一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法

摘要

本发明涉及一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，用醛酮还原酶作为模型蛋白，通过定点插入4‑叠氮基‑L‑苯丙氨酸，得到醛酮还原酶两点突变体；然后，双炔交联剂在微波的作用下，诱导细胞裂解液目标酶蛋白共价组装；通过控制细胞裂解上清液中的蛋白质浓度、突变位点以及交联剂的用量来调控酶蛋白组装体的形貌，得到环状交联酶蛋白。本发明利用蛋白质中非天然氨基酸分子与环辛双炔间的生物正交化学的特异性连接，仅用细胞裂解液就形成了酶蛋白的环状组装；本发明得到的酶蛋白环表现出强大的催化活性、热稳定性以及在模拟胃液和肠液中的消化稳定性，使酶蛋白环在催化和药物递送材料中的应用成为可能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶蛋白环的组装方法，具体地说是涉及一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法。

背景技术

自然界呈现出惊人的复杂组装系统，这些系统由各种原材料组成，特别是各种生物大分子，如蛋白质。这激发了科学家们在实验室中探索和控制生物大分子组装过程的雄心，以作为纳米材料、混合生物催化剂、组织工程主机和药物输送剂的用途。在分子水平上，从下到上组装成有组织的纳米结构将使系统具有新的特性。蛋白质是生物体极为通用的构件，因为它们在自然界中具有复杂的拓扑结构以及广泛的功能。此外，内在的生物利用度、较小的毒性、生物降解性、非抗原性、高营养价值、丰富的可再生资源、对各种药物的非凡结合能力等，也使它们能够成为自下而上构建功能性生物材料的理想构建模块。与简单的DNA分子相比，蛋白质的可编程组装仍处于相对早期的发展阶段，但由于组装结构的复杂性和功能的多样性，它拥有巨大的潜力。

在组装蛋白质方面，获得功能性生物材料的主要任务是操纵蛋白质组装成预定的和有组织的结构。构建和调整组装的蛋白质纳米结构的策略主要取决于对蛋白质的深入研究和对蛋白质与蛋白质之间相互作用的仔细分析和设计，如静电力、氢键等，通过生物技术驱动蛋白质结合。最近，超分子相互作用，如金属配位、宿主客体、静电相互作用、π-π相互作用和氢键，已被探索用于介导蛋白质的组装。超分子化学已经提供了许多非常有用的化学策略来制造蛋白质的组装。基因或化学连接的超分子自组装元素可以用来控制蛋白质自组装过程的热力学和动力学。

然而，蛋白质是由多肽链形成的，可以通过分子内的非共价相互作用折叠成特定的三维形状，并具有形态上的异质性、灵活性和复杂性等特点。这些都是蛋白质结构的重要特征，对复杂的细胞功能至关重要，在许多情况下，也是控制蛋白质聚集过程的顺序和方向的主要障碍。此外，蛋白质结构的不稳定性还部分来源于环境因素，如pH值、温度、离子强度和溶剂选择，这进一步增加了蛋白质操作的难度。这些缺陷使得蛋白质的自组装更具挑战性。利用蛋白质之间的作用力和与超分子的结合进行的蛋白质组装也是不稳定的，而且环境对其有很大的影响。有人提出，溶液的离子强度会导致聚集物的分解。上述蛋白质的组装主要依靠分子间的力量，由于分子间力与共价键相比相对较小，它们受环境的影响很大，因此不稳定。而且它们通过外部条件调节蛋白质聚集体的形状，使其难以用于催化合成的应用。此外，目前许多自下而上的纳米技术的应用，特别是DNA纳米技术，都依赖于对少数目标特征(通常是蛋白质)的定位或显示，其精确度为数纳米；通过自下而上的组装策略，可以设计和构建一个新的高度有序的蛋白质结构；为了实现对蛋白质的完全控制，可以人为地生产具有更高尺寸和更复杂结构的更大的蛋白质超级结构。然而，在精确控制蛋白质组装方面需要克服的一个主要缺点是，蛋白质表面不提供复杂的配体，这些配体可以相互作用，并总是以不可预测的方式组装。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，本发明可以实现酶蛋白的快速精准组装；本发明从细胞裂解液中直接进行共价交联形成的环状组装体，并且通过改变酶链上基团的位置(控制其位点)、浓度以及交联剂的用量能够对酶蛋白形貌进行精准调控；本发明可以提高催化活性和组装的稳定性，实现自我纯化，同时得到的酶蛋白组装体的尺寸可以达到μm级别。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶(AKR)作为模型蛋白，并与两个4-叠氮基-L-苯丙氨酸(p-Azido-L-苯丙氨酸，pAzF)分子结合，得到醛酮还原酶两点突变体；然后，双炔交联剂在微波的作用下用细胞裂解液诱导了共价组装；通过控制细胞裂解上清液中的蛋白质浓度、突变位点以及交联剂的用量来调控酶蛋白组装体的形貌，得到环状交联酶蛋白。

