NK细胞培养基用添加剂组合物、使用该添加剂组合物的NK细胞培养方法及由此获得的改善皮肤问题用化妆品组合物

摘要

本发明涉及一种用于免疫疗法的自然杀伤(NK)细胞的培养方法，更具体而言，涉及一种NK细胞培养基用添加剂组合物，所述添加剂组合物通过抑制CD4+T细胞而有效地增殖和激活NK细胞；还涉及一种使用所述添加剂组合物而培养NK细胞的方法；和一种由此获得的用于改善皮肤问题的化妆品组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养用于免疫疗法的自然杀伤(NK)细胞的方法。更具体地，本发明涉及一种通过抑制调节性T细胞(Treg)而有效地扩增和激活NK细胞的NK细胞培养基用添加剂组合物、使用该添加剂组合物培养NK细胞的方法和通过该方法制备的用于缓解皮肤问题的化妆品组合物。

背景技术

已知NK细胞在人体的初始机体防御机制和肿瘤免疫中起重要作用。也就是说，NK细胞可以杀死特定的自体细胞、同种异体细胞甚至异源性癌细胞，而无需因主要组织相容性复合体(MHC)的表达所致的免疫获得过程。特别是，NK细胞能够更好地杀死不表达或很少表达I类MHC的靶细胞。因此，NK细胞可以有效杀死大多数不表达MHC的癌细胞，也可以杀死一些病毒感染的细胞和细菌，例如伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。然而，具有如此优异的杀伤癌细胞作用的NK细胞，即使在正常人体中也仅占外周血淋巴细胞的5％～15％。在处于严重癌症阶段的患者中NK细胞的百分比下降至低于1％。因此，在免疫疗法中不进行扩增过程的情况下，使NK细胞有效攻击癌细胞是受限的。

免疫疗法包括：从患者血液中提取出对于治疗癌症而言最重要的免疫细胞，例如自然杀伤细胞(NK细胞)、树突细胞(DC)、B细胞和T细胞，使用几种类型的刺激物使提取出的细胞生长为能够有效作用于癌症的强免疫细胞，并将其注射回患者体内。由于使用的是患者自己的血液，与常规化疗相比，免疫疗法引起的副作用少，并且有施用方法简单易行的优点，因此近年来一直在对其进行积极研究。

NK细胞的培养需要T细胞、尤其是辅助T细胞的帮助。辅助T细胞(也称为辅助性T细胞或Th细胞)是指通过调节白细胞的分化和激活来促进体液免疫和细胞免疫的细胞。辅助T细胞也称为CD4+T细胞，因为它们在表面上表达一种称为CD4的蛋白。CD4+T细胞根据其功能分类为Th1、Th2、Th17和Treg细胞。Th1细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)，以诱导巨噬细胞中的内体和溶酶体融合而形成内吞溶酶体。Th2细胞分泌多种类型的白介素(IL)以使B细胞分化为浆细胞。Th17细胞分泌白介素17(IL-17)以吸引中性粒细胞。Treg细胞，也称为调节性T细胞，不促进免疫应答，而是抑制它，从而维持免疫稳态并阻断自身免疫反应。调节性T细胞(Treg)是免疫系统的组成部分，并抑制其他细胞的免疫应答。这是一项重要的“自我检查”行动，旨在防止免疫系统反应过度。在成功杀死入侵微生物后，调节性T细胞参与停止免疫反应，还参与预防自身免疫病。免疫系统必须能够区分自身和非自身。当免疫系统无法区分自身和非自身时，免疫系统就会破坏体内的细胞和组织，导致自身免疫病。调节性T细胞积极抑制免疫应答，预防自身免疫病等病理性自身免疫。调节性T细胞在分子水平上的工作原理尚未明确阐明。也就是说，没有任何关于调节性T细胞如何执行抑制和调节作用的报道，但有报道称免疫抑制细胞因子TGF-β和白介素10(IL-10)与调节性T细胞的功能有关.

