紫花苜蓿品质性状相关的SNP分子标记及其应用

摘要

本申请提供了紫花苜蓿品质性状相关的SNP分子标记及其应用，本申请提供的SNP分子标记包括表1中所示的SNP位点。利用本申请提供的SNP分子标记能够实现从基因水平筛选具有目标性状基因型的紫花苜蓿，显著相关的SNP分子标记可用于分子标记辅助育种，从而有效提高选择效率，有利于加速育种进程。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及紫花苜蓿与品质性状相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上种植面积最大，分布范围最广的优质、高产豆科牧草，被誉为“牧草之王”。苜蓿不仅产草量高，而且富含维生素、矿物质等营养成分，又是高蛋白饲草，其蛋白质含量高达18%以上，是奶牛等草食动物重要的饲草来源。苜蓿的品质性状是备受关注的重要农艺性状，了解紫花苜蓿品质相关性状的遗传基础，将有利于苜蓿的分子遗传改良，为培育高产优质的苜蓿新品种奠定基础。

苜蓿的品质性状既受遗传因素的影响，又与环境条件有密切的关系，如干旱胁迫会导致苜蓿的粗蛋白含量下降，土壤中的重金属胁迫如镉胁迫对苜蓿氮代谢具有不利影响，进而降低苜蓿粗蛋白含量，田间管理也对品质性状产生影响，有研究指出施用合理氮磷钾配比的肥料可以明显提高苜蓿的品质。但遗传因素是苜蓿品质性状改良的基础，苜蓿新品种的培育必须从分子水平进行选择，获得具有目标性状的基因型，才能为新品种的培育提供重要的原始材料。

目前，紫花苜蓿干草品质的优劣是通过营养成分的含量及被家畜吸收利用的效率来评定。苜蓿的营养成分主要包括常规养分分析划分的六大营养物质：水、无氮浸出物、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、灰分，对于粗纤维又分为中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）。国际上常以相对饲用价值（RFV）为标准来评价饲草营养价值，该指标反映的是动物采食饲草中可消化物质的量，可通过饲草干物质采食量（DMI）和饲草中可消化物质（DDM）计算得到，具体函数关系为：RFV=(DDM×DMI) / 1.29；DDM=88.9-0.779×ADF（%）；DMI=120 / NDF（%）。该函数体现了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量对相对饲用价值有重要的影响。

紫花苜蓿品质性状的遗传改良必须经过表型筛选与评价获得优异的种质资源，应用传统的方法筛选优异种质材料，不仅费时、费工，而且由于实验的误差和环境条件的局限性，对苜蓿材料的选择具有一定的盲目性。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请提供了紫花苜蓿品质性状相关的SNP分子标记及其应用。具体地，本申请采用SNP分子标记和群体表型相结合的方法，定位与目标性状显著关联的SNP位点，实现了从基因水平筛选具有目标性状基因型的有效方法，显著相关的SNP分子标记可用于分子标记辅助育种（MAS），能够有效提高选择效率，有利于加速育种进程。

在第一方面，本发明提供了紫花苜蓿品质性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括表1中所示的SNP位点。

表1

根据本申请的一些实施方式，所述SNP分子标记还包括表2中所示的SNP位点中的至少一种。

表2

本申请中的紫花苜蓿为同源四倍体紫花苜蓿，其染色体包括8个同源组，分别为1号染色体组、2号染色体组、3号染色体组、4号染色体组、5号染色体组、6号染色体组、7号染色体组和8号染色体组，每组中有4个等位基因染色体，分别记作A、B、C和D，共32条染色体。表1和表2的SNP位点中，QTL名称代表SNP位点的表型，其中，数字1-8代表同源组染色体的位置，字母A、B、C和D代表相应的同源组染色体中等位基因染色体的位置，CP代表与粗蛋白含量相关的数量性状位点，NDF代表与中性洗涤纤维含量相关的数量性状位点，ADF代表与酸性洗涤纤维含量相关的数量性状位点，lignin代表与木质素相关的数量性状位点，例如，

