基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选

摘要

蜜蜂白垩病（chalkbrood disease）是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的蜜蜂幼虫死亡的真菌性疾病，该病已蔓延至世界各地.长期以来，人们对蜜蜂抗白垩病的机制进行了深入研究，取得了诸多进展，但大多研究集中在行为水平和生理水平，而对培育抗白垩病蜂种最为重要的分子机制方面的研究甚少，对蜜蜂抗白垩病相关的关键基因未见报道，因此，开展蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记的研究，具有重要的科学意义和应用前景.
　　本研究采用20个患白垩病蜜蜂黑色干尸混合50g花粉粉碎，用蜂蜜混和制成条状花粉饼对患白垩病和健康意蜂蜂群进行人工接种感染，发现它们在接种前后患病个数差异显著（2012年P=0.0227，2013年P=0.0005）;不同组的蜂群之间在接种感染前后患病个数差异均显著（P=0.0238和P=0.0211，2012年），证实了不同蜂群抗白垩病能力确实存在显著差异.采用封盖子脾冷冻法检测了5群意蜂蜂群的清理能力，发现蜂群内幼虫的患病个数与清理率呈显著负相关(P=0.0187)，说明蜂群清理能力越强，患白垩病的幼虫个数越少.
　　采用蜜蜂球囊菌孢子接种3日龄幼虫的方法来检测蜜蜂幼虫抗白垩病能力，结果表明不同群的蜜蜂幼虫抗白垩病能力差异显著(2012年P=0.0006，2013年P=0.0005)，且幼虫抗病能力和蜂群整体抗病能力呈正相关性.收集强抗病幼虫个体（6只）和易感病幼虫个体（6只），作为SNP重测序的样本.提取DNA并建立DNA文库之后，获取了高质量的测序数据，将干净序列与蜜蜂参考基因组进行比对和SNP注释.最终，我们获取位于mRNA的与蜜蜂抗白垩病相关的SNP位点696个，与蜜蜂易感白垩病相关的SNP位点102个.通过进一步的基因过滤筛选，我们一共筛选出71个与蜜蜂幼虫抗白垩病性状密切相关的SNP位点，并对编码边缘糖基转移酶，白介素-1，多抗药性蛋白，王浆主蛋白-5等物质的SNP位点进行了分析讨论，这些研究结果为蜜蜂抗白垩病分子辅助选育提供了宝贵的分子标记.

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第1章 文献综述

1．1 白垩病的病原体生物学

1．1．1 白垩病的病因和传播机制

1．1．2 白垩病的发病原理、症状和鉴定方法

1．2 白垩病的流行病学

1．3 蜜蜂抗白垩病的机制

1．3．1 行为机制

1．3．2 生理机制

1．3．3 分子机制

1．4 SNP技术及其在蜜蜂领域的应用

1．4．1 SNP技术在蜜蜂进化方面的应用

1．4．2 SNP技术在蜜蜂疾病方面的应用

1．5 研究意义和创新点

1．5．1 研究意义

1．5．2 研究创新点

第2章 意蜂蜂群和幼虫个体抗白垩病能力的检测

2．1 研究材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 研究样本

2．2 研究方法

2．2．1 组织实验蜂群

2．2．2 意蜂抗白垩病能力的检测

2．2．3 意蜂清理能力的测定

2．2．4 蜜蜂幼虫抗白垩病能力的测定

2．3 研究结果与分析

2．3．1 意蜂的抗白垩病能力测定

2．3．2 意蜂清理能力的测定

2．3．3 蜜蜂球囊菌的鉴定

2．3．4 意蜂幼虫抗白垩病能力的测定

2．4 讨论

2．4．1 蜂群实验结果

2．4．2 蜜蜂球囊菌的鉴定结果

2．4．3 蜜蜂幼虫抗白垩病能力测定的结果

第3章 蜜蜂抗白垩病分子遗传标记的筛选

3．1 研究材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 研究样本

3．2 研究方法

3．2．1 抗白垩病和易感白垩病蜜蜂幼虫个体的收集

3．2．2 蜜蜂幼虫个体DNA的提取

3．2．3 DNA文库的构建和高通量测序

3．2．4 干净序列的获取

3．2．5 干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计

3．2．6 12个蜜蜂个体的SNP的检测和注释

3．2．7 与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选

3．3 研究结果和分析

3．3．1 蜜蜂样本的筛选及处理

3．3．2 蜜蜂个体DNA的提取及质量检验

3．3．3 原始数据和干净数据的产量统计

3．3．4 干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计

3．3．5 12个蜜蜂个体的SNP的检测和注释

3．3．6 与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选

3．4 讨论

3．4．1 SNP重测序样本分析

3．4．2 与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选

3．4．3 与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的分子标记的功能分析

第4章 主要结论和后续研究展望

4．1 主要结论

4．2 后续研究展望

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

国际交流及会议