagaagcc tcaggtctgg tcctctcggg agaactgacc aaccctccct 2160

atcatgagct agctctggag ggactgaaga cccgacctgc ggtcccgtac aaggtcgaaa 2220

caataggagt gataggcaca ccggggtcgg gcaagtcagc tattatcaag tcaactgtca 2280

cggcacgaga tcttgttacc agcggaaaga aagaaaattg tcgcgaaatt gaggccgacg 2340

tgctaagact gaggggtatg cagattacgt cgaagacagt agattcggtt atgctcaacg 2400

gatgccacaa agccgtagaa gtgctgtacg ttgacgaagc gttcgcgtgc cacgcaggag 2460

cactacttgc cttgattgct atcgtcaggc cccgcaagaa ggtagtacta tgcggagacc 2520

ccatgcaatg cggattcttc aacatgatgc aactaaaggt acatttcaat caccctgaaa 2580

aagacatatg caccaagaca ttctacaagt atatctcccg gcgttgcaca cagccagtta 2640

cagctattgt atcgacactg cattacgatg gaaagatgaa aaccacgaac ccgtgcaaga 2700

agaacattga aatcgatatt acaggggcca caaagccgaa gccaggggat atcatcctga 2760

catgtttccg cgggtgggtt aagcaattgc aaatcgacta tcccggacat gaagtaatga 2820

cagccgcggc ctcacaaggg ctaaccagaa aaggagtgta tgccgtccgg caaaaagtca 2880

atgaaaaccc actgtacgcg atcacatcag agcatgtgaa cgtgttgctc acccgcactg 2940

aggacaggct agtgtggaaa accttgcagg gcgacccatg gattaagcag cccactaaca 3000

tacctaaagg aaactttcag gctactatag aggactggga agctgaacac aagggaataa 3060

ttgctgcaat aaacagcccc actccccgtg ccaatccgtt cagctgcaag accaacgttt 3120

gctgggcgaa agcattggaa ccgatactag ccacggccgg tatcgtactt accggttgcc 3180

agtggagcga actgttccca cagtttgcgg atgacaaacc acattcggcc atttacgcct 3240

tagacgtaat ttgcattaag tttttcggca tggacttgac aagcggactg ttttctaaac 3300

agagcatccc actaacgtac catcccgccg attcagcgag gccggtagct cattgggaca 3360

acagcccagg aacccgcaag tatgggtacg atcacgccat tgccgccgaa ctctcccgta 3420

gatttccggt gttccagcta gctgggaagg gcacacaact tgatttgcag acggggagaa 3480

ccagagttat ctctgcacag cataacctgg tcccggtgaa ccgcaatctt cctcacgcct 3540

tagtccccga gtacaaggag aagcaacccg gcccggtcga aaaattcttg aaccagttca 3600

aacaccactc agtacttgtg gtatcagagg aaaaaattga agctccccgt aagagaatcg 3660

aatggatcgc cccgattggc atagccggtg cagataagaa ctacaacctg gctttcgggt 3720

ttccgccgca ggcacggtac gacctggtgt tcatcaacat tggaactaaa tacagaaacc 3780

accactttca gcagtgcgaa gaccatgcgg cgaccttaaa aaccctttcg cgttcggccc 3840

tgaattgcct taacccagga ggcaccctcg tggtgaagtc ctatggctac gccgaccgca 3900

acagtgagga cgtagtcacc gctcttgcca gaaagtttgt cagggtgtct gcagcgagac 3960

cagattgtgt ctcaagcaat acagaaatgt acctgatttt ccgacaacta gacaacagcc 4020

gtacacggca attcaccccg caccatctga attgcgtgat ttcgtccgtg tatgagggta 4080

caagagatgg agttggagcc gcgccgtcat accgcaccaa aagggagaat attgctgact 4140

gtcaagagga agcagttgtc aacgcagcca atccgctggg tagaccaggc gaaggagtct 4200

gccgtgccat ctataaacgt tggccgacca gttttaccga ttcagccacg gagacaggca 4260

ccgcaagaat gactgtgtgc ctaggaaaga aagtgatcca cgcggtcggc cctgatttcc 4320

ggaagcaccc agaagcagaa gccttgaaat tgctacaaaa cgcctaccat gcagtggcag 4380

acttagtaaa tgaacataac atcaagtctg tcgccattcc actgctatct acaggcattt 4440

acgcagccgg aaaagaccgc cttgaagtat cacttaactg cttgacaacc gcgctagaca 4500

gaactgacgc ggacgtaacc atctattgcc tggataagaa gtggaaggaa agaatcgacg 4560

cggcactcca acttaaggag tctgtaacag agctgaagga tgaagatatg gagatcgacg 4620

