乳腺癌脑转移的诊断及预后标志物

摘要

本发明公开了乳腺癌脑转移的诊断及预后标志物。本发明的第一方面，提供定量检测标志物的试剂在制备用于乳腺癌脑转移的诊断、乳腺癌脑转移的预后判断的试剂盒中的应用，标志物包括ADRA2A、ADRB3、HTR7、CHRNA3。根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：包括上述四个基因(或其表达的蛋白质)的标志物与乳腺癌脑转移的复发强相关，因此，可以通过对上述的标志物进行定量检测来对受试者是否发生了乳腺癌脑转移、或对其预后情况进行有效判断。

说明书

技术领域

本申请涉及乳腺癌诊疗技术领域，尤其是涉及乳腺癌脑转移的诊断及预后标志物。

背景技术

乳腺癌是一种较为常见的恶性肿瘤，随着技术的不断发展，乳腺癌的治疗手段逐渐丰富，患者的生存时间和质量有了明显提高，但局部复发和远端转移率仍然较高，乳腺癌的转移部位一般包括骨、肝、肺、脑、胸膜、淋巴等。其中，脑转移的倾向较高。针对乳腺癌患者的脑转移，目前缺乏特定的治疗指南，常规治疗手段以局部治疗作为首选。但即便进行放疗、手术等治疗手段，转移病灶也很容易复发，会快速影响神经功能进而导致死亡。考虑到乳腺癌脑转移的高风险，对患者进行早期的有效评估有助于预测其预后、指导个体治疗。然而，目前用于乳腺癌转移风险评估的标志物大多为单个基因。因此，有必要寻找具有联合诊断价值的乳腺癌脑转移的相关标志物。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有良好的联合诊断价值的乳腺癌脑转移的标志物，定量检测这些标志物的试剂能够用于乳腺癌脑转移的诊断或预后判断。

本申请的第一方面，提供定量检测标志物的试剂在制备用于乳腺癌脑转移的诊断、乳腺癌脑转移的预后判断的试剂盒中的应用，标志物包括ADRA2A、ADRB3、HTR7和CHRNA3。

根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：

包括上述四个基因(或其表达的蛋白质)的标志物与乳腺癌脑转移的复发强相关，因此，可以通过对上述的标志物进行定量检测来对受试者是否发生了乳腺癌脑转移、或对其预后情况进行有效判断。

其中，ADRA2A(Adrenoceptor Alpha 2A，Gene ID:150)为肾上腺素能受体α2A基因，该基因编码的蛋白质是α-2-肾上腺素能受体中的一种。α-2-肾上腺素能受体是G蛋白偶联受体超家族的成员，可抑制腺苷酸环化酶，包括3个高度同源的亚型：alpha2A(即ADRA2A)、alpha2B和alpha2C。它们参与调节神经递质分子从交感神经和中枢神经系统中的肾上腺素能神经元的释放。交感神经系统通过激活心脏、血管和肾脏中的肾上腺素受体来调节心血管功能。小鼠研究表明，从心脏交感神经系统和中枢去甲肾上腺素能神经元释放突触前递质需要alpha2A和alpha2C受体亚型。目前并无明确证据表明α-2-肾上腺素能受体与疾病之间的明确关联。

ADRB3(Adrenoceptor Beta 3，Gene ID：155)为肾上腺素能受体β3基因。该基因编码的蛋白质属于β肾上腺素能受体家族，其通过G蛋白的作用介导儿茶酚胺诱导的腺苷酸环化酶活化。该受体主要位于脂肪组织中，参与脂肪分解和产热的调节。

HTR7(5-Hydroxytryptamine Receptor 7，Gene ID：3363)为5-羟色胺(血清素)受体7基因，由该基因编码的血清素受体属于G蛋白偶联受体的超家族，该基因目前已知是参与自闭症和其他神经精神疾病的候选位点。

