白菜A09染色体上与叶片低温黄化相关的SNP分子标记及其应用

摘要

本发明涉及分子标记辅助育种领域，具体涉及白菜A09染色体上与叶片低温黄化相关的SNP分子标记及其应用。本发明公开了检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜低温抗性中的应用，所述A0945007157位点是白菜基因组中的一个SNP位点，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为C或G。通过对F2群体187个单株验证发现标记的准确率能达到100％，该标记可用于白菜耐低温分子标记辅助育种。本发明获得的分子标记在实际应用中成本低、通量高、特异性高，为加速白菜耐低温育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记辅助育种领域，具体涉及白菜A09染色体上与叶片低温黄化相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

叶绿素是植物光合作用过程中最主要的色素之一，对其生长发育具有重要作用。植物在其进化过程中形成了一系列复杂的机制以精准调控叶绿素的生物合成，最终产生了白化、黄化、常绿、深绿、淡绿及条纹等叶色突变体。深入挖掘叶色突变的功能基因和分子调控机理，对于作物改善光合效率，提高产量具有重要意义。

十字花科芸薹属芸薹种作物包括大白菜亚种、小白菜亚种和芜菁亚种。叶色突变体在芸薹种作物中普遍存在，但关于温度诱导的叶色突变体尤其是低温诱导的叶色突变体鲜有报道。低温诱导下的黄化突变体光合作用迅速减弱，植株生长减缓甚至停滞，造成严重减产。随着冬春季白菜类蔬菜栽培面积的不断扩大，耐低温品种的选育显得尤为迫切。到目前为止，大量芜菁重要性状基因如抗根肿病、耐抽薹等已被广泛应用到白菜类蔬菜育种中，这也加速了白菜类蔬菜的抗病、抗逆育种进程，为白菜产业发展做出了重要贡献。与此同时，芜菁中也存在一些不良性状，这些不良性状往往在转育优异性状的同时也被导入到其它白菜类蔬菜中。因此，保留优异性状，剔除不良性状将是未来的重点。

利用与目标性状连锁的分子标记进行标记辅助选择是在遗传育种中十分有效的方法。SNP标记属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory of theGovernment Chemist)公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一，并且广泛应用于作物高通量分子标记辅助育种。

发明内容

本发明的目的是提供白菜A09染色体上与叶片低温黄化相关的SNP分子标记及其应用。

为实现上述目的，第一个方面，本发明提供检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质在下述A1)至A6)中的应用，

A1)鉴定或辅助鉴定白菜低温抗性；

A2)制备鉴定或辅助鉴定白菜低温抗性的产品；

A3)筛选或辅助筛选耐低温白菜；

A4)制备筛选或辅助筛选耐低温白菜的产品；

A5)白菜辅助育种；

A6)制备白菜辅助育种的产品；

所述A0945007157位点是白菜基因组中的一个SNP位点，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为C或G。

进一步地，所述的应用中，所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述A0945007157位点在内的白菜基因组DNA片段的PCR引物；

D2)所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质可为含有所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

进一步地，上述的应用中，所述PCR引物可为P1或P2：

P1、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中序列1的第22-44位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中序列2的第22-44位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA组成的引物组；

P2、所述PCR引物为由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列2所示的单链DNA和由序列表中序列3所示的单链DNA组成的引物组。

第二个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定白菜低温抗性的方法，所述方法包括检测待测白菜A0945007157位点的基因型，根据待测白菜的基因型鉴定或辅助鉴定白菜的低温抗性，所述A0945007157位点是白菜基因组中的一个SNP位点，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为C或G；所述基因型为CC基因型、GG基因型或CG基因型；所述CC基因型表示白菜基因组中A0945007157位点的核苷酸种类为C的纯合型，所述GG基因型表示白菜基因组中所述A0945007157位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述CG基因型表示白菜基因组中所述A0945007157位点的核苷酸种类为C和G的杂合型；