另一方面，当使用各种类型的抗体或细胞因子激活免疫细胞时，调节性T细胞(也称为Treg细胞或Treg)也被激活。然而，激活Treg需要比其他细胞更长的时间。因此，在细胞培养的早期，细胞数量增加很快，但是当细胞培养约8至9天或更长时间时，由于激活的Treg，细胞数量并没有像预期那样增加那么多。这种现象多见于免疫力较弱的癌症患者。由于Treg的作用，这种现象在具有大量Treg细胞并且Treg被激活的患者中越来越明显地被发现。

因此，需要开发一种大规模培养NK细胞的技术，该技术能够大量促进免疫细胞增殖同时使Treg的影响最小化。

发明内容

技术问题

本申请的发明人为解决上述问题进行了深入的研究和努力，从而开发出了一种能够在免疫细胞的培养过程中抑制调节性T细胞(Treg)的活性的技术。结果完成了本发明中公开的发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种NK细胞培养基用添加剂组合物，该组合物能够在NK细胞的培养过程中在特定时期抑制CD4+T细胞、尤其是调节性T细胞(Treg)的活性，从而促进NK细胞的增殖。此外，旨在提供一种使用所述组合物培养NK细胞方法和免疫细胞治疗剂。

本发明的另一目的是提供一种化妆品组合物，其包含具有高浓度的IFN-γ和IL-10的无血清免疫细胞培养基作为活性成分，从而有效治疗炎症并缓解皮肤问题。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含具有高浓度的IFN-γ和IL-10的无血清免疫细胞培养基作为活性成分，该组合物具有消炎作用，从而有效治疗诸如创伤和烧伤等损伤并及治疗皮肤问题。

本发明的目的不限于上述目的，虽然在本节中没有明确提及，但本领域普通技术人员从以下详细说明部分的描述中能够认识到的其他目的均应视为本发明的目的。

技术方案

为了实现本发明的上述目的，本发明的一个方面是提供一种NK细胞培养基用添加剂组合物，所述添加剂组合物包含一种或多种Treg抑制物质作为活性成分。

在一个优选实施方式中，活性成分可以是能够使NK细胞增殖的类固醇。

在一个优选实施方式中，类固醇可以是糖皮质激素。

在一个优选实施方式中，糖皮质激素可包括选自由皮质醇、可的松、泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、乙酸氟氢可的松和乙酸去氧皮质酮组成的组的至少一种。

在一个优选实施方式中，可以用NK细胞培养方法刺激NK细胞培养基中的T细胞之后处理所述添加剂组合物。

在一个优选实施方式中，可以以0.2μg/ml以上的浓度包含类固醇。

本发明的另一方面提供一种培养NK细胞的方法，该方法包括：NK细胞刺激步骤，其用NK细胞刺激物质处理培养有从血液中分离出的外周血单个核细胞(PBMC)的培养基；T细胞刺激步骤，其在NK细胞刺激步骤中刺激NK细胞后，用T细胞刺激物质处理培养基；添加剂组合物处理步骤，其在T细胞刺激步骤中刺激T细胞之后，用NK细胞培养基用添加剂组合物处理培养基，所述添加剂组合物包含一种或多种Treg活性抑制物质。

在一个优选实施方式中，NK细胞刺激物质可以是选自由抗CD16抗体、抗CD56抗体和白介素IL-2、IL-12和IL-18组成的组中的至少一种，所述T细胞刺激物质可以是选自由CD3抗体、抗CD4抗体和抗CD28抗体组成的组中的至少一种。

在一个优选实施方式中，Treg活性抑制物质可以是类固醇并且通过抑制调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性来改善NK细胞的增殖。

在一个优选实施方式中，T细胞刺激步骤可以在培养的第二天进行，添加剂组合物处理步骤可以在培养的第三天进行。

在一个优选实施方式中，添加剂组合物处理步骤可以在培养的第五天或之后进行至少一次。

在一个优选实施方式中，添加剂组合物包含浓度为0.2ug/mL以上的类固醇，并且类固醇溶解在载体或细胞因子1-1溶液中，其中细胞因子1-1溶液如下获得：将IL-12和IL-18溶解在基础溶液中，使得IL-12和IL-18在基础溶液中的浓度分别为0.5-5ng/mL和2-50ng/mL。