本发明的第二方面提供了检测紫花苜蓿品质性状的分子探针组合，其包括第一方面所述的SNP分子标记。

本发明的第三方面提供了检测紫花苜蓿品质性状的基因芯片，其包括第一方面所述的SNP分子标记。

本发明的第四方面提供了检测紫花苜蓿品质性状的试剂盒，其包括根据第二方面所述的分子探针组合或根据第三方面所述的基因芯片。

本发明的第五方面提供了第一方面所述的SNP分子标记或第二方面所述的分子探针组合或第三方面所述的基因芯片或第四方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：

（i）在评价紫花苜蓿品质性状中的应用；

（ii）在紫花苜蓿品种筛选的应用；

（iii）在紫花苜蓿品种鉴定中的应用；

（iv）在紫花苜蓿品种溯源中的应用；

（v）在紫花苜蓿育种中的应用；

（vi）在种质资源保护中的应用；

（vii）在种质资源改良中的应用；

（viii）在紫花苜蓿系谱重构中的应用。

本申请的发明人通过在育种过程中从大量的苜蓿材料中发现了两个不同的苜蓿材料，其表型差异特别大（尤其是花期差异特别大，开花时间大约相差15天），杂交后构建了遗传连锁图谱进行QTL定位。具体地，以杂交后的F

附图说明

图1为根据本申请实施例1的F

图2显示了根据本申请实施例1的父本连锁遗传图谱品质相关QTL分布。

图3显示了根据本申请实施例1的母本连锁遗传图谱品质相关QTL分布。

图4显示了根据本申请实施例1的父本连锁遗传图谱粗蛋白相关上位性QTL。

图5显示了根据本申请实施例1的父本连锁遗传图谱NDF相关上位性QTL。

图6显示了根据本申请实施例1的母本连锁遗传图谱ADF相关上位性QTL。

图7显示了根据本申请实施例6获得的高分辨溶解曲线。

其中，图1中，（a）2016年粗蛋白；(b) 2016年NDF；(c) 2016年ADF；(d) 2016年木质素；(e) 2019年粗蛋白；(f) 2019年NDF；(g) 2019年ADF；(h) 2019年木质素；(i) 2020年粗蛋白；(j) 2020年NDF ；(k) 2020年ADF；(l) 2020年木质素；(m)粗蛋白的BLUP值；(n) NDF的BLUP值；(o) ADF的BLUP值；(p) 木质素的BLUP值；

图2-3中，染色体左侧标尺为标记在连锁遗传图谱上的位置；染色体右侧带有不同形状的区块为品质QTL，2016年环境中检测到的QTL标记为三角形；2019年的标记为圆形；2020年的标记为正方形；利用BLUP值检测到的标记为星形；黑色方框中的QTL为已被前人检测得到；

图4-6中，圆圈分为32个不同深浅颜色的区块表示不同的连锁群；圈中连线连接的是互作的上位性QTL对，线上数字为该上位性QTL对的LOD值，圈上数字为上位性QTL所在连锁群的位置（cM）。

具体实施方式

本申请通过以下实施例详细描述本申请，可使本专业技术人员更全面的理解本申请，但这些实施例并不对本申请的范围构成任何限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 QTL的开发

1、供试材料与方法

（1）供试材料

供试材料为早熟低产苜蓿单株为父本和晚熟高产苜蓿单株为母本杂交获得的F

（2）表型鉴定

F

品质性状的调查分别与于2016、2019和2020年进行。每年5月上旬苜蓿初花期时（苜蓿开第一朵花时）对苜蓿单株进行刈割，地面留茬高度为5cm。刈割后的苜蓿样品于60℃烘箱中干燥24h后用粉碎机粉碎，过1mm筛。随后用近红外光谱分析仪（Foss NIRS 1650）分析苜蓿样品粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）及木质素（Lignin）的含量。利用SAS 9.4 对亲本表型数据进行t-检验和群体数据的正态分布检验（变异范围、均值、标准差、偏度、峰度）及相关性分析，同时利用SPSS 18.0 绘制F

（3）QTL定位

构建了群体连锁遗传图谱。利用IciMapping 复合区间作图（ICIM）的ANOVA模块计算BLUP值（Best Linear Unbiased Prediction，最佳线性无偏估计），采用该值进行跨环境联合分析。利用IciMapping 的ICIM-ADD模块检测加性QTL、ICIM-MET模块检测加性QTL与环境的互作效应，LOD阈值设置为2.5以判断QTL显著性。 利用IciMapping的ICIM-EPI模块检测上位性QTL，LOD阈值设置为5.0。最后利用MapChart对加性QTL结果进行可视化处理。