首先，我们利用遗传密码扩展，将两个p-Azido-L-苯丙氨酸(pAzF,4-叠氮基-L-苯丙氨酸)纳入醛酮还原酶(AKR)，产生AKR两点突变体。然后，在孵化和细胞裂解后，使用二炔(sym-Dibenzo-1,5-cyclooctadien-3,7-diyne)双功能交联剂促进的烷基-叠氮环化反应(SPAAC)，在微波辐照下从细胞裂解液中进行蛋白质组装；设定醛酮还原酶与炔基的反应摩尔比以及改变被替代的位点的来调控蛋白组装体的形貌；通过AFM、SEM以及CLSM对蛋白组装体的形貌进行表征。

本发明可以从细胞裂解液中直接进行共价交联形成环状酶蛋白组装体。

作为优选，选取了远离活性中心和活性位点的六个位点，得到了五个不同空间距离的醛酮还原酶两点突变体。

作为优选，醛酮还原酶与双炔交联剂的摩尔比为1：0.8～2。

作为优选，细胞裂解上清液中的蛋白质浓度为5.02mg·mL

作为优选，所述双炔交联剂为5,6,11,12-四氢二苯并[a,e]环辛烯，使用时将双炔交联剂溶解在异丙醇中，使其浓度为0.66mg·mL

作为优选，醛酮还原酶两点突变体分别为AKR-114Y-189Q、AKR-3Y-31Y、AKR-3Y-189Q、AKR-198Y-232W以及AKR-3Y-232W。醛酮还原酶的突变位点的选择要使突变位点远离蛋白活性中心和活性位点并突变为TAG密码子，并且选取的这五个两点的位点之间的空间距离有所不同。

作为优选，微波温度为10℃，微波功率为10W，微波时间为1～7min。

作为优选，使大肠杆菌成为诱导醛酮还原酶基因表达的宿主，并以离心获得细胞沉淀，离心的转数为7000～9000rpm，时间为4～8min，并用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/6～1/4，其中PBS浓度为0.02M，pH为7.0，超声破碎采用冰浴，功率300～500W，破碎时间8～13min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后的可溶性和不溶性部分也通过离心，离心的转数为9000～12000rpm，时间为10～20min，从而分离得到细胞裂解上清液。

作为一个醛酮还原酶，在催化性能上能够用于合成某些药物关键中间体(比如治疗化疗引起的呕吐的药物阿瑞吡坦关键手性中间体3,5-双(三氟甲基)苯乙醇)；另外，本发明中的环状组装体在模拟肠液胃液中展现出了极高的稳定性，故使得其用于药物递送成为可能，尤其是对于催化和口服药物。

本发明使用环辛炔作为交联剂和具有叠氮基团的非天然氨基酸修饰的酶，通过共价键的精准快速组装得到的酶组装体，不仅在形貌上得到了精准的调控，对于酶的稳定性同样也有了很大的提高。在研究中发现，酶聚集体的形态可能与位置的空间距离有关，在分子间低聚的有利条件下，分别考虑远离活性位点的不同位点之间的距离对聚集体形态的影响；本发明选择了五个不同的两点突变体，更为具体的，选择的5个AKR两点突变体具有不同的空间距离，它们之间的距离不断增加。

本发明通过控制突变位点、蛋白质浓度以及交联剂的用量，最终获得了不同形状的酶聚集体。得到的聚合体不仅在形态上高度规则，而且具有催化活性。总的来说，条状聚集体的活性高于环状聚集体，但环状聚集体在稳定性方面表现出更高的性能；环状聚集体的这种不良活性可以通过位点修饰来改善。合理的位点更有利，使聚合体具有更好的活性以及稳定性。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通利用蛋白质分子之间的共价键，仅用细胞裂解液就形成了酶蛋白的带状和环状组装，使蛋白质的组装行为在合适的部位得到精确控制，并且具有很好的催化活性及稳定性；

