一种基于可视化LAMP技术检测具条实蝇的方法及应用

摘要

本发明提供一种基于可视化LAMP技术检测具条实蝇的方法，包括：1)以具条实蝇线粒体COI基因中的含有特异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为具条实蝇。本发明还提供了相应的引物组合及应用。本发明提供的方法和引物组能够快速精确检测具条实蝇、将之与其非常接近的其他种类实蝇相区分，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检疫技术领域，具体涉及一种基于可视化LAMP技术检测具条实蝇的方法及应用。

背景技术

具条实蝇Bactrocera scutellata Hendel属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)，主要分布于东亚及东南亚地区，以取食茄科及南瓜、芒果等具有经济价值的果蔬为主，是国际上主要检疫性害虫。近年来，随全球气候变暖及国内果蔬大范围交互调运，具条实蝇在我国发生面积逐渐扩大，危害程度不断加剧。在河南、山东、陕西和安徽等省区，具条实蝇已成为当地主要果蔬实蝇类害虫之一。具条实蝇的广泛发生不仅对果蔬产业造成了严重经济损失，并可能对我国果蔬出口检疫产生不利影响。

长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态特征而确定的，由于生活环境不同，实蝇形态特征会随之发生相应的变化，给鉴定带来困难。而且，在瓜果蔬菜的检疫过程中，检测到的通常是果蔬携带的实蝇幼虫，通过传统形态学法很难对实蝇幼虫进行准确鉴定，这给实蝇的检疫防控带来困难。

目前，虽然有一些现有技术提供了针对个别实蝇种别的鉴定方法，例如，申请号为201410178620.4的中国专利申请公开了一种将针对多种生物的引物组混合使用的环介导等温扩增检测方法，但该专利技术仅针对辣椒实蝇、瓜实蝇、番石榴实蝇和桃实蝇设计混合引物用于鉴别上述4种实蝇，没有涉及具条实蝇的特异引物，不能用于检测具条实蝇。当前，对于具条实蝇分子检测的方法主要是基于聚合酶链式反应(PCR)的技术或实时荧光定量(Real-time PCR)进行的，均存在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人员的技术要求高等缺点，因此难以满足基层实验室的检测需求。

等温扩增技术即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，是2000年Notomi等开发的一种新的核酸等温扩增方法。LAMP具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已广泛应用于病毒、细菌、线虫等鉴定领域。LAMP技术具有如下特点；1)灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与PCR相比高出几个数量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生扩增反应，只有当引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增；2)检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，比PCR用时短，60分钟内完成基本反应并检测扩增产物。加入环引物后，可缩短反应时间至30分钟。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，扩增数量高于PCR上千倍；3)设备简单、操作简便：只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用；4)产物易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，通过实时浊度计检测反应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检测。通过SYBRgreen I、钙黄绿素(Calcein)荧光染料的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色检测法。虽然，在申请号为201711141240.3的中国专利申请中公开了一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，但是该专利是通过LAMP技术来鉴定瓜实蝇，也不能用于具条实蝇检测。因此，如何对具条实蝇进行精准、快速检测的问题仍然亟需解决。

发明内容

本发明通过具条实蝇的LAMP检测技术研究，开发了一套基于LAMP的具条实蝇可视化快速分子检测技术，可有效解决幼虫鉴定周期长的难题。

本发明首先提供了一种基于可视化LAMP技术检测具条实蝇的方法，包括：

1)以具条实蝇线粒体COI基因中的含有特异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；所述靶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；

3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为具条实蝇。

在根据本发明的一个实施方案中，所述特异性LAMP引物组由核苷酸序列为SEQ IDNO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

在根据本发明的一个实施方案中，所述LAMP反应的条件为：63℃40-60min，85℃灭活5min。

在根据本发明的一个实施方案中，所述LAMP体系中包含所述的特异性引物、ThermoPol反应缓冲液、MgSO

在根据本发明的一个实施方案中，所述检测用核酸染料为SYBR Green I。

更优选地，所述方法还包括：反应体系配置好之后于试管内壁上层设置一不与反应体系接触的隔膜，并将适量核酸染料(SYBR Green I)滴加在隔膜上，然后盖好盖子进行反应，在反应结束后通过离心使核酸染料混进体系中。所述隔膜优选为锡箔或铝箔。上述操作实现免开盖显色的操作，避免了操作中产生交叉污染的问题。

本发明的同时还提供了一种用于可视化检测具条实蝇的LAMP引物组，由核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ IDNO:4的FIP引物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。

本发明的另一方面提供了一种用于可视化检测具条实蝇的试剂盒，包含上述的引物组的试剂，以及检测用核酸染料，优选地，所述检测用核酸染料为SYBR Green I。

本发明还提供了上述的方法、LAMP引物组、或者试剂盒在生物检疫中的应用。

在根据本发明的一个实施方案中，所述生物检疫中以实蝇幼虫或实蝇成虫为生物检材。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

