合成透明质酸纳米粒子的方法、以及通过该方法制备的透明质酸纳米粒子

摘要

本发明涉及一种制备交联透明质酸纳米粒子的方法，其包括通过用电子束照射透明质酸水溶液来形成透明质酸的分子间或分子内交联。可以在优化的电子束条件下可再现且一致地合成具有各种纳米尺寸的透明质酸纳米粒子，并且本发明提供了合成的透明质酸纳米粒子作为治疗剂和作为造影剂的用途，所述治疗剂和造影剂用于通过荧光标记确定皮肤渗透性和通过放射标记诊断肿瘤。

说明书

技术领域

本申请要求于2019年1月11日提交的韩国专利申请第10-2019-0003966号的优先权，其全部内容作为本申请的参考。

本发明涉及一种在无需交联剂的情况下制备具有生物相容性的纯交联透明质酸纳米粒子的方法、通过所述方法制备的纳米粒子以及所述纳米粒子的应用。

背景技术

透明质酸是一种与弹性蛋白和胶原蛋白一起构成皮肤细胞的成分，被称为能够每1g储存1000ml水分的保湿剂，已被广泛用作化妆品材料。

需要在体内可用且具有生物相容性的纳米粒子如纯透明质酸水合凝胶用作造影剂以及在体内使用。使用交联的且转化为纳米粒子形式的透明质酸的研究尚处于早期阶段，而不使用交联剂合成纳米粒子的研究鲜见报道。

其间，提供了一种通过用电子束照射透明质酸水溶液来制备纳米粒子的方法(韩国专利注册第10-1893549号)。但是，由于在制备纳米粒子的条件下透明质酸浓度高，不经济，只能制备直径大于100nm的纳米粒子，因此在各个领域的应用受到限制。

发明内容

技术问题

因此，通过认识到常规问题和需求，本发明提供了一种制备生物相容性的纯透明质酸纳米粒子或纳米凝胶的新方法。

本发明提供一种在无需单独的交联剂的情况下即能够在除了有机溶剂之外的水溶液上形成交联透明质酸纳米粒子的方法，并且提供一种能够控制纳米粒子尺寸的方法。

技术方案

一方面，本发明提供用于制备交联透明质酸纳米粒子的方法，其包括通过用电子束照射透明质酸水溶液来形成透明质酸的分子间或分子内交联。

在本发明中，纳米粒子是指尺寸为几纳米(nm，十亿分之一米的材料)至几百纳米的粒子。在本发明中，纳米粒子的特征在于其粒径为1至100纳米，但不限于此。在本发明中，纳米粒子是包括纳米凝胶或纳米水凝胶在内的概念，并且在下文中，纳米粒子、纳米凝胶或纳米水凝胶均用于指本发明的纳米粒子。

透明质酸水溶液是酸性的，并且对于酸性水溶液，在含透明质酸的溶液中还可以包含HClO

在本发明中，透明质酸广泛分布于结缔组织中的细胞-基质中，以在生理条件下形成具有粘性和弹性的溶液，并且是已知对诸如虹膜和视网膜的组织、血管内皮细胞和上皮细胞等具有物理保护作用并提供缓冲作用的细胞外基质的主要成分。在本发明中，透明质酸不受物理性质、形状、大小等的限制，且优选经过灭菌处理。此外，透明质酸可具有5-5000kDa的平均分子量，优选具有5-3000kDa的平均分子量。此外，透明质酸可以药学上可接受的盐的形式使用，其中所述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、钙盐等，优选钠盐。进一步地，也可以使用透明质酸的衍生物，这些衍生物可以特别是通过交联、硫化、酯化或氨基酸结合进行化学修饰的透明质酸。

在本发明中，透明质酸水溶液的pH值可以是1-6，更优选是1-5，进一步优选是1-4，最优选是1.5-3.5。

在本发明提供的透明质酸纳米粒子的制备方法中，透明质酸水溶液的浓度可以是0.05-7％(w/v)，优选是0.1-5％(w/v)。

所述水溶液不包含交联剂和有机溶剂。

在照射电子束后，进一步包括渗析和冷冻干燥步骤。

通过改变电子束的照射剂量控制透明质酸纳米粒子的尺寸，并通过增加电子束的照射剂量减小透明质酸纳米粒子的尺寸。

在本发明提供的透明质酸纳米粒子的制备方法中，电子束可以0.5-300kGy，优选1-250kGy，最优选1-200kGy的照射剂量照射。

在本发明中，电子束的总照射能量强度可以是0.1MeV至5MeV。电子束的总照射能量强度可以优选是0.5MeV至3MeV，最优选是1.0MeV至2.5MeV。

通过调节水溶液的pH值控制透明质酸纳米粒子的尺寸，并通过降低水溶液的pH值增加透明质酸纳米粒子的尺寸。

本发明提供的透明质酸纳米粒子的制备方法可以是直径为100nm或以下的透明质酸纳米粒子、优选直径为50nm或以下的透明质酸纳米粒子、最优选直径为30nm或以下的透明质酸纳米粒子的制备方法。