2、结果

（1）表型分析结果

分别于2016、2019和2020年调查了亲本与F

表3 F

注：**为差异极显著（P < 0.01）。

（2）相关性分析结果

相关分析如表4所示，结果表明：3个纤维素相关性状NDF、ADF及木质素之间表现为显著正相关，相关系数分别为0.68、0.40、0.60（P < 0.01），NDF与ADF间的相关系数最大。粗蛋白与ADF和木质素显著负相关，相关系数分别为-0.49、-0.17（P < 0.01），与NDF则未表现出显著相关性（P > 0.05）。粗蛋白、NDF、ADF、木质素遗传力分别为0.55、0.56、0.55、0.46，遗传力较高，表明遗传对性状影响较大。

表4 相关分析结果及各性状广义遗传力

注：**表示差异极显著（

（3）加性QTL分析

结合各性状表型数据，利用已构建的该群体的连锁遗传图谱进行QTL定位研究。共检测到63个相关QTL，其中2016年、2019、2020年三个环境分别检测到24个、9个、14个加性QTL，采用表型的BLUP值多环境联合分析共检测到16个加性QTL。

如表5和表6所示，定位的18个与粗蛋白含量相关的加性QTL，其中5个由BLUP值检测得到。这些 QTLs解释的表型变异（Percentage of Phenotypic variation Explainedby the QTL, PVE）为2.61% ~ 11.34%。LOD值大于5的有5个，分别为

如表5和表6所示，定位了21个与NDF相关的加性QTLs，采用表型的BLUP值对多环境联合分析共检测到5个加性QTL。这些QTLs解释的表型变异（PVE）为2.18 % ~ 6.27 %。其中LOD值大于5且PVE大于5 %的QTLs有父本图谱上的

如表5和表6所示，定位了14个与ADF相关的加性QTLs，其中2个是采用表型的BLUP值鉴定。这些QTLs解释的表型变异为2.56%-8.73%，其中LOD值大于5 且PVE大于5%的QTL有父本图谱上的

如表5和表6所示，定位了10个与木质素相关的加性QTLs，采用表型的BLUP值对多环境联合分析共检测到5个加性QTL。这些QTLs解释的表型变异为3.01%-14.35%，其中LOD值大于5且表型变异的解释率大于5%的有3个，分别为母本图谱上的

表5 父本图谱QTL定位结果

注：加粗的QTL表示该QTL与其它QTL有共定位；“*QTL”表示该QTL已被前人报道：

表6 母本图谱QTL定位结果

注：加粗的QTL表示该QTL与其它QTL有共定位；“*QTL” 表示该QTL已被前人报道：qCP5A-2、qNDF8B及qADF8B；A: 加性效应；PVE(A): 单个加性QTL表型变异解释率；AE: 加性QTL与当前环境的互作效应；PVE(AE):互作效应对表型变异的解释率。

（4）加性QTL共定位分析

在定位的63个加性QTLs中，共有12处区域存在共定位现象，即与不同性状关联的QTL定位在同一个区域，其中5处分布于父本连锁图谱、7处分布于母本连锁图谱，如图2和图3所示。6D连锁群有3个QTLs定位在同一个区间（23.5-25.5cM），分别为

（5）加性QTL与环境互作分析

为了明晰哪些QTL有受到环境影响及其影响程度，利用IciMapping对加性QTL进行了环境互作分析。结果表明63个品质相关QTL中，有35个存在与环境的互作（表5、表6），其中有18个加性QTL与环境的互作效应（AE）为正（0.10 ~ 0.49），表明环境对其有促进作用，其余17个加性QTL与环境的互作效应为负（-0.04 ~ -0.55），即环境对其有抑制作用。这些互作效应的QTLs对表型变异的解释率大于2% 的有12个，其中解释表型变异最大的是

