一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子及其应用

摘要

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的microRNA(miRNA)及其应用；所述miRNA为miR‑9820‑5p，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明针对miR‑9820‑5p设计特异性杂交探针，经荧光原位杂交验证所述的miR‑9820‑5p的真实存在；针对miR‑9820‑5p设计特异性扩增引物，经荧光定量PCR检测到miR‑9820‑5p在猪卵巢中健康有腔卵泡组织中表达低于闭锁卵泡，用相应类似物和抑制物处理证实miR‑9820‑5p对颗粒细胞凋亡具有显著促进作用；同时，本发明设计分别提供miR‑9820‑5类似物和抑制物的核苷酸序列；本发明公开的miR‑9820‑5p有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA及其应用。

背景技术

雌性动物的生殖性能，尤其是产仔数与其排卵数量紧密相关。卵泡闭锁是哺乳动物卵泡发育过程中的一种自然生理现象。在母猪出生前后，其原始卵泡腔形成，其卵泡储备含有大约500万个原始卵泡。然而在生长发育及发情周期过程中，大量卵泡在直径达到6毫米之前发生闭锁和消失，导致最终可实现的排卵率低于14％。作为卵泡的主要组成部分，颗粒细胞通过与卵母细胞和卵泡膜细胞密切相互作用并产生旁分泌物质而发挥功能。研究表明，颗粒细胞增殖和功能在卵泡发育和成熟中至关重要，而颗粒细胞凋亡率随着卵泡闭锁的进展而显著增加，因此颗粒细胞凋亡水平是卵泡闭锁的主要标志之一。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，一般通过转录抑制或转录后降解广泛参与基因表达的调节过程。研究发现有15-30％的动物基因组由miRNA直接调控，人类中1/3的基因都受到miRNA的调控。miRNA分布广泛，参与细胞生长、分化、凋亡、增殖等生物过程。2007年，miRNA在卵母细胞发育、成熟的调控的参与在Dicer酶基因敲除的小鼠模型中首次得到证实。2010年，miR-21成为第一个被证实在哺乳动物卵泡颗粒细胞凋亡中发挥作用的miRNA，近年来发现miRNA在卵母细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞中均发挥的重要调控作用，提示了miRNA在卵泡闭锁过程中的调控作用和应用潜力。

发明内容

为了达到上述目的，本发明提供一种与母猪繁殖相关的miRNA，所述的miRNA为猪miR-9820-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种用于检测样品中miR-9820-5p表达水平的试剂，所述miR-9820-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增miR-9820-5p的反转录茎环引物及可用于荧光定量PCR检测的上游引物，或特异性标记miR-9820-5p的荧光原位杂交探针；所述特异性反转录miR-9820-5p的茎环引物的序列如SEQ ID NO:2所示；

本发明提供了一种特异性扩增miR-9820-5p，并可用于荧光定量PCR检测的上游引物，该上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，配合miRNA扩增通用下游引物使用，该通用下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示；提供一种特异性标记miR-9820-5p的原位杂交探针，该探针的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了一种miR-9820-5p的特异性mimics双链序列，该mimics序列如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

本发明提供了一种miR-9820-5p的特异性inhibitor序列，该inhibitor序列如SEQID NO:7所示。

本发明提供的miRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。

本发明提供的miRNA在母猪的选择评定、配种、遗传改良以及卵巢病理检测中的应用。

本发明提供的试剂在动物细胞和组织表达量检测中的应用。

本发明提供的试剂在母猪的选择评定、配种、遗传改良以及卵巢病理检测中的应用。

本发明提供的mimics序列在用于加强所述的miRNA的处理中的应用；所述的miR-9820-5p的特异性mimics序列，可用于miR-9820-5p在细胞、组织、活体中的功能性上调。