另一方面，本发明提供了通过所述方法制备的透明质酸的分子间或分子内交联的纳米粒子。

所述纳米粒子的特征是具有溶胀特性的水凝胶。

所述纳米粒子的特征在于具有肿瘤选择性。具体而言，所述纳米粒子的特征在于具有结肠癌或黑色素瘤选择性。

对于结肠癌肿瘤，所述纳米粒子的特征在于具有高8倍的肿瘤-肌肉比(tumor-to-muscle ratio)及1.5倍的肿瘤-血液比(tumor-to-blood ratio)。对于黑色素瘤，所述纳米粒子的特征在于具有高14倍的肿瘤-肌肉比及高3倍的肿瘤-血液比。

另一方面，本发明提供了一种造影剂，其包含用至少一种选自放射性同位素、有机荧光材料、作为无机材料的量子点、磁共振图像造影剂、计算机断层扫描造影剂、正电子断层显像造影剂、超声造影剂、荧光造影剂和变形材料(shape shift material)的标记材料标记的透明质酸纳米粒子。

本发明包括与所述纳米粒子缀合的配体化合物和与所述配体化合物配位结合的放射性同位素。

所述配体化合物的特征是NODA-GA-NH

所述放射性同位素的特征是

另一方面，本发明提供抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶的缀合物。

在本发明中，“缀合物”是指具有相互连接的两种或更多种化合物的化合物。所述连接可以通过非共价键或共价键实现。即，本发明的缀合物是指抗坏血酸和透明质酸通过非共价键或共价键直接或间接地相互连接。优选地，本发明的缀合物可以指抗坏血酸的羟基通过C1至C5烷基与透明质酸的羧基形成键，以通过共价键牢固连接。

在本发明中，“抗坏血酸”是一种由以下化学式1表示的具有抗氧化作用的物质，称为维生素C，是一种水溶性维生素，已用于各种工业应用，包括药物制剂、饲料、抑制黑色素的蓄积、药品及化妆品。然而，抗坏血酸作为一种非常不稳定的化合物，当在制备过程中暴露于热、空气和光时，在氧化条件和热条件下不稳定而失去活性，在分配过程中失去活性，因此其应用上有很大的限制。

<化学式1>

在本发明中，除非另有说明，术语“透明质酸纳米凝胶”是指具有各种链长和电荷状态以及各种化学修饰(包括交联)的透明质酸、透明质酸盐(hyaluronate)或透明质酸(hyaluronan)的所有变体，以及通过将变体交联而具有纳米尺寸的水凝胶。即，所述透明质酸纳米凝胶总体包括具有各种相反离子的透明质酸(如透明质酸钠)的各种透明质酸盐衍生的纳米凝胶。例如，该术语总体包括各种衍生物衍生的透明质酸纳米凝胶，例如氧化，如将-CH

在本发明中，透明质酸纳米凝胶的制备方法没有特别限制，只要所述纳米凝胶是以透明质酸分子为基本单位形成的纳米级水凝胶即可。在本领域中，制备纳米级透明质酸水凝胶的方法是众所周知的，例如可以提及的是使用交联剂的制备方法、使用电子束的制备方法等，但是最优选地，可以通过对上述透明质酸水溶液照射电子束来制备透明质酸纳米凝胶。

在本发明中，抗坏血酸与透明质酸纳米凝胶的缀合物可由以下化学式2表示。

<化学式2>

其中，m是1至5。

在本发明提供的缀合物中，抗坏血酸分子与透明质酸分子的羧酸基团的比率可以是1-5:1，优选是1-4:1，更优选是2-4:1，最优选2-3:1。

在本发明中，抗坏血酸与透明质酸纳米凝胶的缀合物可以根据以下反应式1至3依次制备。

<反应式1>

<反应式2>

<反应式3>

其中，m是1至5。

在本发明的反应式2和3中，可以在反应式2和3反应之后通过交联诱导透明质酸以形成纳米凝胶，并且在根据已知方法或本发明提供的透明质酸纳米凝胶的制备方法制备了纳米凝胶形式的透明质酸之后，也可以应用反应式2和3。