在一个优选实施方式中，该方法还可以包括在进行添加剂组合物处理步骤之后培养NK细胞11至16天并收获培养的NK细胞的步骤。

本发明的另一方面提供一种免疫细胞治疗剂，其包含通过一种上述NK细胞培养方法获得的NK细胞作为活性成分。

本发明的另一方面提供一种NK细胞再激活方法，其包括以下步骤：通过上述任何一种NK细胞培养方法培养至少20天后分离或收获、冷冻然后解冻，制备疲惫的NK细胞(exhausted NK cells)；和在细胞因子1-1溶液中培养所制备的疲惫的NK细胞。

本发明的又一个方面是提供一种制备NK细胞培养基组合物的方法，该方法包括以下步骤：在用上述任意NK细胞培养方法将NK细胞培养11天后，分离NK细胞；在细胞因子1-1溶液中培养分离的NK细胞；收获NK细胞并获得剩余的培养基组合物。

本发明的又一方面提供一种用于缓解皮肤问题的化妆品组合物，该化妆品组合物包含通过所述制备NK细胞培养基组合物的方法获得的NK细胞培养基组合物作为活性成分。

此外，本发明提供一种用于治疗皮肤病的药物组合物，其包含通过上述制备NK细胞培养基组合物的方法获得的NK细胞培养基组合物作为活性成分。

有益效果

本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物能够通过在NK细胞培养期间的特定时间抑制CD4+T细胞、特别是调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性来增加NK细胞的增殖率。

此外，本发明的化妆品组合物和药物组合物包含具有高浓度的IFN-γ和IL-10的无血清免疫细胞培养基作为活性成分，从而有效治疗炎症。因此，该化妆品组合物和药物组合物对创伤愈合和皮肤病治疗具有优异的效果。

本发明的这些技术效果不仅限于上述效果。即使上文没有明确提及，本领域普通技术人员从以下具体实施方式的详细描述中能够认识到的效果均视为本发明提供的效果。

附图说明

图1是显示出在用本发明的一个实施方式的NK细胞培养方法培养细胞时细胞数随时间的变化的图。

图2A是显示出在本发明的示例性NK细胞培养方法中使用的培养基的FACS数据的图，图2B是显示出根据比较例制备的培养基的FACS数据的图。

图3A和3B是显示出在培养NK细胞比例约为50％的细胞时在第3天、第5天和第8天用NK细胞培养基用添加剂组合物处理的培养基或未用添加剂组合物处理的培养基的FACS数据的图，其中所述添加剂组合物中类固醇的浓度增加至两倍；

图4A是显示出当仅用细胞因子和抗CD3抗体培养NK细胞时用NK细胞培养基用添加剂组合物处理的培养基的FACS数据的图，图4B是显示出未处理的培养基的FACS数据的图；和

图5A是显示出在通过固定抗CD3抗体的方法进行NK细胞培养期间用NK细胞培养基用添加剂组合物处理的培养基的FACS数据的图，图5B是显示出未处理的培养基的FACS数据的图。

具体实施方式

本发明中所使用的术语仅用于描述具体实施方式，并非意在限制本发明。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”旨在也包括复数形式。还应当理解，本说明书中使用的术语“包括”或“含有”或“具有”表示存在所指的特征、区域、整数、步骤、操作、要素和/或组件，但是这不排除存在或添加一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其组合。

诸如第一和第二等术语仅用于将一个组件与另一组件区分开。例如，在不脱离本发明的范围的情况下，第一组件可以被称为第二组件，类似地，第二组件也可以被称为第一组件。

此外，除非另有定义，本文使用的所有术语，包括技术或科学术语，具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。还应当理解，诸如在常用词典中定义的术语等术语应被解释为具有与相关技术和本发明上下文中的含义一致的含义，而不应被解释为理想的或过于正式的含义，除非在本发明中明确定义。

