抗CD20的抗体制剂

摘要

本公开涉及一种抗体制剂，其包括抗CD20的抗体和脯氨酸。

说明书

技术领域

本公开属于生物医药领域，涉及抗CD20的抗体制剂。

背景技术

CD20通常被鉴定为在B细胞表面表达的四跨膜蛋白家族的跨膜蛋白。CD20在大多数B细胞性恶性肿瘤中都有表达，但在pro-B、血浆或造血干细胞上不表达，这使其具有良好的肿瘤特异性。并且，CD20参与钙动员并且可以作为钙离子通道发挥作用。

CD20的表达谱和现有对CD20抗体的了解已经使得CD20成为抗体疗法的目标靶点。本领域中，通常根据功能性质对CD20抗体进行分类。例如，I型抗体特征在于其将CD20分布于脂筏区室的能力，并且当嵌合时，I型抗体可介导补体依赖的细胞毒性(“CDC”)。I型抗体通常本身并不具有有效的促凋亡活性，除非抗体交联。需要交联的I型抗体的实例为利妥昔单抗和2F2。而II型抗体不能将CD20分布至脂筏内。如果嵌合，II型抗体具有有限的CDC活性。II型抗体特征在于其促凋亡活性强。Bly1和GA101为II型抗体的实例。I型和II型CD20抗体可能潜在地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

抗体作为蛋白质大分子，结构复杂，在常见液体制剂中具有不稳定性，容易发生降解。例如，抗体在现有的制剂体系中会发生脱酰胺作用，聚集，沉淀，吸附等。为此，在已上市的抗CD20的抗体制剂体系中通常包含缓冲液、稳定剂和表面活性剂三类物质。但是，目前已上市的抗CD20的抗体制剂体系仍然存在抗体随着时间出现稳定性下降、降解、聚集等问题。

为了使CD20抗体更稳定，需要对传统的制剂体系进行优化及改进，开发出更稳定、合适的抗CD20的抗体的制剂体系。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了一种抗体制剂，所述抗体制剂包括抗CD20的抗体和脯氨酸。

在本公开的一些实施方式中，所述抗CD20的抗体为利妥昔单抗。

在本公开的一些实施方式中，在所述抗体制剂中，所述抗CD20的抗体的量为5～20mg/mL，优选为5～15mg/mL。

在本公开的一些实施方式中，所述抗体制剂还包括表面活性剂。在一些具体的实施方式中，所述表面活性剂选自吐温和/或泊洛沙姆。在一些具体的实施方式中，所述表面活性剂为泊洛沙姆。

在本公开的一些实施方式中，在所述抗体制剂中，所述表面活性剂的量为0.1～0.8mg/mL。在一些具体的实施方式中，所述表面活性剂在抗体制剂中的量为0.2mg/mL。

在本公开的一些实施方式中，在所述抗体制剂中，所述脯氨酸的量为5～50mg/mL。在一些具体的实施方式中，脯氨酸在抗体制剂中的量优选为15～35mg/mL。

在本公开的一些实施方式中，所述抗体制剂还包括1～3mg/mL的谷氨酸。在一些具体的实施方式中，谷氨酸在所述抗体制剂中的量为2mg/mL。

在本公开的一些实施方式中，所述抗体制剂还包括30～60mg/mL的海藻糖。在一些具体的实施方式中，所述抗体制剂包括50mg/mL的海藻糖。

在本公开的一些实施方式中，所述抗体制剂的pH值为4.0～7.0。在一些具体的实施方式中，所述抗体制剂的pH值为6.0～6.5。所述抗体制剂可以通过pH调节剂，例如盐酸或氢氧化钠溶液调节至特定的pH值。

在本公开的一些实施方式中，所述抗体制剂为液体制剂。

另一方面，本公开还提供了本公开的上述抗体制剂用于治疗肿瘤，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的抗体制剂。

又一方面，本公开还提供了本公开的上述抗体制剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

现有的抗CD20的抗体制剂，特别是利妥昔单抗制剂中采用氯化钠、柠檬酸钠、聚山梨酯和缓冲对，pH为6.5的体系。抗CD20的抗体蛋白在该体系中，SEC单峰和nr CE-SDS主峰的纯度下降较快，制剂不稳定。本公开出乎意料地发现，使用含脯氨酸的抗CD20的抗体(例如利妥昔单抗)制剂体系，显著提高了抗CD20的抗体蛋白质的稳定性，且抗体本身的聚集速率下降。