优选地，在本发明的反应式2和3中，在根据已知方法或本发明提供的透明质酸纳米凝胶的制备方法制备了纳米凝胶形式的透明质酸之后，可以应用反应式2和3。

根据本发明的一个实施方案，证实了包含在所述缀合物中的抗坏血酸具有显著改善的稳定性，即使将抗坏血酸置于非常苛刻的条件下之后，抗坏血酸也同样表现出生理活性。因此，本发明提供的缀合物的特征在于改善了抗坏血酸的储存稳定性。

另一方面，本发明提供一种用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的化妆品组合物，其包含作为活性成分的抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶。

此外，本发明提供了一种用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的化妆品组合物，其(基本上)由作为活性成分的抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶组成。

本发明的化妆品组合物中所含的成分除所述活性成分外，还包含通常在化妆品组合物中用作活性成分的成分，例如包括诸如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料的一般辅剂以及载体。

本发明的化妆品组合物甚至可以本领域中通常制备的任何制剂形式制备，并且可以配制为例如溶液剂、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶剂、乳膏剂、洗剂、粉剂、肥皂、含表面活性剂的清洁剂(cleansing)、油剂(oil)、粉底、乳液粉底(emulsion foundation)、蜡状粉底(waxfoundation)、喷雾剂等，但不限于此。更具体地，本发明的化妆品组合物可以制备成软化剂(皮肤)、滋养爽肤水(nourishing toner)(乳液(milk lotion))、滋养霜(nourishingcream)、按摩霜、精华素(essence)、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、喷雾或粉末制剂。

优选地，本发明的化妆品组合物可以是油包水乳膏剂、水包油乳膏剂、水包油精华和水凝胶制剂，最优选的是水凝胶制剂，但不限于此。

当本发明的制剂是糊剂、乳膏剂或凝胶剂时，可以使用作为载体成分的动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等。

当本发明的制剂是粉剂或喷雾剂时，可以包含作为载体成分的乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，特别是在喷雾剂的情况下，另外还包括抛射剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

当本发明的制剂是溶液剂或乳剂时，可以使用作为载体成分的溶剂、增溶剂或乳化剂。例如，所述载体成分包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

当本发明的制剂是混悬剂时，可以使用作为载体成分的液体稀释剂如水、乙醇或丙二醇，助悬剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂、黄蓍胶等。

当本发明的制剂是含表面活性剂的清洁剂时，可以使用作为载体成分的脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

在本发明中，所述组合物可具有抗氧化活性。抗氧化表示一种抑制氧化的作用，在人体中，促氧化剂和抗氧化剂处于平衡状态，但当这种平衡状态因各种因素失衡而偏向于促进氧化时，诱发氧化应激，导致潜在的细胞损伤和病理性疾病。

在本发明的一个实施方案中，证实所述组合物表现出优异的DPPH自由基清除活性。

本文所用术语“美白”是指使皮肤变白，并且是指通过抑制黑色素的合成来抑制或防止黑色素的皮肤色素沉着的所有作用。在本发明中，所述组合物可以抑制酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶是一种含金属的蛋白质，其在活性位点含有一对铜离子，并且酪氨酸酶是参与以下过程的酶：其中在黑色素生成途径中，L-酪氨酸通过羟基化反应转变为3,4-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)，再次氧化为苯丙氨酸-3,4-醌(phenylalanine-3,4-quinen)(多巴醌dapaquinone)，然后通过诸如多巴色素、吲哚-5,6-醌(indole-5,6-quinen)等多种中间体合成为黑色素。

在本发明的一个实施方案中，证实所述组合物以浓度依赖性方式具有酪氨酸酶抑制活性，因此可以看出所述组合物具有美白活性。

在本发明中，所述组合物的特征可在于抑制黑色素的产生。黑色素由黑褐色粒子色素组成，是由黑素细胞中称为黑素体的细胞器生成。黑色素存在于皮肤、毛发、眼睛等中，肤色由黑色素的量决定，黑色素的量越多，则肤色越深。

在本发明的一个实施方案中，证实所述组合物以浓度依赖性方式具有黑色素产生抑制作用，因此可以看出所述组合物具有美白活性。

本文所用术语“皱纹”是指皮肤由于衰退而产生的细纹，可以是由于遗传因素、皮肤真皮中存在的胶原蛋白减少、外部环境等引起。在本发明中，所述组合物的特征可在于促进胶原蛋白的生物合成。胶原蛋白存在于诸如骨骼、软骨、皮肤和肌腱等结缔组织中。当皮肤持续暴露于诸如紫外线等外部刺激时，参与皮肤弹性的胶原纤维被破坏，导致皮肤老化。