在本发明中，术语“免疫细胞”包括仅NK细胞和T细胞。“NK细胞”用于指NK细胞和NKT细胞二者，但在某些情况下可意指仅NK细胞。

在描述时间关系时，即，在用“之后”、“后”、“接着”或“之前”来表达时间顺序时，可以存在时间不连续事件的情况，除非使用“立即”或“直接”来表达。

下面将结合附图和优选实施方式来详细描述本发明的技术构成。

然而，本发明不限于在此描述的实施方式并且可以以其他形式实施。在整个说明书中，用于描述本发明的相同附图标记指代相同组件。

本发明的技术特征涉及抑制调节性T细胞(Treg)活性的药物的新用途。特别地，本发明的特征在于一种NK细胞培养基用添加剂组合物，其中该添加剂组合物包含一种或多种调节性T细胞(Treg)活性抑制剂作为活性成分，从而在NK细胞培养期间的特定时间抑制CD4+T细胞、特别是调节性T细胞的免疫抑制活性，以增加NK细胞的增殖。此外，本发明的特征还在于使用该添加剂组合物的NK细胞培养方法、通过该方法获得的免疫细胞治疗剂和培养基组合物。

即，在培养NK细胞时，不仅在其培养开始时而且在培养过程中都需要刺激NK细胞。然而，对于T细胞，最初刺激就足够。因此，当找到如下这种方法时，可以激活或增殖大量的NK细胞：首先用NK细胞刺激物质刺激NK细胞，然后用T细胞刺激物质刺激T细胞以将其激活，激活的T细胞和NK细胞刺激物质然后进一步一起刺激NK细胞，而后立即抑制激活的T细胞中的CD4+T细胞、尤其是调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性。

基于这一事实，本发明提供了调节性T细胞(Treg)活性抑制剂的新用途。根据本发明，使用已知抑制CD4+T细胞、尤其是调节性T细胞(Treg)活性的调节性T细胞(Treg)活性抑制剂来培养NK细胞。

更具体地，类固醇是广为人知的抑制调节性T细胞(Treg)活性的药物，其抑制CD4+T细胞(例如Thl、Th2、Th17和Treg)的活性，从而治疗炎症并消除疼痛。然而，还已知类固醇在长期使用时具有例如降低免疫力等严重副作用。但是在NK细胞培养中，当免疫细胞激活后Treg细胞的激活被类固醇抑制时，NK细胞的增殖和激活并未受到抑制。也就是说，即使在NK细胞培养过程中免疫细胞过度拥挤，免疫细胞也不会干扰NK细胞的激活和增殖。

因此，根据本发明，NK细胞培养基用添加剂组合物包含一种或多种Treg活性抑制物质作为活性成分。

这里，作为所述活性成分，可以使用任何已知的药剂，只要其能够抑制调节性T细胞(Treg)的活性即可。在一个实施方式中，类固醇可用作活性成分。类固醇抑制CD4+T细胞、尤其是调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性，从而影响NK细胞的增殖。通过实验得知，类固醇通过消除免疫系统中调节性T细胞的抑制活性而在一定程度上抑制T细胞的生长。

作为NK细胞培养基用添加剂组合物中所含的类固醇，可以使用能够充当类固醇的任何已知类固醇，但在本发明中可优选使用糖皮质激素。根据一个实施方式，可以使用选自由皮质醇、可的松、泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、乙酸氟氢可的松和乙酸去氧皮质酮组成的组中的至少一种。

在本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物中，可以以0.1μg/ml以上的浓度包含Treg活性抑制物质。通过下文所述的实验例，确认了作为Treg活性抑制物质的实例使用的类固醇对例如激活的NK细胞和Tc细胞等细胞免疫细胞的增殖没有影响。还证实了NK细胞的比例随时间增加。具体而言，当添加剂组合物中的类固醇浓度增加时，由于T细胞的增殖速率受到一定程度的抑制，NK细胞的比例与类固醇的浓度成比例地增加。当用作Treg活性抑制物质的类固醇以低于0.1μg/ml的浓度包含时，抑制CD4+T细胞、特别是调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性的特性没有充分表现出来。通过下文所述的实验例，在以高浓度包含类固醇的情况下，如果浓度超过9μg/ml，则预计对NK细胞培养的影响不会发生显著变化。因此，本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物中所含的Treg活性抑制物质的浓度只要为0.1μg/ml以上，就预期会提供所需的效果。