本发明提供的inhibitor序列在用于抑制所述的miRNA的处理中的应用；所述的miR-9820-5p的特异性inhibitor序列，可用于miR-9820-5p在细胞、组织、活体中的功能性下调。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的一种与猪有腔卵泡闭锁相关的microRNA(miRNA)及其应用；所述miRNA为miR-9820-5p，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明针对miR-9820-5p设计特异性杂交探针，经荧光原位杂交验证所述的miR-9820-5p的真实存在；针对miR-9820-5p设计特异性扩增引物，经荧光定量PCR检测到miR-9820-5p在猪卵巢中健康有腔卵泡组织中表达低于闭锁卵泡，用相应类似物和抑制物处理证实miR-9820-5p对颗粒细胞凋亡具有显著促进作用；同时，本发明设计分别提供miR-9820-5类似物和抑制物的核苷酸序列；本发明公开的miR-9820-5p有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。

本发明提供的miRNA序列短小、转录快且与猪卵泡闭锁相关性高，可作为卵泡健康或闭锁状况鉴定的直接指征或判断依据之一。由于miRNA可直接通过腹腔或组织注射等方式发挥作用，因此该miRNA还可作为人工干涉卵泡发育或闭锁过程的工具。本发明提供的相关检测试剂中的反转录茎环引物及其配套定量引物和荧光探针特异性强，能明确反应该miRNA的表达水平和亚细胞分布情况。本发明提供的mimics和inhibitor对miRNA生物学作用的促进和抑制效果显著且特异性强。

附图说明

图1为qRT-PCR检测miR-9820-5p在猪健康、闭锁有腔卵泡中的表达量；

图2为荧光原位杂交检测猪颗粒细胞中miR-9820-5p的分布图，其中，左图为绿色荧光标记的miR-9820-5p探针定位，中图为DAPI染色的细胞核，右图为左、中二图的叠加图；

图3为qRT-PCR检测可见转染miR-9820-5pmimics的猪颗粒细胞中miR-9820-5p的表达量；

图4为转染miR-9820-5p inhibitor的猪颗粒细胞中miR-9820-5p的表达量；

图5为流式细胞术检测转染miR-9820-5p mimics前后的猪颗粒细胞凋亡率变化图，其中左图为流式细胞仪检测结果原图；右图为经统计分析处理后的结果图。图6为流式细胞术检测转染miR-9820-5p inhibitor前后的猪颗粒细胞凋亡率变化图，其中左左图为流式细胞仪检测结果原图；右图为经统计分析处理后的结果图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未说明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是猪miR-9820-5p的线性核苷酸序列；

SEQ ID NO:2是特异性扩增miR-9820-5p的反转录茎环引物序列；

SEQ ID NO:3是特异性扩增miR-9820-5p的引物对的上游引物序列；

SEQ ID NO:4是特异性标记miR-9820-5p的原位杂交探针序列；

SEQ ID NO:5是miR-9820-5p的特异性mimics双链正链序列；

SEQ ID NO:6是miR-9820-5p的特异性mimics双链负链序列；

SEQ ID NO:7是miR-9820-5p的特异性inhibitor序列；

SEQ ID NO:8是特异性扩增U6的引物对的上游引物序列；

SEQ ID NO:9是特异性扩增U6的引物对的下游引物序列；

SEQ ID NO:10是miRNA扩增引物对的通用下游引物序列。

本发明涉及了一种有效检测miRNA在动物细胞或组织中相对表达量的方法，即以miRNA特异引物，以U6作为内参基因进行实时定量PCR的方法。

本发明的miRNA反转录引物、上游扩增引物及U6引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3以及SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

本发明提供了一种有效检测miRNA在动物细胞或组织中定性分布的方法，即以miRNA特异探针进行荧光原位杂交的方法；miRNA特异探针的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了一种有效上调miRNA在动物细胞中表达的方法，即脂质体介导的miRNAmimics转染的方法。

本发明提供了一种有效下调miRNA在动物细胞中表达的方法，即脂质体介导的miRNAinhibitor转染的方法。

本发明的miRNA特异mimics双链的序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

本发明的miRNA特异inhibitor单链的序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明涉及到一种细胞凋亡检测的方法即Annexin V-PI染色，流式细胞仪检测法。