在本发明的一个实施方案中，发现所述组合物可以通过以浓度依赖性方式增加胶原蛋白生物合成而表现出皱纹改善作用。

本文所用术语“皮肤老化”示出诸如皮肤弹性降低、光泽减少、皱纹产生、再生减少或严重干燥等症状，并可能是由于时间流逝、外部环境等所致。

在本发明的一个实施方案中，发现所述组合物可以促进成纤维细胞的增殖以改善受损皮肤的再生和弹性。

另一方面，本发明提供了一种用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的食品组合物，其包含作为活性成分的抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶的缀合物。

此外，本发明提供了用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的食品组合物，其(基本上)由作为活性成分的抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶的缀合物组成。

本发明的食品组合物包括所有形式，例如功能性食品、营养补充剂、健康食品和食品添加剂。其类型可以根据本领域已知的一般方法的各种形式制备。

例如，作为健康食品，本发明的食品组合物自身可以制成茶、果汁和饮料形式以饮用，或者通过颗粒剂、胶囊剂和粉剂形式服用。此外，本发明的食品组合物可以与已知具有抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老作用的已知材料或活性成分混合的组合物形式制备。

此外，可以通过将本发明的食品组合物加入饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如水果罐头、瓶装食品、果酱(jam)、橘子酱(marmalade)等)、鱼、肉及其加工食品(如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包和面条(如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖果、乳制品(如黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、蒸煮食品(retort food)、冷冻食品、各种调味品(如豆酱、酱油、调味汁等)中，以制备功能性食品。

本发明的食品组合物的优选含量不限于此，但优选是最终制备的食品总重量的0.01至50wt％。为了以食品添加剂的形式使用本发明的食品组合物，所述食品组合物可以粉末或浓缩物的形式使用。

进一步地，本发明还提供了抗坏血酸与透明质酸纳米凝胶的缀合物在制备用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的药剂中的应用。

此外，本发明提供了一种用于抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老的方法，其包括向有此需要的个体施用有效剂量的包含作为活性成分的抗坏血酸和透明质酸纳米凝胶的缀合物的组合物。

本发明所用术语“有效剂量”是指当施用于个体时，表现出改善、治疗、预防、检测和诊断与抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老相关的疾病或者抑制或减轻与抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老相关的疾病的量。所述“个体”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人在内的动物，也可以是源自动物的细胞、组织和器官。所述个体可以是需要这种效果的患者。

本发明所用术语“治疗”泛指改善与抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老相关的疾病或者与抗氧化、皮肤美白、皱纹改善或皮肤抗衰老相关的疾病的症状。所述治疗可以包括治疗或基本上预防这些疾病，或者改善其病症，并包括减轻、治疗或预防源自疾病的症状或大部分症状，但不限于此。

在本发明中，术语“包括/包含”以与“含有”或“特征在于”相同的方式使用，并且不排除所述组合物或方法中未提及其它组分或方法步骤。除非另有说明，否则术语“由…组成”与“包含”的用法相同，并表示排除其它的元素、步骤或成分等。术语“基本上由…组成”或“基本上包含”是指除了所述组合物或方法范围内描述的成分或步骤之外，还包括不会影响其基本性质的成分或步骤。

有益效果

根据本发明，提供了一种在不使用交联剂和有机溶剂的情况下在水溶液中制备纯透明质酸纳米粒子的方法。根据本发明，通过在优化的电子束下可再现地均匀合成各种纳米尺寸的透明质酸纳米粒子，提供了合成的透明质酸纳米粒子通过皮肤渗透性作为用于肿瘤诊断的造影剂和治疗剂的用途，所述皮肤渗透性是通过荧光标记和放射标记证实的。

附图描述

图1是示例通过用电子束交联透明质酸聚合物来形成透明质酸粒子的示意图。

图2和图3是显示本发明实施例1中透明质酸的粒径分布的图。

图4示例了当用高达100kDa的电子束照射透明质酸(HA3)的0.5％(W/V)水溶液(pH2.0至2.4)时，根据电子束的照射剂量的纳米凝胶的粒径柱状图。

图5是对本发明实施例1的样品中的一种透明质酸纳米粒子的DLS测量结果。

图6是大量合成透明质酸纳米粒子并冷冻干燥后得到的粉末形式的样品的照片。

图7是根据本发明实施例1制备的透明质酸纳米粒子的TEM图像。

图8是示出根据本发明实施例1制备的透明质酸纳米粒子的水凝胶性质的实验结果的照片。

图9是示例通过在本发明实施例2的透明质酸纳米粒子中缀合双官能螯合物NODA-GA-NH

图10是示例用Cu-64放射标记本发明实施例2的透明质酸纳米粒子的过程的示意图。

图11是示例本发明实施例2的用Cu-64放射标记的透明质酸纳米粒子的放射化学纯度结果的图。

图12是分析本发明实施例2的用Cu-64放射标记的透明质酸纳米粒子在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和胎牛血清(FBS)中的稳定性的时间依赖性放射性薄层色谱(Radio-TLC)结果。