另外，如已知的，在培养NK细胞时，在培养早期阶段刺激NK细胞之后，需要借助于经刺激的T细胞来充分激活NK细胞。因此，在培养NK细胞的过程中，可以在刺激了NK细胞培养基中的T细胞之后使用本发明的添加剂组合物。以此方式，在培养NK细胞时，当在刺激了NK细胞培养基中的T细胞后的适当时间使用本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物时，可以有效地提高Tc和NK免疫细胞的增殖速率，尤其是NK细胞的增殖速率。

接下来，本发明的NK细胞培养方法包括：NK细胞刺激步骤，其用NK细胞刺激物质处理培养有从血液中分离出的外周血单个核细胞(PBMC)的培养基；T细胞刺激步骤，其在NK细胞刺激步骤中刺激NK细胞后，用T细胞刺激物质处理培养基；以及添加剂组合物处理步骤，其用NK细胞培养基用添加剂组合物处理培养基，所述组合物包含一种或多种Treg活性抑制物质。在进行添加剂组合物处理步骤之后，该方法还可以包括将NK细胞培养11至16天后收获NK细胞的步骤。

这里，NK细胞刺激物质是选自由抗CD16抗体、抗CD56抗体、IL-2、IL-12、IL-18组成的组中的至少一种，T细胞刺激物质是选自由抗CD3抗体、抗CD4抗体和抗CD28抗体组成的组中的至少一种。

更具体地，在培养NK免疫细胞时，用例如抗CD16抗体和抗CD56抗体等NK细胞刺激物质刺激NK细胞，并且用IL-2刺激和激活Thl细胞。此外，被例如抗CD3抗体等T细胞刺激物质刺激和激活的Th1细胞又刺激和激活NK细胞和Tc细胞。具体而言，当以IL-12、IL-18、抗CD16抗体和抗CD56抗体刺激时，NK细胞被激活并得到良好培养。然而，当用抗CD3抗体等刺激时，所有T细胞都被刺激。因此，调节性细胞(Treg)和体液免疫细胞(例如Th2细胞)也受到刺激。这些细胞对NK细胞的激活和增殖没有帮助。特别是，由于Treg细胞会干扰NK细胞的激活和增殖，因此当Treg细胞失能时，NK细胞的增殖速率会增加。

在抑制调节性T细胞(Treg)活性的药物中，有几种类固醇药物抑制T细胞、尤其是Treg，因此如果在正确的时间使用得当，它们可以有效地用于培养自然杀伤细胞。其在培养的第二天进行，而添加剂组合物处理步骤可以在培养的第三天进行。也就是说，在NK细胞培养的第0天和/或第1天，用NK细胞刺激物质处理来刺激NK细胞，在培养的第2天，用T细胞刺激物质(例如抗CD3抗体、抗CD4抗体或抗CD28)处理T细胞。在通过刺激激活Tc和NK细胞后，在培养的第三天用本发明的含类固醇的添加剂组合物进行处理，这抑制了CD4+T细胞、特别是调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性，因此NK细胞等增殖和/或激活，但不表现出抑制活性。此外，添加剂组合物处理步骤可以在培养5天后进行多于一次。

如上所述，通过实验例证实，当CD4+T细胞、特别是调节性T细胞(Treg)的活性被本发明的NK细胞培养方法抑制时，NK细胞的比例与不使用添加剂组合物进行处理的情况相比显著增加。

另一方面，在本发明的NK细胞培养方法中使用的添加剂组合物包含浓度为0.1ug/mL以上的Treg活性抑制物质。根据一个实施方式，类固醇溶解在细胞因子1-1溶液或载体中。细胞因子1-1溶液含有浓度为0.5-5ng/mL的IL-12和浓度为2-50ng/mL的IL-18，细胞因子1-1溶液是通过将IL-12和IL-18溶解在基础溶液中制备的。基础溶液(以下称B溶液)包含IL-2、L-谷氨酰胺和细胞培养基。