（6）上位性QTL分析

为了解QTL间的互作效应，利用IciMapping进行了上位性分析。结果共检测到73对上位性QTL（表7、表8）。此前鉴定到的加性QTL未发现与其它QTL具有互作，即73对上位性QTL独立对表型产生影响。这些上位性QTL分布广泛，除了连锁群2B、3B、5A外，其余连锁群上均有检测出上位性QTL。其中，11对上位性QTL与粗蛋白含量相关、8对与NDF相关、17对与ADF相关、37对与木质素含量相关，这些上位性QTL对的PVE最小为1.08%，最大为 14.06%。PVE大于5%的共有21对，而大于10%的有3对，分别与粗蛋白、NDF和ADF相关、其PVE分别为10.27%、11.18%和14.06%（图4、5、6）。此外，还发现有43个上位性QTL对即有互作的两个上位性QTL处于同一连锁群的相邻位置，这有利于在相应QTL区域内挖掘相关性状的候选基因。

表7 父本连锁图谱上位性QTL分析结果

注：加粗QTL表示与其它QTL具有共定位；AA：上位效应，正值表示亲本型效应大于重组型效应，负值表示重组型效应大于亲本型效应； PVE(AA): 上位性QTL的表型变异解释率。

表8 母本连锁图谱上位性QTL分析结果

注：加粗QTL表示与其它QTL具有共定位；AA：上位效应，正值表示亲本型效应大于重组型效应，负值表示重组型效应大于亲本型效应； PVE(AA): 上位性QTL的表型变异解释率。

（7）候选基因的筛选与鉴定

为了筛选加性QTL区间内的候选基因，利用加性QTL侧翼标记序列参考蒺藜苜蓿基因组进行了BLAST比对，结果发现：1C连锁群上3个QTLs

表9 候选基因结果

本申请结合高通量测序技术得到的分子标记绘制而成的连锁遗传图谱，利用品质具有显著差异的两个亲本杂交构建的紫花苜蓿F

本申请发现的12个QTL共定位区域分布在6个不同的连锁群上，分析其遗传效应发现共同定位的纤维组分相关QTL都具有相同方向的加性效应，而共同定位的纤维组分相关QTL与粗蛋白相关QTL则有着相反方向的加性效应，如：在连锁群6C上共定位的粗蛋白、NDF、ADF相关QTL，其加性效应分别为0.3391、-0.8079、-0.6446，这表明其同时来源于共同的父本，对粗蛋白及纤维组分表型同时有着相反方向的影响。在紫花苜蓿中下调木质素合成通路基因hydroxycinnamoyl CoA: shikimate hydroxycinnamoyl transferase，能相应降低NDF和ADF的含量，表明这些QTL共定位区域中很可能存在这种多效性的基因。

参考蒺藜苜蓿基因组进行序列比对，本申请共发现了4个已被报道的加性QTL，以新疆大叶紫花苜蓿为参考基因组，在

实施例2 SNP分子标记的开发

（1）待测苜蓿样品基因组DNA的提取

提取方法：依试剂盒说明书（CWBIO Plant Genomic DNA Kit, CoWinBiosciences, Beijing, China)为参考，具体操作步骤如下：

a）取苜蓿嫩叶3-4片（约200mg），放入2 ml 离心管中（提前置入无菌钢珠）。将离心管置于液氮中冷冻后，用磨样机将叶组织打碎成粉末。在离心管中加入400 μl Buffer LP1和6 μl RNaseA（10 mg/ml），涡旋震荡1 min后室温静置10 min，使样品充分裂解。

b）离心管中加入130 μl Buffer LP2，吸打混匀并震荡1 min。将离心管置于离心机以12000 r/min离心5 min，吸取上清液置于新管中，加入1.5倍体积（750 μl）的BufferLP3震荡混匀。

c）将上述溶液转移至有收集管的离心柱中，以12000 r/min离心1 min后倒掉废液。然后在吸附柱中加入500 μl Buffer GW2，以12000 r/min离心1 min，重复操作1次后，倒掉废液。

d）将吸附柱放入新的离心管中室温放置10min晾干，后悬空加入50 μl BufferGE，放置5min后，以12000 r/min离心1min，收集DNA溶液，上述操作均在室温中进行。DNA样品置于-20℃保存。

（2）RAD 文库的构建及测序

DNA样品采用分光光度计（NanoDrop2000）进行定量，然后将DNA浓度调整到50ng/μl用于RAD文库的构建。DNA样品经EcoRI限制性酶消化，然后与特异性条形码P1接头连接。将样品混池后超声波随机截切。利用Qseq100 DNA分析仪分析了剪切后的片段，每个片段的平均长度约400bp。应用PCR纯化试剂盒（AmPure XP Beads）对剪切的DNA片段进行纯化，用试剂盒中包含的dA拖尾模块进行片段末端的修复，然后连接通用接头P2。通过PCR扩增富集DNA片段，并利用AMPure XP Beads PCR纯化试剂盒纯化，每个样品经标准化达到10mM，用于上机测序。测序采用Hi-seq X Ten(Illumina)。测序结果已提交到NCBI序列数据存储库（BioProject ID:PRJNA503672）。