atgagttagt atggatccat ccagacagtt gcttgaaggg aagaaaggga ttcagtacta 4680

caaaaggaaa attgtattcg tacttcgaag gcaccaaatt ccatcaagca gcaaaagaca 4740

tggcggagat aaaggtcctg ttccctaatg accaggaaag taatgaacaa ctgtgtgcct 4800

acatattggg tgagaccatg gaagcaatcc gcgaaaagtg cccggtcgac cataacccgt 4860

cgtctagccc gcccaaaacg ttgccgtgcc tttgcatgta tgccatgacg ccagaaaggg 4920

tccacagact tagaagcaat aacgtcaaag aagttacagt atgctcctcc accccccttc 4980

ctaagcacaa aattaagaat gttcagaagg ttcagtgcac gaaagtagtc ctgtttaatc 5040

cgcacactcc cgcattcgtt cccgcccgta agtacataga agtgccagaa cagcctaccg 5100

ctcctcctgc acaggccgag gaggcccccg aagttgtagc gacaccgtca ccatctacag 5160

ctgataacac ctcgcttgat gtcacagaca tctcactgga tatggatgac agtagcgaag 5220

gctcactttt ttcgagcttt agcggatcgg acaactctat tactagtatg gacagttggt 5280

cgtcaggacc tagttcacta gagatagtag accgaaggca ggtggtggtg gctgacgttc 5340

atgccgtcca agagcctgcc cctattccac cgccaaggct aaagaagatg gcccgcctgg 5400

cagcggcaag aaaagagccc actccaccgg caagcaatag ctctgagtcc ctccacctct 5460

cttttggtgg ggtatccatg tccctcggat caattttcga cggagagacg gcccgccagg 5520

cagcggtaca acccctggca acaggcccca cggatgtgcc tatgtctttc ggatcgtttt 5580

ccgacggaga gattgatgag ctgagccgca gagtaactga gtccgaaccc gtcctgtttg 5640

gatcatttga accgggcgaa gtgaactcaa ttatatcgtc ccgatcagcc gtatcttttc 5700

ctctacgcaa gcagagacgt agacgcagga gcaggaggac tgaatactga ctaaccgggg 5760

taggtgggta catattttcg acggacacag gccctgggca cttgcaaaag aagtccgttc 5820

tgcagaacca gcttacagaa ccgaccttgg agcgcaatgt cctggaaaga attcatgccc 5880

cggtgctcga cacgtcgaaa gaggaacaac tcaaactcag gtaccagatg atgcccaccg 5940

aagccaacaa aagtaggtac cagtctcgta aagtagaaaa tcagaaagcc ataaccactg 6000

agcgactact gtcaggacta cgactgtata actctgccac agatcagcca gaatgctata 6060

agatcaccta tccgaaacca ttgtactcca gtagcgtacc ggcgaactac tccgatccac 6120

agttcgctgt agctgtctgt aacaactatc tgcatgagaa ctatccgaca gtagcatctt 6180

atcagattac tgacgagtac gatgcttact tggatatggt agacgggaca gtcgcctgcc 6240

tggatactgc aaccttctgc cccgctaagc ttagaagtta cccgaaaaaa catgagtata 6300

gagccccgaa tatccgcagt gcggttccat cagcgatgca gaacacgcta caaaatgtgc 6360

tcattgccgc aactaaaaga aattgcaacg tcacgcagat gcgtgaactg ccaacactgg 6420

actcagcgac attcaatgtc gaatgctttc gaaaatatgc atgtaatgac gagtattggg 6480

aggagttcgc tcggaagcca attaggatta ccactgagtt tgtcaccgca tatgtagcta 6540

gactgaaagg ccctaaggcc gccgcactat ttgcaaagac gtataatttg gtcccattgc 6600

aagaagtgcc tatggataga ttcgtcatgg acatgaaaag agacgtgaaa gttacaccag 6660

gcacgaaaca cacagaagaa agaccgaaag tacaagtgat acaagccgca gaacccctgg 6720

cgactgctta cttatgcggg attcaccggg aattagtgcg taggcttacg gccgtcttgc 6780

ttccaaacat tcacacgctt tttgacatgt cggcggagga ttttgatgca atcatagcag 6840

aacacttcaa gcaaggcgac ccggtactgg agacggatat cgcatcattc gacaaaagcc 6900

aagacgacgc tatggcgtta accggtctga tgatcttgga ggacctgggt gtggatcaac 6960

cactactcga cttgatcgag tgcgcctttg gagaaatatc atccacccat ctacctacgg 7020

gtactcgttt taaattcggg gcgatgatga aatccggaat gttcctcaca ctttttgtca 7080

acacagtttt gaatgtcgtt atcgccagca gagtactaga agagcggctt aaaacgtcca 7140

gatgtgcagc gttcattggc gacgacaaca tcatacatgg agtagtatct gacaaagaaa 7200