图13示例了本发明实施例2的用Cu-64放射标记的透明质酸纳米粒子在正常小鼠中的体内分布验证实验的结果。

图14是通过不同于通常获得合成的透明质酸纳米粒子的冷冻干燥过程的通过用有机溶剂沉淀获得的透明质酸纳米粒子作为最终样品的体内分布验证实验的结果。

图15是使用在本发明实施例2的透明质酸纳米粒子中的结肠肿瘤细胞(CT26)的肿瘤模型中的体内分布验证实验的结果。

图16是使用在本发明实施例2的透明质酸纳米粒子中的皮肤癌细胞(黑色素瘤/B16F10)的肿瘤模型中的体内分布验证实验的结果。

图17是使用用放射性同位素Cu-64标记的透明质酸纳米粒子的肿瘤模型的核医学图像。

图18是示例通过在以缩醛形式保护的抗坏血酸的3位OH基团中结合1-氯-3-碘丙烷、用碘基(I)取代氯基(Cl)以及去除作为保护基的缩醛基团，从而合成抗坏血酸衍生物的过程的图示。

图19是示例用四丁基铵(TBA)基团取代透明质酸纳米凝胶的羧基的过程的图示。

图20是示例通过将用碘基取代的抗坏血酸衍生物与以TBA形式获得的透明质酸纳米凝胶在DMSO溶剂中搅拌约12小时，并向反应溶液中加入丙酮，从而合成粉末形式的与抗坏血酸结合的透明质酸纳米凝胶衍生物的过程的图示。

图21A和21B是通过NMR(图21A)和HPLC色谱图(图21B)证实是否制备了与抗坏血酸结合的透明质酸纳米凝胶衍生物的图示。

图22示例了通过使用HPLC分别分析在50℃放置48小时后透明质酸纳米凝胶衍生物(与抗坏血酸结合的HA-VitC)和抗坏血酸(AA)水溶液以评估稳定性的结果。

图23A和23B示例了评估每种实验物质抑制黑色素生成的能力和抑制酪氨酸酶活性的能力的结果。

图24A和24B是示例通过DPPH分析(图24B)评估每种实验物质的自由基清除能力的结果和通过图表量化所述结果的结果(图24B)的图示。

图25A和25B是评估每种实验物质的酪氨酸酶抑制能力的结果。

图26示例了评估每种实验物质促进成纤维细胞增殖能力的结果。

图27示例了评估每种实验物质对胶原生物合成的影响的结果。

发明实施方式

在下文会参考附图描述本发明的实施方案。本发明可以进行各种修改，并且可以有各种形式，具体实施方案在附图中示例并在本说明书中详细描述。然而，这并非将本发明限制为具体实施方案，并且应当理解，本发明涵盖了在本发明的理念和技术范围内的所有修改、等效物和替代物。在描述每幅图时，类似的编号用于类似的组件。

本申请中所使用的术语仅用于描述具体实施方案，并非意图限制本发明。除非在上下文中另有明确指示，否则单数形式可以包括复数形式。在本申请中，应理解，术语“包括”或“具有”是指存在本说明书中描述的特征、数字、步骤、操作、组件、部件或其组合，但不排除预先存在或添加一个或多个其他特征、数字、步骤、操作、组件、部件或其组合的可能性。

除非另有相反定义，否则本文使用的所有术语(包括技术或科学术语)均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在通用词典中定义的术语应理解为与相关技术领域中的含义相同，除非在本申请中明确定义，否则不应理解为理想的含义或过于正式的含义。

实施例1：根据透明质酸的分子量大小、电子束条件和酸浓度的纳米粒子合成分析

在使用透明质酸的电子束照射实验的情况下，使用以下具有不同分子量的三种透明质酸，在酸性水溶液条件下进行实验。

表1

作为参考，通过先前的研究(韩国专利注册第1893549号)，本发明人确认当将50kGy的电子束照射10kDa的1％(w/v)透明质酸水溶液时，产生380nm的纳米凝胶，并且当将200kGy的电子束照射5％(w/v)的透明质酸水溶液时，产生108nm的纳米凝胶。然而，在其他条件下，未形成纳米凝胶，即使在所述条件下制备的纳米粒子的情况下，也发现由于纳米粒子尺寸较大而在工业应用方面受到限制。