下面提供实施例以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

CD20(Cluster of Differentiation 20)是一种跨膜的33～37kDa的非糖基化蛋白，在正常和恶性B淋巴细胞的表面表达。CD20由四个疏水跨膜结构域、一个细胞内结构域和两个细胞外结构域(大环和小环)组成，N端和C端均位于细胞膜内。目前已发现不同的磷酸化可形成三种CD20异构体(33、35和37kDa)。而且有报道表明，CD20的磷酸化在增殖的恶性B细胞中高于正常B细胞。CD20与B细胞抗原受体(BCR)的膜型IgM(sIgM)存在相互作用，B细胞活化后，BCR-CD20复合物会解离，磷蛋白、钙调素结合蛋白会暂时被招募到CD20，从而参与胞内信号的传导。钙离子流动对细胞的生物学功能有重要影响。钙池可调控钙离子进人(SOCE)，主要是通过钙离子释放激活钙离子(CRAC)通道来提高细胞内的钙离子浓度，是淋巴细胞提高胞内钙离子浓度的主要方式。越来越多的证据表明CD20参与了SOCE，CD20对于胞内钙离子浓度有重要的调节作用。

除在正常B细胞中表达外，CD20还在B细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及涉及免疫疾病和炎症疾病的B细胞中表达，所以CD20抗原成为淋巴癌、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的目标靶点。目前，针对这些疾病的CD20治疗主要有三种方式，包括抗CD20单克隆抗体、CAR-T和双特异性抗体。

本文所用的术语“抗CD20的抗体”可以包括抗CD20的单克隆抗体或多特异性抗体(如双特异性抗体)。在本公开中，所述抗体可以包含能够特异性结合CD20的结构域，包括完整抗体，或具有该特异性结合活性的抗体片段和同源物。

本文所用的术语“利妥昔单抗”为一种抗人CD20的单克隆抗体，可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肉芽肿伴多血管炎(GPA)(韦格纳肉芽肿)和显微镜下多血管炎(MPA)等。目前市场上出售的利妥昔单抗制剂包括罗氏公司的

现将详细地描述本公开的一些实施方式。提供每一实施方式作为解释而非限制本公开。实际上，可以对本公开进行多种修改和变化而不背离本公开的范围或精神，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，作为一个实施例的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。此外，在以下描述中，省略了对公知或常规的结构和技术手段的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。

在本文中：

PS80表示聚山梨酯80，购自Croda(货号：SR40925)；

Polo188表示泊洛沙姆188，购自BASF(货号：50519924)；

Tagg表示开始聚集温度；

nrCE-SDS表示非还原纯度。

实施例1

本实施例比较了CD20抗体(利妥昔单抗)在CD20抗体原研

除了余量的水之外，上述两种制剂的其他组成如下表1所示：

表1.

注：组3的制剂通过用2％盐酸或氢氧化钠调至pH 6.5。

通过将样品放入稳定性实验箱(上海一恒科学仪器有限公司)，来检测组1和组2中的CD20抗体的稳定性，结果如下表2所示。

表2.

*：未鉴定该项目。

从以上结果可以看出，组3含有脯氨酸的利妥昔单抗制剂，在40℃加速4周和下降速率方面，SEC和nrCE-SDS纯度方面均明显优于组1。表明添加脯氨酸提高了抗体蛋白质的稳定性。并且，组3的Tagg值也高于组1和组2，特别是比组1高了4℃，表明脯氨酸提高了蛋白质的热稳定性。

实施例2

本实施例研究了脯氨酸浓度对于利妥昔单抗制剂中的抗体蛋白质稳定性的影响。为此，设计了脯氨酸浓度梯度，考察不同的脯氨酸浓度是否会对抗体蛋白质的稳定性有影响。

各实验组的成分如下表3所示：

表3.

与实施例1所描述的测定抗体蛋白稳定性的方法相同，测定了各组中利妥昔单抗抗体蛋白质的稳定性，结果如表4所示。从表4可以看出，SEC单体及nrCE-SDS主峰在组4～8的样品中的下降趋势基本一致，而且利妥昔单抗抗体蛋白质的稳定性均较好。

表4.

另外，检测了组4～8的样品的Kd值，结果示于下表5中。

表5.

从表5的结果可以看出，Kd值均为正数，表明利妥昔单抗抗体蛋白在这5种制剂中均存在排斥力，胶体稳定性较好。

实施例3

本实施例研究了脯氨酸和谷氨酸的组合对利妥昔单抗稳定性的影响。按照下表6配制了组分或含量不同的制剂。

表6.

通过实施例1中记载的稳定性测定方法，检测了组9中的利妥昔单抗抗体蛋白质的稳定性，结果如下表7所示。

表7.

从表7的结果可以看出，各项检测结果均表明，利妥昔单抗稳定性较好，优于

实施例4：

本实施例中研究了脯氨酸、谷氨酸和海藻糖的组合对于利妥昔单抗稳定性的影响。

按照下表8配制利妥昔单抗制剂。

表8.

通过实施例1中记载的稳定性测定方法，检测了组10中的利妥昔单抗的稳定性，结果如下表9所示。

表9.

从表9的结果可以看出，各项检测结果均表明，利妥昔单抗的稳定性较好，优于原研处方

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求书为准。