CHRNA3(Cholinergic Receptor Nicotinic Alpha 3Subunit，Gene ID：1136)为胆碱能受体烟碱α3亚基基因，该基因编码的蛋白质是烟碱型乙酰胆碱受体蛋白家族的成员。该蛋白质家族的成员是由两个α亚基和一个β亚基、一个γ亚基和一个δ亚基形成的五聚体复合物。而该基因编码其中一个α亚基，含有特征性的相邻半胱氨酸残基。编码的蛋白质是一种配体门控离子通道，可能在神经传递中起作用。已有研究仅表明该基因的多态性与吸烟风险增加和肺癌易感性增加有关。

在本申请的一些实施方式中，标志物还包括HTR3C、CHRNB1中的至少一种。

HTR3C(5-Hydroxytryptamine Receptor 3C，Gene ID：3363)为5-羟色胺(血清素)受体3C基因，该基因所编码的5-羟色胺(血清素)的3型受体的亚基C是一种生物激素，可作为神经递质、激素和有丝分裂原。这种受体在激活后会在神经元中引起快速的去极化反应。

CHRNB1(Cholinergic Receptor Nicotinic Beta 1Subunit，Gene ID：1140)为胆碱能受体烟碱β1亚基基因，该基因编码的蛋白质是烟碱型乙酰胆碱受体蛋白家族的成员。该蛋白质是由两个α亚基和一个β亚基、一个γ亚基和一个δ亚基形成的五聚体复合物。该基因编码其中β亚基。

在本申请的一些实施方式中，试剂在基因水平或蛋白水平上定量检测标志物。在基因水平上定量检测核酸的试剂通过以下方法进行，具体包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、等温扩增反应(如环介导等温扩增LAMP、重组酶聚合酶扩增RPA等)、探针杂交技术、RNA印迹等方法。在蛋白水平上定量检测HTR6蛋白的试剂通过以下方法进行，包括但不限于酶联免疫反应(ELISA)、放射免疫反应(IRA)、免疫组化染色、蛋白质印记、电泳、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)等。

在本申请的一些实施方式中，在基因水平上定量检测标志物的试剂选自引物、探针和基因芯片。其中，引物是指能够特异性扩增上述标志物基因的引物，探针是指能够特异性识别上述标志物基因或者这些基因转录本的探针，基因芯片是指在基底材料(具体包括但不限于聚合物如尼龙膜、硝酸纤维素膜，以及玻璃等)上固定有前述的探针的阵列所形成的复合结构。

在本申请的一些实施方式中，在蛋白水平上定量检测标志物的试剂为抗体。其中，抗体是指能够特异性识别上述标志物蛋白的抗体，具体包括单克隆抗体及多克隆抗体中的至少一种。

本申请的第二方面，提供用于乳腺癌脑转移的诊断或预后判断的试剂盒，该试剂盒包括定量检测标志物的试剂，标志物包括ADRA2A、ADRB3、HTR7和CHRNA3。

在本申请的一些实施方式中，标志物还包括HTR3C、CHRNB1中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，试剂选自引物、探针、基因芯片和抗体。其中，引物是指能够特异性扩增上述标志物基因的引物，探针是指能够特异性识别上述标志物基因或者这些基因转录本的探针，基因芯片是指在基底材料(具体包括但不限于聚合物如尼龙膜、硝酸纤维素膜，以及玻璃等)上固定有前述的探针的阵列所形成的复合结构，抗体是指能够特异性识别上述标志物蛋白的抗体，具体包括单克隆抗体及多克隆抗体中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，当试剂在基因水平上检测前述标志物时，试剂除了引物或探针外，还可以包括核酸抽提试剂(包括但不限于核酸抽提液)、PCR反应试剂(包括但不限于dNTP、Taq酶、缓冲液)、等温扩增反应试剂(包括但不限于重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶)；当试剂在蛋白水平上检测前述标志物时，试剂除了特异性识别标志物蛋白的抗体外，还可以包括酶联免疫反应试剂(包括但不限于酶标二抗、显色液)或其它免疫试剂。

在本申请的一些实施方式中，试剂盒为ELISA试剂盒，例如双抗体夹心ELISA试剂盒、竞争法ELISA试剂盒等。

在本申请的一些实施方式中，试剂盒中的试剂被固定在试纸上，制备成免疫胶体金试纸或其它类似的检测材料，从而提高现场即时检测的效率。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中差异表达基因的热图。