因此，本发明人尝试了一种在酸性条件下对透明质酸水溶液照射电子束以提供纳米凝胶的方法，所述纳米凝胶具有极小粒径，并且能够在较低浓度的透明质酸水溶液条件下同时使用与先前研究相似分子量(8kDa)的透明质酸(HA1)以经济成本制备。

特别地，向下表2所示浓度(w/v％)的HA1水溶液中加入HClO

结果示于下表2中。

如下表2所示，确认了在不同的电子束照射能量下，当使用不同浓度的透明质酸(HA1)并加入额外的酸时，能够合成具有低多分散性指数的粒径为3-4nm的小纳米粒子的条件。

表2

接下来，在HA2的情况下，证实当加入酸A(HClO

表3

接下来，即使在使用HA3的实验中，也证实了当加入酸时生成纳米粒子。其结果示于图4。进一步证实了随着加入的酸的浓度逐渐增加，粒子的尺寸趋于增加，并且证实随着电子束照射剂量的增加，粒子的尺寸趋于降低。

如图5所示，通过DLS证实在实施例1中合成的样品的一个粒子具有8.1nm的尺寸。

如图6的照片所示，大量合成显示出该结果的透明质酸纳米粒子，经冷冻干燥后得到粉末形式的样品。

在以下实验中，通过用100kGy电子束(照射能量为2.5MeV)照射pH2.0的1％(w/v)的HA3水溶液以制备和使用纳米粒子。

(1)纳米粒子的结构分析

对合成的透明质酸纳米粒子进行的研究不仅是为了通过DLS测量纳米粒子的尺寸，而且还是为了通过透射电子显微镜(TEM)直接证实实际合成的纳米粒子的形态学形状。

将2至3滴纳米粒子滴加在涂覆有碳的铜载网上，使用醋酸铀酰(uranyl acetate)进行染色过程，然后在足够的时间充分干燥水分后使用图7所示TEM进行分析。

与DLS的结果一样，证实所述纳米粒子具有约10nm或更小的小尺寸，并证实所述粒子的形状不清楚，但保持大致圆形。

(2)水凝胶特性分析

进行证实合成的纳米粒子是否具有水凝胶的基本溶胀特性的实验，并在不照射电子束的情况下使用纯水和透明质酸进行实验作为对照。

将等量的透明质酸纳米粒子和对照分别溶解在500μL水中，然后用带有分离膜的离心过滤器离心以检查滴在每个管底的水量，为了充分看出其差异，将滴在管下面的水用绿色墨水染色，然后捕获。如图8所示。

当确认结果时，可以证实在通过照射电子束获得的纳米粒子样品中，离心处理后滴至管底部的水量较少，更多的溶液留在上清液部分中。通过这个结果，可以证实通过电子束照射合成的透明质酸纳米粒子比对照更进一步溶胀并具有作为水凝胶的特性。

实施例2：透明质酸纳米凝胶的应用

(1)缀合有造影剂的透明质酸纳米凝胶的稳定性评估

如图9的示意图所示，通过使用NODA-GA-NH

如图10的示意图所示，使用Cu-64进行放射标记，将NODA-GA-透明质酸纳米凝胶加入pH 6.8的缓冲液中，以在适当的温度和时间下与

结果，如图11所证实，确认所述放射化学纯度非常高，几乎为100％，并且与Cu-64进行了极好的标记反应。

在放射标记纳米粒子的稳定性的情况下，通过检测放射性分解进行实验，并通过使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和胎牛血清(FBS)进行的时间依赖性Radio-TLC分析证实纳米粒子的稳定性。

结果，如图12所示，证实了直至1小时和4小时显示出高稳定性，即使是24小时的结果，也同样显示出95％或更高的优异稳定性，因此预期即使在小鼠中也可以充分维持稳定性。

(2)在正常小鼠中的体内分布验证实验

通过使用Cu-64标记的透明质酸(HA)纳米凝胶对正常小鼠进行体内分布验证实验，并进行验证器官分布和体外释放途径的研究。

此后，由于合成的纳米粒子会用于纳米凝胶系肿瘤造影剂的开发和研究，因此计划在所述纳米凝胶充分靶向肿瘤的时间进行实验，因此，注射纳米凝胶，然后通过验证24小时后每个器官的分布情况的方法进行实验。