(2)使用本发明的方法，高度有序的蛋白质结构可以根据想要的模型，通过自下而上的策略来设计和构建；

(3)通过本发明得到的酶蛋白组装体的尺寸可以达到μm级别，相对于很多其他的蛋白组装体(现有的nm级别)来说，在催化当中更加的利于分离；为了实现对蛋白质的完全控制，可以人为地生产具有更高尺寸和更复杂结构的更大的蛋白质超级结构；

(4)本发明代表了向蛋白质的位点和形态控制迈出的重要一步，这为人工构建具有更高尺寸、更复杂结构和功能的大型蛋白质超结构铺平了道路。

附图说明

图1本发明制备过程示意图；

图2本发明中所选取的AKR两点突变体基因位点的三维图谱；

图3本发明不同位点的AKR两点突变体组装后的扫描电镜(SEM)以及共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图；

SEM：A，AKR-114Y-189Q；B，AKR-3Y-31Y；C，AKR-3Y-189Q；D，AKR-198Y-232W；E，F，AKR-3Y-232W；CLSM：G，AKR-114Y-189Q；H，AKR-198Y-232W；细胞裂解液中蛋白质浓度为30mg/ml；微波辐照条件：T＝10℃；t＝3min；P＝10w；AKR突变体与交联剂的摩尔比：A，1：2；B，1：1；C，1：2；D，1：1；E，1：0.8；F，1：1；

图4本发明的不同浓度的AKR两点突变体组装后扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)以及共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图；

细胞裂解液中的蛋白浓度：A，5.02mg/mL；B，16.04mg/mL；C，32.16mg/mL；D，40.20mg/mL；E，60.13mg/mL；F，AKR-3Y-232W：19mg/mL；

G，AKR-198Y-232W环的TEM；H，I，AKR-198Y-232W环的CLSM；微波照射条件，T＝10℃；t＝3min；P＝10w；AKR突变体与交联剂的摩尔比；A-E，1：2；F，1：1.5；G-I，1：1；

图5本发明的不同形貌(AKR带状和环状)酶蛋白组装体的热稳定性效果图；

图6本发明的不同形貌(AKR带状和环状)酶蛋白组装体肠液胃液稳定性效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步的说明，这些实施例并非对本发明的限定，依照本领域现有的技术，本发明的实施方式并不限于此，凡依照本发明公开内容所做出的本领域的等同替换，均属本发明的保护内容。

实施例1

一种精准调控组装制备稳定酶蛋白环的方法，具体包括以下步骤：

(1)使大肠杆菌(MG1655)成为诱导醛酮还原酶基因表达的宿主，并以离心收获获得的细胞沉淀，离心的转数为8000rpm，时间为5min，并用PBS缓冲液(0.02mol·L

(2)将双炔交联剂(5,6,11,12-四氢二苯并[a,e]环辛烯溶解在异丙醇中，浓度为0.66mg·mL

(3)将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中，并在10℃和10W的功率下照射3min；

(4)分离酶蛋白组装体，使用离心的方法，离心的转数为12000xg，时间为10min，并用PBS(0.02mol·L

(5)将得到的酶蛋白组装体在30℃真空干燥箱中过夜干燥，最后得到的干燥的酶蛋白组装体通过SEM、TEM、或CLSM)来表征和确定其形貌。

本发明采用醛酮还原酶(AKR)作为模型蛋白，并与两个p-azido-L-苯丙氨酸(pAzF)分子结合，得到两点突变体；然后，高活性双炔交联剂在微波的帮助下用细胞裂解液诱导了共价组装。实验结果表明，突变点的位置、细胞裂解液上清液中的蛋白质浓度以及交联剂的用量在循环组装中起着重要作用。此外，由此产生的酶蛋白环表现出强大的催化活性及热稳定性，以及在模拟胃液和肠液中对加热和消化的稳定性。因此，通过调节突变位点和裂解液含量，组装的蛋白质可以显示出从带状到环状的独特形态多样性，其过程如图1所示。