CC基因型的待测白菜对低温抗性低于或候选低于GG基因型或CG基因型的待测白菜。

第三个方面，本发明提供白菜育种的方法，所述方法包括选择A0945007157位点的基因型为GG或CG的白菜作为亲本进行育种，所述A0945007157位点是白菜基因组中的一个SNP位点，为SEQ ID No.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为C或G，所述GG基因型表示白菜基因组中所述A0945007157位点的核苷酸种类为G的纯合型；所述CG基因型表示白菜基因组中所述A0945007157位点的核苷酸种类为C和G的杂合型。

第四个方面，本发明提供含有上述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质的产品，可为C1)-C3)中任一种产品：

C1)检测与白菜低温抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定白菜低温抗性的产品；

C3)用于白菜辅助育种的产品。

进一步地，所述的产品中，所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述A0945007157位点在内的白菜和/或芜菁基因组DNA片段的PCR引物；

D2)所述检测A0945007157位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

进一步地，所述的产品中，所述PCR引物可为由核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.1的第22-44位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-44位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。

进一步地，上述的产品中，所述PCR引物可为由序列表中SEQID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

本发明中，所述白菜可为白菜与芜菁杂交获得。

进一步地，所述白菜可为大白菜SD与芜菁MRT(Y)的杂交后代，如F

其中，大白菜SD在文献“Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,etal.Evaluating multiple resistance to major diseases in a core set of inbredlines of Brassica rapa at seedling stage[J].Journal of Plant Pathology,2018.100:457–465.”中公开；芜菁MRT(Y)为芜菁材料Melon Red Top自交4代分离获得，芜菁材料Melon Red Top(编号11017)来源于北京蔬菜研究种质资源库。

以上任一所述A0945007157C/G位点为白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第101位核苷酸，A0945007157C/G位点为C/G多态。

以上任一所述耐低温白菜具体可为满足如下描述的白菜：将所述白菜种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，真叶颜色为绿色。

以上任一所述不耐低温白菜具体可为满足如下描述的白菜：将所述白菜种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，真叶颜色为黄色。

本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。

上述育种的目的包括培育或选育耐低温白菜。

所述低温可为-2℃至4℃。

上述应用、方法和产品中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

实验证明，利用本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0945007157C/G位点及其所对应的引物在低温诱导后的选择准确率为100％。由此表明，本发明所提供的分子标记(SNP位点)A0945007157C/G位点及其所对应的引物将有助于耐低温白菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为白菜耐低温性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

本发明基于BSA-Seq获得的位于A09染色体上与白菜低温黄化紧密连锁的主效QTL。开发出1个与白菜低温黄化紧密连锁的SNP标记，通过对F

附图说明

图1为A0945007157C/G位点在待测白菜材料中的基因分型结果图。

图2为基于BSA-Seq获得的位于A09染色体上与白菜低温黄化紧密连锁的主效QTL。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大白菜SD在文献“Tongbing S,Shuancang Y,Zhenping G,et al.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage[J].Journal of Plant Pathology,2018.100:457–465.”中公开,公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明中，芜菁MRT(Y)为芜菁材料Melon Red Top自交4代分离获得，芜菁材料Melon Red Top(编号11017)来源于北京蔬菜研究种质资源库(网址为http://123.127.162.62:9999/Web/index.html)。

本发明的实施例中检测待测植株是否耐低温(即低温处理后是否黄化)的方法为：将待测植株的种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，如果真叶颜色为黄色，待测植株不耐低温(低温黄化)，如果真叶颜色为绿色，待测植株耐低温(低温不黄化)。

实施例1、F

大白菜SD低温不黄化。芜菁MRT(Y)为芜菁材料Melon Red Top(编号11017)自交4代分离获得，经检测为不耐低温(低温黄化)材料。

以大白菜材料SD作为母本、芜菁材料MRT(Y)作为父本进行杂交，获得F

实施例2、低温黄化性状基因定位及SNP分子标记开发

2.1、F

2.2、采用BSA-Seq法在A09染色体上获得1个与白菜低温黄化紧密连锁的主效QTL，进一步在此区间内根据重测序获得的SNP位点开发SNP分子标记，最终获得与低温黄化性状紧密连锁的SNP位点A0945007157(序列表序列4中第101位核苷酸)，为C/G多态，将该SNP位点命名为A0945007157位点，如图2所示。