tggctgagag gtgcgccacc tggctcaaca tggaggttaa gatcatcgac gcagtcatcg 7260

gtgagagacc accttacttc tgcggcggat ttatcttgca agattcggtt acttccacag 7320

cgtgccgcgt ggcggatccc ctgaaaaggc tgtttaagtt gggtaaaccg ctcccagccg 7380

acgacgagca agacgaagac agaagacgcg ctctgctaga tgaaacaaag gcgtggttta 7440

gagtaggtat aacaggcact ttagcagtgg ccgtgacgac ccggtatgag gtagacaata 7500

ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca 7560

tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat 7620

ctgactaata ctacaacacc accaccatga atagaggatt ctttaacatg ctcggccgcc 7680

gccccttccc ggcccccact gccatgtgga ggccgcggag aaggaggcag gcggccccga 7740

tgcctgcccg caacgggctg gcttctcaaa tccagcaact gaccacagcc gtcagtgccc 7800

tagtcattgg acaggcaact agacctcaac ccccacgtcc acgcccgcca ccgcgccaga 7860

agaagcaggc gcccaagcaa ccaccgaagc cgaagaaacc aaaaacgcag gagaagaaga 7920

agaagcaacc tgcaaaaccc aaacccggaa agagacagcg catggcactt aagttggagg 7980

ccgacagatt gttcgacgtc aagaacgagg acggagatgt catcgggcac gcactggcca 8040

tggaaggaaa ggtaatgaaa cctctgcacg tgaaaggaac catcgaccac cctgtgctat 8100

caaagctcaa atttaccaag tcgtcagcat acgacatgga gttcgcacag ttgccagtca 8160

acatgagaag tgaggcattc acctacacca gtgaacaccc cgaaggattc tataactggc 8220

accacggagc ggtgcagtat agtggaggta gatttaccat ccctcgcgga gtaggaggca 8280

gaggagacag cggtcgtccg atcatggata actccggtcg ggttgtcgcg atagtcctcg 8340

gtggagctga tgaaggaaca cgaactgccc tttcggtcgt cacctggaat agtaaaggga 8400

agacaattaa gacgaccccg gaagggacag aagagtggtc cgcagcacca ctggtcacgg 8460

caatgtgttt gctcggaaat gtgagcttcc catgcgaccg cccgcccaca tgctataccc 8520

gcgaaccttc cagagccctc gacatccttg aagagaacgt gaaccatgag gcctacgata 8580

ccctgctcaa tgccatattg cggtgcggat cgtctggcag aagcaaaaga agcgtcactg 8640

acgactttac cctgaccagc ccctacttgg gcacatgctc gtactgccac catactgaac 8700

cgtgcttcag ccctgttaag atcgagcagg tctgggacga agcggacgat aacaccatac 8760

gcatacagac ttccgcccag tttggatacg accatagcgg agcagcaagc gcaaacaagt 8820

accgctacat gtcgcttaag caggatcaca ccgttaaaga aggcaccatg gatgacatca 8880

agattagcac ctcaggaccg tgtagaaggc ttagctacaa aggatacttt ctcctcgcaa 8940

aatgccctcc aggggacagc gtaacggtta gcatagtgag tagcaactca gcaacgtcat 9000

gtacactggc ccgcaagata aaaccaaaat tcgtgggacg ggaaaaatat gatctacctc 9060

ccgttcacgg taaaaaaatt ccttgcacag tgtacgaccg tctgaaagaa acaactgcag 9120

gctacatcac tatgcacagg ccgggaccgc acgcttatac atcctacctg gaagaatcat 9180

cagggaaagt ttacgcaaag ccgccatctg ggaagaacat tacgtatgag tgcaagtgcg 9240

gcgactacaa gaccggaacc gtttcgaccc gcaccgaaat cactggttgc accgccatca 9300

agcagtgcgt cgcctataag agcgaccaaa cgaagtgggt cttcaactca ccggacttga 9360

tcagacatga cgaccacacg gcccaaggga aattgcattt gcctttcaag ttgatcccga 9420

gtacctgcat ggtccctgtt gcccacgcgc cgaatgtaat acatggcttt aaacacatca 9480

gcctccaatt agatacagac cacttgacat tgctcaccac caggagacta ggggcaaacc 9540

cggaaccaac cactgaatgg atcgtcggaa agacggtcag aaacttcacc gtcgaccgag 9600

atggcctgga atacatatgg ggaaatcatg agccagtgag ggtctatgcc caagagtcag 9660

caccaggaga ccctcacgga tggccacacg aaatagtaca gcattactac catcgccatc 9720