实施例2

AKR两点突变体掺入非天然氨基酸的位点对酶蛋白组装体形貌的调控

根据AKR基因的三维图，该基因的活性位点为Asp53，Tyr58，Lys84和His117，选择合适的突变位点需要避开活性中心NADP+以及活性位点。本发明选取了远离活性中心和活性位点的6个位点，然后得到了五个不同空间距离的AKR两点突变体，AKR两点突变体突变位点的三维图谱如图2所示，图2A是该基因的活性位点为Asp53，Tyr58，Lys84和His117，图2B-F分别表示了AKR-114Y-189Q、AKR-198Y-232W、AKR-3Y-31Y、AKR-3Y-189Q、AKR-3Y-232W的基因三维图示以及两个突变位点间的距离。基于不同的AKR两点突变体，在微波辐射的帮助下，用双炔交联剂交联了AKR两点突变体，通过扫描电子显微镜观察交联的形态。两个突变点之间的距离越近，越容易形成环状聚集体，而随着两个突变点之间距离的增加，越容易形成条状聚集体。由于AKR-198Y-232W突变体中两个位点的距离很近，分子间的环化量应该是最大的，然而，这两个突变位点并没有尽可能地靠近对方。当两个位点之间的距离太近时，集群将形成一个不规则的形状。

AKR突变体组装的热力学行为表明，组装过程涉及从原生构象到替代构象的转变。从三维空间图来看，3-189(图2E)的位置也属于一个相对遥远的距离，空间结构上这两个位点的距离与114-189(图2B)相似，它们可以从相反的方向进入。在酶和交联剂的比例为1：2的情况下，带状组装仍然发生在这些AKR突变体上。3-232(图2F)是5个点中最近的两个点的间隔，3-232的不同尺度可以在电子显微镜下观察到，不同位点的AKR两点突变体组装后的扫描电镜以及荧光图如图3所示。当突变体与交联剂的摩尔比仅为1：0.8时，出现了尺寸约为50nm的AKR 3-232聚集体，这可以推断为圆形的组装是由几乎插入的NSAAs促成的。因此，这也提供了一个有效的策略和明确的方向来控制催化和药物共滚释放中的组装形状和形态。对于空间距离本发明中是以AKR-114-189这个位点的距离作为一个标准。当我们的得到的两点的突变体的空间距离与AKR-114-189的空间距离差不多的时候，在交联剂较多的情况下是更加的容易得到条状的组装体；当交联剂较少时，空间距离相对较远的两个位点更容易形成环状(如3-31和198-232)；但是，当交联剂过多时，它们不容易形成规则的形状。当位点太近也不利于形成具有规则形状的酶组装体(如3-232)。空间结构相对接近的位点(如114-189和3-189)在交联剂较多的环境下更容易形成带状的酶聚集体。因此我们通过位点的调控主要是得到了带状和环状的聚集体。

当两点突变体为AKR-114Y-189Q，细胞破碎上清浓度为30mg·mL

本发明中所得到的条状组装体(如图3A)，根据扫描电镜的图可以观察到其尺寸大小大约在1μm～2μm；并且本发明中的环状组装体(如图3D)，根据其扫描电镜图也依然能够观察到存在尺寸大小在1μm的环状组装体。

实施例3

通过不同方法得到的环状组装体

在AKR-114-189的共价组装中引入了浓度影响蛋白质的功能和机制，可以容易组装成棒状、带状和线状。使用不同浓度的酶形成的AKR-114-189组件的SEM、TEM以及CLSM图如图4所示，当分别使用六种不同浓度(5.02mg·mL

因此在本发明方法中，通过调控其位点得到了环状的聚集体，同样的在提高浓度的过程中，也依然观察到了环状的酶蛋白组装体。

实施例4

AKR两点突变体组装得到的环状和带状酶蛋白组装体的酶学性质

本发明方法中测量了该酶蛋白组装体的酶活性。AKR带状的酶活性约为1.191U/mg，与游离的AKR两点突变体相比，不仅没有失去活性，而且还可以进行催化反应。鉴于C端与活性位点的接近，这些差异可能是谷氨酸侧链与底物或活性位点残基相互作用能力的反映。蛋白质内部相对较大的尺寸导致了大量的环状内化，这导致了环状酶聚集体的活性下降，但稳定性却有很大的提高。