当确认其结果时，如图13所示，在合成的HA纳米凝胶的情况下，示出肝脏的摄取量最高。

此后，在使用电子束合成HA纳米凝胶的过程中，将特定的酸(HClO

此外，即使对于不同于通常获得合成HA纳米凝胶作为最终样品的冷冻干燥过程的使用有机溶剂沉淀的方法获得的HA纳米凝胶，也进行了体内分布验证实验，如图14所证实，其他器官的摄取水平彼此相似。

使用Cu-64标记反应制成的纳米粒子，在肿瘤模型中进行体内分布验证实验，注射24小时后，确认各器官的分布，并确认肿瘤的摄取量。

首先，当使用结肠肿瘤细胞(CT26)制备肿瘤模型且肿瘤生长为6-8mm的合适大小时，在该肿瘤模型中进行体内分布验证实验。结果，如图15所证实，肝脏显示出最高摄取量4.5％ID/g，其次是肾脏(1.6％ID/g)和脾(1.2％ID/g)的摄取量较高。然而，即使在肿瘤中，与其他器官相比，1.0％ID/g的摄取量也显示出高摄取量，并且证实肿瘤-肌肉比为8.4倍，且肿瘤-血液比为1.9倍，可很好地诊断肿瘤。

此外，使用皮肤癌细胞(黑色素瘤/B16f10)制备肿瘤模型，当肿瘤生长为合适大小的24小时后进行体内分布验证实验。如图16所证实，肝脏、肾脏和脾中显示出高摄取量，但确认纳米凝胶通过肝脏和肾脏在体外释放，且通过肾脏而非肝脏释放的趋势更高，并且确认由于纳米粒子的特性，即使在脾中也显示出高摄取量。接下来，在肿瘤(0.62％ID/g)和淋巴结(0.89％ID/g)中，确认显示出高摄取量，并且证实肿瘤-肌肉比为14.2倍，且肿瘤-血液比为3.2倍，可很好地诊断肿瘤。

通过使用放射性同位素Cu-64标记的透明质酸纳米凝胶对肿瘤模型进行核医学成像研究，证实了在上述进行的体内分布验证实验中尚未确认的详细的器官摄取以及器官的分布和释放，并且证实了对肿瘤的靶向能力。

在核医学成像实验中，使用结肠肿瘤细胞(CT26)。如图17所证实，在透明质酸纳米凝胶的5小时PET图像中，可以看出以与体内分布验证实验相同的方式在肝脏中显示出最高信号，然后确认高摄取量是按结肠和肿瘤的顺序进行。

实施例3：与维生素C结合的透明质酸纳米粒子的合成及其功效评估

(1)与抗坏血酸结合的透明质酸纳米粒子的合成

1)抗坏血酸衍生物的合成

作为有效结合透明质酸和抗坏血酸的方法，确立了通过酯键结合透明质酸的羧基来合成抗坏血酸衍生物的策略。

发现了一种(1-氯-3-碘丙烷，NaHCO

具体而言，通过将1-氯-3-碘丙烷与以缩醛形式保护的抗坏血酸的3位的OH基团结合，用碘基(I)取代氯基(Cl)，并去除作为保护基的缩醛基团，从而合成抗坏血酸衍生物(图18)。

(2)与抗坏血酸结合的透明质酸纳米粒子的合成

将制备的抗坏血酸衍生物与实施例1制备的透明质酸纳米粒子结合。

由于具有羧基的透明质酸纳米粒子不溶解于作为反应溶剂的DMSO中，因此使用四丁基铵(TBA)基团取代的方法。具体地，将含有羧基的透明质酸纳米粒子溶解于水中，逐渐加入TBAOH以调节pH值至pH＝9至10，然后冷冻干燥以制备TBA形式的透明质酸纳米凝胶(图19)。

之后，通过将制备的碘基取代的抗坏血酸衍生物与TBA形式的透明质酸纳米凝胶在DMSO溶剂中搅拌约12小时，然后在反应溶液中加入丙酮，由此获得粉末形式的与抗坏血酸结合的透明质酸纳米凝胶衍生物(图20)。

通过NMR和HPLC色谱图证实是否制备了与抗坏血酸结合的透明质酸纳米凝胶衍生物，如图21A和21B所示。如图21所示，确认了4.9ppm处作为抗坏血酸的1个质子峰和2.1ppm处的丙基连接基的CH