实施例1

猪miR-9820-5p在健康、闭锁有腔卵泡中的表达差异

(1)猪miR-9820-5p引物的设计

根据sus-miR-9820-5p的序列(NR_128505.1)，设计引物；具体序列如下：

反转录引物SEQ ID No.2:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCCTTTC；

miR-9820-5p的特异性正向引物序列SEQ ID No.3：GCCGAGGAGGAGGAGGGAA；

U6的正向引物序列SEQ ID No.8：CGCTTCGGCAGCACATATAC；

U6的反向引物序列SEQ ID No.9：TTCACGAATTTGCGTGTCAT；

miRNA扩增的反向通用引物序列SEQ ID No.10：CTCAACTGGTGTCGTGGA；

上述引物由引物合成公司合成，其中U6为内参基因。

(2)猪健康有腔卵泡RNA提取(常规TRIZOL法)：

取健康发情前猪卵巢，用小镊子和剪刀分离直径约5mm的健康和闭锁有腔卵泡，按照每个卵泡组织1ml TRIZOL试剂(购自Vazyme南京有限公司)，反复吹打，将匀浆样品移至1.5ml离心管中(RNase free)，室温下置5min使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置3min。于4℃，12000×g离心15min，样品分三层，RNA主要在最上层水相中，吸取600ul上清移至1.5ml离心管，加500ul异丙醇，颠倒混匀，冰浴10min。然后在2-8℃，12000×g下离心10min，弃上清。加入1ml75％浓度的乙醇，振荡混匀，于4℃，7500×g下离心5min，弃上清。室温晾5-10min干燥RNA，加20ul无RNA酶水，混匀，吸取1ul于ThermoNANO Drop2000紫外分光光度计下测量浓度及纯度，取质量合格的RNA放于-80℃下保存。

(3)RNA反转录

按照Vazyme反转录试剂盒(R223-01)说明书介绍的操作方法进行RNA反转录，具体步骤如下：1)基因组DNA去除：1ug RNA，4ul 4×gDNA wiper Mix，RNase free ddH2O至16ul，混匀，于42℃孵育2min。2)反转录反应：在步骤1)的反应液中加5×HiScript IIqRTSuperMix II4ul，RT引物SEQ ID NO:2，混匀，50℃15min，85℃5s。

(4)qPCR

qPCR反应体系：SYBR Green I real-time PCR Mix(购自中国大连Takara生物公司)5μL，上、下游引物(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)0.15μL，200ng cDNA，加水至10μL。反应程序：95℃预变性2min；40个循环(95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s)。生物学及技术性重复各3个，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量，其中△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参)-(Ct目的基因-Ct内参)最大值，其中内参用U6。T检验进行显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

结果：

如图1所示，以U6为内参基因，qRT-PCR检测miR-9820-5p在猪健康、闭锁有腔卵泡中的表达量，结果显示miR-9820-5p在猪健康有腔卵泡中的表达量极显著低于闭锁卵泡。miR-9820-5p的功能可能与促进卵泡闭锁相关。

实施例2

猪miR-9820-5p的细胞定位

(1)猪miR-9820-5p荧光探针的设计

根据互补配对原则，设计miR-9820-5p的地高辛标记探针。该探针的序列如SEQ IDNO:4所示。该探针由探针合成公司合成。

(2)猪颗粒细胞的爬片培养

用含有庆大霉素(80mg/L)的无菌生理盐水清洗猪卵巢，使用带有20号针头的注射器从直径约为5mm的透明有腔卵泡中抽取卵泡液和颗粒细胞。然后在含有10％胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM/F12培养基(购自美国Gibco公司)中培养猪颗粒细胞，细胞接种在放置盖玻片的六孔板中，培养箱条件为37℃和5％CO2。待细胞贴壁后可取出盖玻片，进行探针孵育。

(3)猪miR-9820-5p荧光探针的孵育及显微镜观察

首先用4％多聚甲醛(含DEPC)对盖玻片上培养的猪颗粒细胞进行固定20分钟，用PBS(pH 7.4)摇动洗涤三次，最后添加蛋白酶K(20μg/ml)5分钟进行消化。探针预杂交、杂交、洗涤，鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)、DAPI复染核所有程序均按照细胞爬片荧光探针原位杂交双标(TSA)实验试剂盒制造商的说明进行(中国武汉塞维尔生物科技公司)。使用尼康直立荧光显微镜(日本尼康DS-U3)获取荧光图像。FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光。实验进行三次生物学重复。