AKR带状(AKR-114-189，细胞破碎上清浓度为30mg/mL，酶与交联剂的比例为1：2)和环状组装体在30、40、50和60℃的0.1M PBS中孵化的热稳定性如图5所示，与带状的聚集体相比，环状聚集体具有更高的热稳定性。在60℃加热6小时后，AKR Cyclic-assembly*(AKR-114-189，细胞破碎上清浓度为40mg/mL，酶与交联剂的比例为1：2)和AKR Cyclic-assembly(AKR-198-232，细胞破碎上清浓度为30mg/mL，酶与交联剂的比例为1：1)的剩余活性仍分别为70.4％和74.5％。然而，AKR Banded-assembly只保留了8.2％，这表明循环组装的热稳定性比带状组装高7.0倍以上。蛋白质组装的稳定性通常与组装的成分的内在结构相关联。然而，由此产生的AKR突变蛋白环的强大稳定性是一个新的属性，它来自高阶环状结构，而不是成分蛋白的内在结构。形成环状结构和分子内环化的特殊性，有效地增强了再折叠，从而提高了组装的热稳定性。

实施例5

不同形貌的AKR两点突变体组装在药物递送中的稳定性展示

蛋白质代表了一组具有各种性质的生物聚合物，可用作制备纳米药物给药的原料。由于蛋白质的固有属性(即生物降解性、两亲性等)。由此得到的纳米颗粒可以被认为是多种应用的多功能平台。

本发明还模拟了胃和肠道的环境，并使用胃蛋白酶和胰蛋白酶分解AKR组装制剂，以进一步确定蛋白质组装的稳定性。将AKR带状(AKR-114-189，细胞破碎上清浓度为30mg/mL，酶与交联剂的比例为1：2)装配和AKR环状(AKR-198-232，细胞破碎上清浓度为30mg/mL，酶与交联剂的比例为1：1)装配在37℃的模拟胃酸缓冲液中孵育2h。不同形貌(AKR带状和环状)酶蛋白组装体肠液胃液稳定性效果如图6所示，2h后AKR环状装配的稳定性高于AKR带状装配，2h后环状聚集物的活性保持在原始值的87.1％，约为AKR带状装配的1.7倍。由于肠液环境比胃液环境更复杂，带状组合在肠液环境中的活性显示出明显的下降，2小时后失去了大部分初始活性，而AKR环状组合仍保留了约65％的活性。几何学上的限制可能阻止了蛋白组合物进入胰蛋白酶活性位点，而AKR组合物则在环状结构内。为了形成最大数量的褶皱，螺纹状态对蛋白质集合体是最有利的，这解释了它们比开放二聚体更倾向于形成螺纹状态。这些蛋白质集合体的应用有时会因其有限的热和化学稳定性而受到阻碍。这些酶蛋白结构的强大稳定性为合成化学家提供了在以前不适合生物聚合物的条件下进行合成反应的机会。

本发明通过控制突变位点、细胞裂解上清液中的蛋白质浓度或二者结合最终获得了不同形状的酶聚集体。得到的聚合体不仅在形态上高度规则，而且具有催化活性及很好的稳定性。总的来说，条状聚集体的活性高于环状聚集体，但环状聚集体在稳定性方面表现出更高的性能；环状聚集体的这种不良活性可以通过位点修饰来改善。合理的位点更有利于使聚合体具有更好的活性以及稳定性，并使蛋白质组装在催化和口服药物输送中的应用成为可能。

本发明产生的酶蛋白环表现出强大的催化活性，以及在模拟胃液和肠液中对加热和消化的稳定性。因此通过调节突变位点和裂解液含量，组装的蛋白质可以显示出从带状到环状的独特形态多样性，这表明有序蛋白质组装是一个有吸引力的生物(功能)材料平台。

本发明利用蛋白质中非天然氨基酸分子与环辛双炔间的生物正交化学的特异性连接，仅用细胞裂解液就形成了酶蛋白的环状组装；本发明得到的酶蛋白环表现出强大的催化活性、热稳定性以及在模拟胃液和肠液中的消化稳定性，使酶蛋白环在催化和药物递送材料中的应用成为可能。

上述实施例仅例示性说明本发明的较佳方案，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不超出记载的技术方案的范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。