图2是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中差异表达基因的表达情况。

图3是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中四基因表达水平与无复发生存率之间的生存曲线。

图4是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中六基因表达水平与无复发生存率之间的生存曲线。

图5是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中四基因表达水平的时间依赖ROC曲线。

图6是本申请的实施例1中乳腺癌脑转移不同风险分组中六基因表达水平的时间依赖ROC曲线。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

检索Kaplan-Meier Plotter数据库中乳腺癌患者基因表达芯片数据(n＝3951)，分析44种神经递质受体基因表达与乳腺癌复发的相关性，发现34种神经递质受体基因表达与乳腺癌复发强相关。接下来，通过SurvExpress程序(http://bioinformatica.mty.itesm.mx/SurvExpress)对34个受体与乳腺癌脑转移复发相关性进行分析，发现CHRNB1、ADRA2A、ADRB3、HTR7、HTR3C、CHRNA3六个基因联合可对乳腺癌脑转移复发风险进行判断。差异表达基因的热图如图1所示，其中，RISK带的左侧表示低风险组，右侧表示高风险组；Conser带中的浅灰色表示188个个体中有15个人的数据因不全而删失；Time表示个体的生存时间。不同基因的差异表达情况如图2所示，各个基因左侧数据为低风险组，右侧数据为高风险组。结合图1和图2可以看出，HTR7、ADRA2A、CHRNA3、ADRB3这四个基因在乳腺癌脑转移的高风险和低风险组中存在显著的差异表达(p值分别为3.6×10

通过SurvExpress程序对前面检索到的数据进行进一步的分析，验证HTR7、ADRA2A、CHRNA3、ADRB3四基因联合的表达水平以及HTR7、ADRA2A、CHRNA3、ADRB3、HTR3C、CHRNB1六基因联合的表达水平对乳腺癌脑转移患者的无复发生存率之间的关系，结果如图3和图4所示。其中，图3是四基因联合的结果，图4是六基因联合的结果，图3和图4中下方曲线表示高风险组，上方曲线表示低风险组。图3中HR(Hazard ratio)＝3.98，p＝0.01884；图4中HR＝10.93，p＝0.001927。可以看出，高风险组的无复发生存时间显著低于低风险组。四基因联合和六基因联合所组成的标志物与乳腺癌脑转移的复发风险都有较强的相关性，但六基因联合对于患者进行复发的高、低风险组区分显然更准确，诊断和预后的价值更高。

利用上述数据以NNE(Nearest Neighbor Estimation)法通过SurvExpress程序绘制不同时间截点的时间依赖型ROC曲线，分别如图5和图6所示。其中，图5是四基因联合的时间依赖性ROC曲线，图6是六基因联合的时间依赖性ROC曲线。从图中可以看出，两者对于时间在10～100月(t＝10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)内的下面积AUC值均在0.7以上，同时，相同时间条件下六基因联合的AUC值要更高，表明基于六基因的预后模型的预测性能要更好。其中，图6中t＝10时，AUC值可以达到0.925。因此，本申请实施例所提供的四基因或六基因联合作为标志物预测乳腺癌脑转移的风险和预后的准确性较高。

实施例2

从医院就诊的病例中选择经病理学诊断为乳腺癌、经影像学证实为脑转移，并排除男性乳腺癌、合并其它部位原发肿瘤、合并其他严重器质性病变、接受过放疗或化疗的患者的乳腺癌组织样本检测实施例1中六个基因的表达水平，并作为数据集按照7：3的比例随机分配到训练集和测试集，进行LASSO回归分析，得到风险评分的线性回归模型，根据模型的风险评分设定阈值将患者分为高风险组和低风险组，采用ROC曲线验证模型的辨别能力并对模型进行调整，最终得到风险评分模型N＝w1×HTR7+w2×ADRA2A+w3×CHRNA3+w4×ADRB3+w5×HTR3C+w6×CHRNB1以及对应的风险评分阈值。w1～w6为各个基因对应的参数向量值，N为风险评分。据此采用基因芯片检测受试者的上述六个基因的表达水平，将结果代入上述模型，如果N高于阈值，则表示有较大的风险发生脑转移。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。