（3）序列分析与SNP开发

采用Tassel3.0通用网络分析工具包（UNEAK）进行SNP调用（SNP calling），用蒺藜苜蓿基因组作为参考基因组比对进行基因分型，获得上表1和表2中所示的SNP分子标记位点。

实施例3 检测紫花苜蓿品质性状的SNP基因芯片的制备

基于实施例2获得的SNP分子标记位点，本领域技术人员可以采用任意方式制备检测紫花苜蓿品质性状的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，本发明不作限制，例如Illumina公司、Affymetrix 公司或者Agilent公司，需要说明的是，基于本发明实施例2提供的SNP位点制备的基因芯片均属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，可以采用Illumina公司的方法制备本申请的检测紫花苜蓿品质性状的SNP基因芯片，该芯片包括一个玻璃基片以及位于基片小孔中的若干个磁珠，所述每个磁珠上偶联有分别检测实施例2获得的表1所示位点和任选的表2所示位点中的至少一个位点的探针，用于检测目标样本，其中，磁珠上偶联在珠子的这一端的23个碱基的序列为Address序列，也是DNA片段的5'端，它是标识微珠的标签序列。离珠子较远端的50个碱基为3'端的序列，成为Probe序列，其与目标DNA进行互补杂交，能够识别实施例2获得的表1和表2所示的位点。

实施例4 SNP检测试剂盒

基于实施例2获得的SNP分子标记位点，本领域技术人员可以采用任意方式制备检测紫花苜蓿品质性状的SNP检测试剂盒，同样也可以委托生物公司制备，本发明不作限制，例如Illumina公司、Affymetrix 公司或者Agilent公司，需要说明的是，基于本发明实施例2提供的SNP分子标记位点制备的检测试剂盒均属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，为了能够使用实施例3提供的基因芯片进行对目标样本进行检测，试剂盒中还包括四种带标记的双脱氧核苷酸、聚合酶和生物素标记的抗链霉亲合素的抗体、和DNP标记的，抗异种抗体FC端的抗体。

当然不同的基因芯片，应当适配相应的试剂，本发明不作限制。

实施例5 应用实施例

（1）从苜蓿育种群体中随机选择192株苜蓿单株作为待测苜蓿样品，样品基因组DNA的提取采用上述方法。提取方法依据DNA提取试剂盒说明书，具体如实施例2所示。

（2）检测引物设计及PCR反应体系

采用Primer5.0引物设计软件，根据表1中的QTL的左右侧标记序列设计引物，在测序公司合成引物。然后将引物加入到PCR的反应体系中，反应体系总体积为5μl，其中5ng样品基因组DNA，0.25 μM引物，1×Master Mix，终体积达到5 μl，最后加10 μl的矿物油。

PCR反应程序：95℃变性2 min；然后94℃、30秒、57℃(退火温度可根据实际设置)、30秒，45个循环，运行结束后4℃保存。

（3）基因型分析及突变位点的筛选与鉴定（基因型分析还可以通过对PCR产物进行测序分析，确定突变位点的碱基）

PCR扩增产物被转移到高分辨率溶解曲线（HRM）分析系统中进行检测。HRM分析系统主要型号有LightScanner、Lightcycler480、Rotor-gene6000等，该系统具有精确的温度控制技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用高分辨的饱和荧光染料LC Green，使该仪器具有较高的灵敏度和特异性，5分钟即可完成96/192/384个PCR产物样品的突变检测，适用于大规模突变筛查及基因分型分析。

PCR扩增产物经仪器校准器校准后获得峰值读数，获得基因型结果，确定所标记的单碱基突变位点。结果发现，本实施例检测了192个样本中与粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、ADF代表与酸性洗涤纤维（ADF）和木质素（lignin）相关的SNP位点，结果表明，约46%的样本中出现了相关的位点突变，以与粗蛋白含量相关QTL位点

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。