针对A0945007157位点，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，设计引物如下：

上游引物A0945007157C/G-FF(序列表的序列1)：

5'-

上游引物A0945007157C/G-FV(序列表的序列2)：

5'-

下游引物A0945007157C/G-R(序列表的序列3)：5'-GTTAATTATCAAATAGGCTATGAGCAATAAAAGG-3'。

上述SEQ ID No.1与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增序列表序列4中第101位核苷酸为C的片段，用仪器可读取到与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；

上述SEQ ID No.2与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增序列表序列4中第101位核苷酸为G的片段，用仪器可读取到与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。

上述上游引物最后一位核苷酸C/G对应A09染色体上第45007157位(C/G)的SNP位点，即序列表序列4中第101位核苷酸。

实施例3、A0945007157C/G位点在鉴定白菜低温诱导后叶片黄化和不黄化材料中的应用

3.1、DNA提取

常规CTAB法分别提取表1中190种待测白菜材料的基因组DNA。

190份材料为亲本SD(表1中P

琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。

3.2、竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程(基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程)进行。所用试剂除特殊说明外均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B。反应在1536微孔板中进行。

具体步骤：首先利用K-pette分液工作站将1.5μl模板溶液加入1536孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1μL反应体系，分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。

反应体系：10μM A0945007157A1溶液、10μM A0945007157A2溶液和10μMA0945007157C溶液，依次按照6:6:15体积比混匀，得到引物预混液；2×Master mix(货号为Part No.KBS-1016-011)、引物预混液和水依次按照36:1:36的体积比混匀。其中，10μMA0945007157A1溶液的组成如下：4.82nmol序列表中序列1所示引物加入到482ul的ddH

反应体系的结果见图1。图1中，A代表CC基因型(红色荧光)，B代表CG基因型(绿色荧光)，C代表GG基因型(蓝色荧光)。

CC基因型表示白菜基因组中A0945007157位点的核苷酸种类为C的纯合型；GG基因型表示白菜基因组中A0945007157位点的核苷酸种类为G的纯合型；CG基因型表示白菜基因组中A0945007157位点的核苷酸种类为C和G的杂合型。

CC基因型带有FAM荧光标记，显示红色荧光；GG基因型带有HEX荧光标记，显示蓝色荧光，CG基因型显示绿色荧光。

结果显示分型效果良好，该引物能有效鉴定供试植株基于SNP位点的基因型为CC基因型、GG基因型还是CG基因型。

大白菜SD(表1中表示为“P

3.3、低温诱导后黄化情况检测

按照下述方法，检测表1中190种待测白菜材料是否耐低温(即低温处理后是否黄化)。将待测植株的种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，如果真叶颜色为黄色，待测植株不耐低温(低温黄化)，如果真叶颜色为绿色，待测植株耐低温(低温不黄化)。

结果见表1。

综合表1中的结果，可得到如下结论：若待测白菜A0945007157位点的基因型为CC基因型(表1中表示为C：C)，则待测白菜不耐低温(低温诱导后叶片黄化)；若待测白菜A0945007157位点的基因型为GG基因型(表1中表示为G：G)或CG基因型(表1中表示为C：G)，则待测白菜耐低温(低温诱导后叶片不黄化)。

在144份表型为低温诱导后叶片不黄化的材料中，分子标记鉴定A0945007157C/G位点为GG纯合的材料有37份，杂合C/G位点的有107份,鉴定准确率为100％。在43份表型为低温诱导后叶片黄化的材料中，A0945007157C/G位点全部为CC纯合，鉴定准确率为100％。本发明方法的平均鉴定准确度为100％。

表1.为187份F

上述结果表明，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜低温诱导后叶片是否黄化。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 白菜A09染色体上与叶片低温黄化相关的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tacttgagga agaagaagcc aagc 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tacttgagga agaagaagcc aagg 44

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttaattatc aaataggcta tgagcaataa aagg 34

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 白菜(Brassica rapa)

<400> 4

tacaatttat gttgtttcaa tggcaaggta gggatataag cctacatgga cactataaaa 60

ttataataga agactctgac ttgaggaaga agaagccaag saccatgcta ccttttattg 120

ctcatagcct atttgataat taactattct aattaaggtg ttgattggtt aaaacctgtc 180

caagtacatc tcaagctctt t 201