技术领域
本发明属于生物领域,具体涉及一种基于DSN酶检测Hg
背景技术
双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease,DSN)是一种新型的核酸酶,已从虾、蟹等生物的消化腺或肝胰腺中成功分离出
众所周知汞是一种有毒的重金属,并且汞产品在人们的生活中随处可见。然而由于工厂污水或废弃的汞产品的处理不当等原因,自然界中就会存在一定量的汞离子,这些汞离子可以通过生物富集作用进入生物体内,进而转化成毒性更高的有机汞,并通过食物链进入人体。因此寻找一种简单、方便、廉价的测量环境中汞离子浓度的方法是很有必要的。
研究表明,汞离子可以与错配的碱基对T-T形成T-Hg
发明内容
在本发明中,将DSN酶与DNA生物传感器相结合,设计了两条带有T-T碱基错配的互补DNA单链,并在其中一条DNA链上修饰上FAM荧光基团以及BHQ荧光淬灭基团形成DNA荧光探针,通过加入不同浓度的汞离子使DNA形成完全匹配的DNA双链,进而被DSN酶水解,其检测结果表现为荧光强度的变化。
具体的,本发明的技术方案如下:
本发明第一个方面公开了一种用于Hg
本发明第二个方面公开了一种DNA生物传感器,包括上述的核苷酸序列组;优选的,所述DNA生物传感器还包括DSN酶。
本发明第三个方面公开了上述的DNA生物传感器在检测Hg
本发明第四个方面公开了一种制备上述的DNA生物传感器的方法,包括:
S1:合成上述的核苷酸序列组;
S2:配制反应体系液,所述反应体系包括0.025-0.3U的DSN酶和核苷酸序列组;
S3:将反应体系液避光孵育0.5-2h,然后加入EDTA-2Na溶液终止反应,即得到DNA生物传感器。
优选的,在S2中,所述反应体系包括0.1U的DSN酶。
优选的,在S3中,避光孵育的反应温度为60℃。
优选的,在S3中,避光孵育的反应时间为1h。
优选的,在S2中,反应体系液为100μl;所述反应体系液包括1×DSN buffer、10nM的T-探针、序列M/序列M4和0.1U的DSN;其中1×DSN buffer包括50mM Tris-Hcl、10mMHEPES、5mM Mg
本发明第五个方面公开了使用上述的DNA生物传感器检测Hg
优选的,在多功能微孔读板机上测量荧光的强度。检测FAM荧光的波长分别为:激发波长494nm,发射波长520nm。由于酶标仪的带宽限制,实际设置值为:激发波长485nm,发射波长530nm。
优选的,Hg
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果:
本发明成功构建了一种基于DSN酶的DNA生物传感器并成功用于Hg
附图说明
图1为本发明实施例中DNA生物传感器检测Hg
图2为本发明实施例中不同浓度的DSN酶测出的荧光强度示意图;
图3为本发明实施例中不同的反应时间测出的荧光强度示意图;
图4为本发明实施例中不同的反应温度测出的荧光强度示意图;
图5为本发明实施例中DNA生物传感器的选择性分析示意图。
图6为本发明实施例中DNA生物传感器的灵敏度分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
试剂和仪器
HEPES(上海碧云天生物技术有限公司),EDTA-2Na、Tris-Hcl(上海生工生物工程股份有限公司),MgCl
Mill-Q纯水仪(≥18.2MΩ,美国Millipore),电子天平(托利多仪器(上海)股份有限公司),Centrifuge 5424R离心机(德国Eppendorf公司),DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),SpectraMax ID3多功能微孔读板机(美谷分子仪器(上海)有限公司),PHSJ-3FpH计(上海精密仪器有限公司),摇床(上海旻泉仪器有限公司)。
实施例1
本实施例公开了一种DNA生物传感器的设计及检测方法。其工作原理如图1所示。
实验中设计的传感器中使用的DNA探针的序列如表1所示。本实验中所有的DNA探针的合成及纯化均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。其中T-探针是在DNA链的5’端修饰了一个6-FAM荧光基团、3’端修饰了一个BHQ-1荧光淬灭基团的DNA序列,而Match(M)是一段与T-探针完全互补的DNA序列,Mis-match-4(M4)则是一段与T-探针有四个碱基错配的DNA序列,错配的碱基对为两个胸腺嘧啶(T),以便于与汞离子形成T-Hg
表1 DNA序列信息
本实验的实验体系为100μl,缓冲液为1×DSNbuffer(含50mM Tris-Hcl、10mMHEPES、5mM Mg
实施例2
本实施例研究不同的DSN酶量对荧光检测结果的影响。具体操作为:
选用了0.025U、0.05U、0.075U、0.1U、0.2U和0.3U六组不同的DSN酶用量梯度来对相同浓度的DNA探针进行了水解反应。六组试验中除了DSN酶用量不一样之外,其他条件相同。结果如图2所示,在DSN酶的量小于0.1U时,荧光强度随着酶用量的增加而增加并在0.1U处取得最大值,随后当酶的用量继续增加时,荧光强度几乎没有变化,因此,当酶的用量为0.1U时,荧光强度最大,因此,在一些优化的实施例中,我们选用0.1U作为DSN酶的用量。
实施例3
为了使酶和底物充分的反应,我们对酶反应的时间进行了优化,如图3所示,当反应时间小于60min时,荧光强度与反应进行的时间成正比,说明时间太短会造成酶与底物不能充分反应。当反应时间再延长时,反应时的温度可能会对FAM造成影响,使荧光强度有所降低,因此酶反应的优化时间为60min。
实施例4
为了提高酶的剪切效率,我们对实验中酶的反应温度进行了优化,我们设定了从40到70摄氏度的六个温度梯度,其结果如图4所示。在温度小于60℃时,荧光强度强度的大小随着温度的升高而增大,随后当反应温度继续升高时,荧光强度几乎没有变化。从图4中可以看出在温度达到60℃时,酶的工作效率已基本达到最高,因此在酶反应的优化温度为60℃。
实施例5
通过对实验条件的优化,我们在最优条件下我们对传感器的灵敏度以及选择性进行了分析。图5显示了传感器的选择性,可以看出我们设计的传感器在Hg
实施例6
图6显示了实施例1中传感器的灵敏度分析结果。我们分别对不同浓度的Hg
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 基于DSN酶检测Hg2+的DNA生物传感器
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actgatcgaa tgcactctag tctgtcc 27
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggacagacta gagtgcattc gatcagt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactgactt gagtgctttc gttcagt 27
机译: 具有天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶活性的DNA序列和蛋白的用途,用于检测抑制天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物活性的物质以及鉴定具有除草剂作用的物质的方法,该物质可抑制天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物中的氨基甲酸酯转移酶,基于DNA序列表达的测试系统以及天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物的抑制剂
机译: 生物传感器,葡萄糖脱氢酶,氧化还原酶,多肽,组合物或试剂盒,检测靶分子的方法,诊断生物体中疾病或状况的方法,检测装置,分离的核酸,基因构建,宿主细胞和生产方法生物传感器?
机译: DNA生物传感器及其核酸特异性片段的检测方法及DNA生物传感器的应用