根据NMR分析结果，确认抗坏血酸与透明质酸分子的羧酸的比率为2.5:1。即，确认了透明质酸分子的每2.5个羧基结合了1个抗坏血酸。

(2)透明质酸-抗坏血酸纳米粒子(HA-VitC)的稳定性和功效评估

将抗坏血酸(AA，100μM)和制备的透明质酸-抗坏血酸纳米凝胶(HA-VitC，0.5mg/mL)水溶液分别在50℃放置48小时后，使用HPLC分析热稳定性评估。

其结果示于图22。

如图22所示，确认了抗坏血酸(AA)未随着时间而被氧化，而HA-VitC与抗坏血酸(AA)相比是稳定的(稳定性改善50％或更高)。

(3)透明质酸-抗坏血酸纳米粒子(HA-VitC)的美白、抗氧化和皱纹改善功效的评估

在将每种实验物质给予B16F10小鼠黑色素瘤细胞系处理，并将每种实验物质孵育48小时后，通过黑色素含量测定和细胞酪氨酸酶活性测定来测量美白功效评估。作为对照，使用抗坏血酸、抗坏血酸-2-葡萄糖苷(AA2G)和实施例2中使用的HA1(Oligo-HA)。

实验中使用的物质均在-20℃或50℃放置24小时，然后用于实验。

其结果示于图23。

如图23A和23B所示，将抗坏血酸、AA2G、HA-VitC和低聚透明质酸(Oligo-HA)分别在50℃放置24小时，然后与在-20℃储存的样品比较功效，结果显示在抗坏血酸的情况下，在50℃储存期间美白功效消失，但在HA-VitC的情况下，确认仍以浓度依赖性方式强力抑制黑色素生成和酪氨酸酶活性。

然后，使用DPPH测定评估HA-VitC的自由基清除能力。具体地，将抗坏血酸、oligo-HA和HA-VitC针对图24所示的每个浓度进行处理。然后根据常规已知方法评估自由基清除能力(图24A)，并且量化并示于图中(图24B)。

参考图24A和24B，在透明质酸(Oligo-HA)的情况下，由于其没有自由基清除能力，可以确定HA-VitC的自由基清除能力是由HA-VitC中与HA纳米凝胶结合的维生素C(Vit C)显示的。

特别地，考虑到维生素C在暴露于空气后非常容易氧化然后迅速分解，在本发明的HA-VitC的情况下，确定通过改善维生素C的储存稳定性且同时具有维生素C的作用，其利用率非常高。

接着，根据已知方法评估HA-VitC的细胞酪氨酸酶抑制活性：

细胞系：B16F10小鼠黑色素瘤(第10代)，6孔板，4×10

评估方法：细胞酪氨酸酶活性测定

实验物质处理时间：48小时

实验物质处理浓度：参见图25

其结果如图25所示。

如图25A和25B所示，证实HA-VitC以浓度依赖性方式抑制细胞酪氨酸酶。

然后，根据常规已知方法评估成纤维细胞的增殖效应。

简言之，实验条件如下，且实验物质的类型及每种物质的处理浓度如图26所示：

细胞系：HDF-neo，人原代皮肤成纤维细胞-新生儿(第15代)，24孔板，1×10

评估方法：WST-8测定(Ez-cytox)和Procollagen ELISA(Takara#MK101)

实验物质处理时间：3天，禁食1天，无血清状态

其结果示于图26。

如图26所示，证实了在抗坏血酸、AA2G(AG)和APPS的情况下，几乎没有显示出促进成纤维细胞增殖的功效，但在HA-VitC的情况下，证实了以浓度依赖性方式促进成纤维细胞的增殖。

接着，根据常规已知方法评估HA-VitC对胶原生物合成的影响。简言之，实验条件如下，实验物质的类型及每种物质的处理浓度如图27所示：

细胞系：HDF-neo，人原代皮肤成纤维细胞-新生儿(第11代)，96孔板，3×10

评估方法：Procollagen ELISA(Takara#MK101)

实验物质处理时间：3天，禁食1天，无血清状态

其结果示于图27。

如图27所示，证实在HA-VitC处理组中诱导了最高的胶原生物合成。

工业适用性

本发明提供了一种在不使用交联剂和有机溶剂的情况下在水溶液中制备纯透明质酸纳米粒子的方法。通过在优化的电子束条件下可再现地均匀合成各种纳米尺寸的透明质酸纳米粒子，本发明可以使用合成的透明质酸纳米粒子通过皮肤渗透性非常有用地用于开发用于肿瘤诊断的造影剂和治疗剂，所述皮肤渗透性是通过荧光标记和放射标记证实的，因此本发明的工业适用性非常优异。