结果

如图2所示，左图为绿色荧光标记的miR-9820-5p探针定位，中图为DAPI染色的细胞核，右图为左、中二图的叠加图，标识miR-9820-5p表达与细胞核的相对位置；荧光原位杂交检测猪颗粒细胞中miR-9820-5p用绿色荧光标记，细胞核用DAPI(蓝色)染色，其中miR-9820-5p的定位主要在细胞质中。标尺为50μm。进一步证实了miR-9820-5p在猪颗粒细胞的存在及其在细胞质中的分布情况。

本发明的miRNA在猪健康卵巢颗粒细胞细胞质中有较高分布，在细胞核中表达极低。

实施例3

miR-9820-5p促进猪颗粒细胞凋亡

(1)miR-9820-5p特异性mimics和inhibiror的设计

以miR-9820-5p序列为模板，由合成公司合成。miR-9820-5p特异性mimics序列对分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；miR-9820-5p特异性inhibiror的序列分别为SEQ IDNO:7。

(2)猪颗粒细胞miR-9820-5p的转染

培养猪颗粒细胞36小时，使细胞达到50-80％汇合时进行转染。使用LipofectamineTM3000转染试剂和Opti MEM培养液(购自Invitrogen公司)按使用说明书步骤进行转染。实验进行三次生物学重复。

(3)miR-9820-5p特异性mimics和inhibiror效率的检测

分别以转染miR-9820-5p特异性mimics、miR-9820-5p特异性inhibiror和NC的猪颗粒细胞cDNA为模板，以miR-9820-5p特异性引物，进行qPCR扩增，比较猪颗粒细胞中miR-9820-5p的表达量差异。反应体系及分析方法见1.4。生物学及技术性重复各3个。

(4)猪颗粒细胞凋亡检测

分别以miR-9820-5p特异性mimics、miR-9820-5p特异性inhibiror转染猪颗粒细胞后72小时，消化细胞，用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒(购自Vazyme南京有限公司)根据制造商的说明，进行细胞凋亡染色标记。通过流式细胞术检测凋亡细胞的百分比(BeckmanCoulter，Brea，Cal，USA)。使用FlowJo v7.6软件(美国加利福尼亚州斯坦福大学)对数据进行分析。生物学及技术性重复各3个。

结果

如图3所示，qRT-PCR检测可见转染miR-9820-5pmimics的猪颗粒细胞中miR-9820-5p的表达量显著升高(p<0.01)，结果显示miR-9820-5p特异性mimics有上调miR-9820-5p水平的效果。本发明的特异mimics经脂质体转染颗粒细胞后能有效增加颗粒细胞中相应miRNA表达量。

如图4所示，转染miR-9820-5p inhibitor的猪颗粒细胞中miR-9820-5p的表达量显著降低(p<0.01)结果显示miR-9820-5p特异性inhibitor有下调miR-9820-5p水平的效果。本发明的特异inhibitor经脂质体转染颗粒细胞后能有效降低颗粒细胞中相应miRNA表达量。

如图5所示，流式细胞术检测可见转染miR-9820-5p mimics的猪颗粒细胞凋亡率显著高于转染NC的猪颗粒细胞(p<0.001)，结果显示miR-9820-5p可导致猪颗粒细胞凋亡。本发明的miRNA被mimics上调后能显著提高猪卵巢颗粒细胞凋亡率。

如图6所示，流式细胞术检测可见转染miR-9820-5p inhibitor可以降低凋亡率维持猪颗粒细胞正常生理状态。本发明的miRNA被inhibitor下调后能显著降低猪卵巢颗粒细胞凋亡率。

综上结果显示miR-9820-5p功能可能与促进颗粒细胞凋亡，促进卵泡闭锁相关。因此，有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 金陵科技学院

<120> 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 1

gaggaggagg gaagaaaggc u 21

<210> 2

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagagcc tttc 44

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgaggagg aggagggaa 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcctttctt ccctcctcct c 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggaggagg gaagaaaggc u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccuuucuucc cuccuccucu u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agccuuucuu cccuccuccu c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcttcggca gcacatatac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcacgaatt tgcgtgtcat 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcaactggt gtcgtgga 18