上述方案中，解决了具条实蝇幼虫难以鉴别的问题，用快速分子检测加可视化方法，可以在1小时内获得检测结果。免开盖的可视化检测方法可以有效避免气溶胶污染，能够准确显色。不需要昂贵的仪器设备，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

本发明提供的方法和引物组能够在果实蝇属的物种中精确检测具条实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。

附图说明

图1为部分序列比对结果示意图；

图2为引物设计页面示意图；

图3为荧光显色结果图谱，具体地：从左到右依次编号为1-2具条实蝇、3-5桔小实蝇、6-7瓜实蝇、8三点棍腹实蝇、9对照；

图4重复验证引物组特异性结果图谱，具体地：1-3具条实蝇、4-6桔小实蝇、7南瓜实蝇、8-9三点棍腹实蝇、10对照；

图5为检验引物组灵敏度的结果照片。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1引物设计

基于具条实蝇线粒体COI基因上的一段长度为633bp的片段(SEQ ID NO:1)。序列如下：

SEQ ID NO:1：

TGAGCAGGTATAGTAGGAACATCTTTAAGAATTTTAGTCCGAGCAGAATTGGGTCACCCAGGAGCTCTAATTGGAGACGACCAAATTTATAATGTAATCGTAACAGCTCATGCATTTGTAATAATTTTTTTCATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGTAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGGAGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAATAAATAATATAAGATTTTGACTACTGCCCCCTTCACTTACACTACTTTTAGTGAGCAGTATAGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCTCTTTCATCAATTATTGCTCATGGAGGAGCATCTGTTGATCTAGCTATTTTCTCTTTACATTTAGCCGGAATTTCCTCTATTTTAGGTGCAGTAAATTTTATTACAACAGTAATCAATATACGATCTACAGGAATTACCTTCGATCGAATACCTTTATTTGTCTGAGCAGTAGTATTAACAGCCCTATTACTACTACTTTCATTACCTGTTTTAGCTGGAGCTATTACAATGCTATTAACAGATCGAAATTTAAACACCTCTTTCTTTGACCCAGCCGGAGGTGGAGACCCCATTCTATATCAACACTTATTC

查看具条实蝇Bactrocera scutellata与桔小实蝇Bactroceradorsalis、杨桃果实蝇Bactrocera carambolae、扎氏果实蝇Bactrocera jarvisi、南瓜实蝇Bactroceratau、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae相同位置的序列。经过比对得到具条实蝇序列主要的特异位点，图1展示了部分序列片段比对情况，记录该片段中有较高多态性的变异位点，设计对具条实蝇特异的引物。

利用PrimerExplorer V5在线设计引物(网址链接为http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)，设计对具条实蝇有特异性的引物。去掉相似度较高的引物，得到多套潜在特异性引物，经过反复验证，淘汰不能扩增或不够特异的引物，筛选出一套特异的引物组合。图2为引物信息页面。

具条实蝇特异性LAMP扩增引物，序列如下：

F3(SEQ ID NO:2)：

GCTGGAACAGGTTGAACT

B3(SEQ ID NO:3)：

AAAGGTATTCGATCGAAGGTA

FIP(SEQ ID NO:4)：

ATGTAAAGAGAAAATAGCTAGATCAGTTTACCCTCCTCTTTCATCA

BIP(SEQ ID NO:5)：TAGCCGGAATTTCCTCTATTTTAGGCTGTAGATCGTATATTGATTACTGT

实施例2引物的特异性检测

按照下列组成配置具条实蝇的LAMP反应液：

反应液A：10×ThermoPol缓冲液、MgSO

反应液B：10000×SYBR Green I

反应液A的体系组成为：

a)具条实蝇DNA模板的制备

取待测昆虫的全身或部分组织样品，使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(QIAGEN)，参考试剂盒说明操作提取基因组DNA。

b)LAMP检测结果

在反应液A中加入制备的DNA模板1ul，混匀。反应体系配置好之后在试管内壁上层放置一片锡箔纸，滴1ul核酸染料(反应液B)在锡箔纸上，盖好盖子，63℃40min，85℃灭活5min。反应结束后用手掌型离心机离心，让核酸染料混进体系中。如果颜色变绿，说明发生了扩增。阴性对照的体系颜色为棕色。

结果呈现特异性的反应，见图3，从左到右依次编号为1-2具条实蝇、3-5桔小实蝇、6-7瓜实蝇、8三点棍腹实蝇、9对照。具条实蝇为阳性，其他样品均为阴性。

图4换新的DNA模板重复验证引物特异性，结果呈现特异性的反应：1-3具条实蝇、4-6桔小实蝇、7南瓜实蝇、8-9三点棍腹实蝇、10对照。具条实蝇为阳性结果，其他样品均为阴性结果。

实施例3灵敏度检测

使用超微量紫外分光光度计(Nano-200)检测具条实蝇DNA模板初始浓度，取1μL模板加入9μL ddH

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于可视化LAMP技术检测具条实蝇的方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 具条实蝇(Tephritidae)

<400> 1

tgagcaggta tagtaggaac atctttaaga attttagtcc gagcagaatt gggtcaccca 60

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<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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