ctgtgtacac catcttagcc gtcgcatcag ctaccgtggc gatgatgatt ggcgtaactg 9780

ttgcagtgtt atgtgcctgt aaagcgcgcc gtgagtgcct gacgccatac gccctggccc 9840

caaacgccgt aatcccaact tcgctggcac tcttgtgctg cgttaggtcg gccaatgctg 9900

aaacgttcac cgagaccatg agttacttgt ggtcgaacag tcagccgttc ttctgggtcc 9960

agttgtgcat acctttggcc gctttcatcg ttctaatgcg ctgctgctcc tgctgcctgc 10020

cttttttagt ggttgccggc gcctacctgg cgaaggtaga cgcctacgaa catgcgacca 10080

ctgttccaaa tgtgccacag ataccgtata aggcacttgt tgaaagggca gggtatgccc 10140

cgctcaattt ggagatcact gtcatgtcct cggaggtttt gccttccacc aaccaagagt 10200

acattacctg caaattcacc actgtggtcc cctccccaaa aatcaaatgc tgcggctcct 10260

tggaatgtca gccggccgct catgcagact atacctgcaa ggtcttcgga ggggtctacc 10320

cctttatgtg gggaggagcg caatgttttt gcgacagtga gaacagccag atgagtgagg 10380

cgtacgtcga attgtcagca gattgcgcgt ctgaccacgc gcaggcgatt aaggtgcaca 10440

ctgccgcgat gaaagtagga ctgcgtatag tgtacgggaa cactaccagt ttcctagatg 10500

tgtacgtgaa cggagtcaca ccaggaacgt ctaaagactt gaaagtcata gctggaccaa 10560

tttcagcatc atttacgcca ttcgatcata aggtcgttat ccatcgcggc ctggtgtaca 10620

actatgactt cccggaatat ggagcgatga aaccaggagc gtttggagac attcaagcta 10680

cctccttgac tagcaaggat ctcatcgcca gcacagacat taggctactc aagccttccg 10740

ccaagaatgt gcatgtcccg tacacgcagg ccgcatcagg atttgagatg tggaaaaaca 10800

actcaggccg cccattgcag gaaaccgcac ctttcgggtg taagattgca gtaaatccgc 10860

tccgagcggt ggactgttca tacgggaaca ttcccatttc tattgacatc ccgaacgctg 10920

cctttatcag gacatcagat gcaccactgg tctcaacagt caaatgtgaa gtcagtgagt 10980

gcacttattc agcagacttc gacgggatgg ccaccctgca gtatgtatcc gaccgcgaag 11040

gtcaatgccc cgtacattcg cattcgagca cagcaactct ccaagagtcg acagtacatg 11100

tcctggagaa aggagcggtg acagtacact ttagcaccgc gagtccacag gcgaacttta 11160

tcgtatcgct gtgtgggaag aagacaacat gcaatgcaga atgtaaacca ccagctgacc 11220

atatcgtgag caccccgcac aaaaatgacc aagaatttca agccgccatc tcaaaaacat 11280

catggagttg gctgtttgcc cttttcggcg gcgcctcgtc gctattaatt ataggactta 11340

tgatttttgc ttgcagcatg atgctgacta gcacacgaag atgacgggcc caggtagaca 11400

atattacacc tgtcctactg gcattgagaa cttttgccca gagcaaaaga gcattccaag 11460

ccatcagagg ggaaataaag catctctacg gtggtcctaa atagtcagca tagtacattt 11520

catctgacta atactacaac accaccacct ctagaatcgc caccatggtg agcaagggcg 11580

aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 11640

acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 11700

agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 11760

cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 11820

agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 11880

actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 11940

tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 12000

acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 12060

tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 12120

acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 12180

ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 12240

ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cgcgactcta 12300

gaccatggat cctagacgct acgccccaat gatccgacca gcaaaactcg atgtacttcc 12360

gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct ggtacattag atccccgctt accgcgggca 12420

atatagcaac actaaaaact cgatgtactt ccgaggaagc gcagtgcata atgctgcgca 12480

gtgttgccac ataaccacta tattaaccat ttatctagcg gacgccaaaa actcaatgta 12540

tttctgagga agcgtggtgc ataatgccac gcagcgtctg cataactttt attatttctt 12600

ttattaatca acaaaatttt gtttttaaca tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 12660

aaaaaagggg aattcctcga ggggaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc aggtggcact 12720

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 12780

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 12840

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 12900

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 12960

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 13020

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 13080

cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 13140

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 13200

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 13260

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 13320

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 13380

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 13440

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 13500

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 13560

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 13620

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 13680

tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 13740

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 13800

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 13860

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 13920

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 13980

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 14040

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 14100

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 14160

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 14220

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cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 14340

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 14400

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 14460

aacgccagca acgcgagctc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc 14520

acggcgagcg ctgccacgtc agacgaaggg cgcagcgagc gtcctgatcc ttccgcccgg 14580

acgctcagga cagcggcccg ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag 14640

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ggaacaggcg aggaaaagta gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc 14760

ggtgaacgcc gatgattata taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag 14820

ccgggatttg ggtcgcggtt cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagtagc 14880

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gtcttgaggc cttcgctaat gcgggaaagc tcttattcgg gtgagatggg ctggggcacc 15180

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