接着，本发明的免疫细胞治疗剂包括用上述NK细胞培养方法获得的NK细胞作为活性成分。本发明的免疫细胞治疗剂可以通过将NK细胞导入例如生理盐水等载体中而制成的林格氏形式施用至患者体内。免疫细胞治疗剂还可包括不影响NK细胞但对治疗患者的疾病有效的已知成分。这里，患者可以包括哺乳动物，包括人类。

另外，本发明的NK细胞再激活方法是一种提高活力降低的NK细胞的滴度的方法。在本文中，活力降低的NK细胞被称为疲惫的NK细胞。疲惫的NK细胞是指用上述NK细胞培养方法培养超过20天后冷冻然后解冻的NK细胞。所述NK细胞再激活方法包括：制备疲惫的NK细胞的步骤；和在细胞因子1-1溶液中培养所制备的NK细胞。

在淋巴细胞培养的早期阶段，即当细胞年轻时(初始培养)，其增殖速率在高浓度的细胞因子(例如IL-2)下较高。然而，在后期阶段，例如，在培养的第五天、第九天或第十天之后，增殖速率下降。也就是说，淋巴细胞不能良好生长。在这种情况下，当细胞因子浓度降低时，Treg的免疫抑制活性降低，由此淋巴细胞的增殖速率再次增加。但是，在这种情况下，存在NK细胞增殖速率不高、弱NK细胞容易失去活性的问题。此时，当用含有例如IL-2、IL-12和IL-18等细胞因子的溶液处理培养基时，NK细胞的活性增加，但缺点是Treg也被激活。由于Treg的激活，NK细胞的数量减少，并且不容易持续激活NK细胞。当Treg较弱时，NK细胞可以在一定程度上被激活。然而，在大多数情况下，NK细胞的数量会迅速减少，或者根本没有激活NK细胞，尤其是在处于严重癌症阶段的患者中。但是，在使用本发明的NK细胞培养方法时，NK细胞增殖不受Treg细胞的干扰，NK细胞能够良好地增殖和激活。在本发明的NK细胞培养方法中，在培养的初始阶段刺激NK细胞和T细胞。接下来，通过添加含有类固醇的添加剂组合物来抑制Treg。在这种状态下，在培养的第8、9或10天或之后细胞因子的浓度增加。在这种情况下，可以良好好地进行NK细胞的增殖和激活。

特别地，当使用本发明的再激活方法时，证实即使是在培养三至四周后已达到细胞分裂的最后阶段并且几乎已失去活性的老年NK细胞，也被良好的激活。

接下来，本发明的NK细胞培养基组合物制备方法是一种获得含有大量IFN-γ和IL-10的培养基组合物的方法。该方法包括：分离用所述NK细胞培养法培养了11天的NK细胞；在细胞因子1-1溶液中培养所分离的NK细胞；收获NK细胞并获得剩余的培养基组合物。也就是说，这是因为已知IL-10通过诱导巨噬细胞转变为M2b型而起到消除炎症的作用。

接下来，本发明的化妆品组合物和药物组合物使用通过所述NK细胞培养基组合物制备方法获得的培养基组合物作为活性成分。特别是，通过下文所述的实验例，确认了本发明的培养基组合物含有大量的IFN-γ和IL-10。因此，该化妆品组合物和药物组合物不仅对缓解皮肤问题有效，而且对治疗创伤和皮肤病有效。此外，根据韩国专利申请公开10-2018-0057359(KR10-2018-0057359)，其中描述了在NK细胞培养过程中获得的细胞培养基组合物的效果，细胞培养基组合物在具有皮肤美白、去除色素沉着、减少皱纹中的至少一方面有效，且对例如过敏性鼻炎、过敏性皮炎、特应性皮炎、痤疮和昆虫叮咬引起的炎症等炎症性疾病的治疗也有效。特别而言，所述细胞培养基组合物有快速止痒的效果。此外，所述细胞培养基组合物有效治疗烧伤和创伤，从而具有良好的皮肤恢复效果和色素沉着去除效果。因此，本发明的化妆品组合物和药物组合物的有效性间接得到该专利文献的公开内容的支持。

此外，下文所述的用于本发明的NK细胞培养方法的一些实例中的免疫细胞培养(NKTM)培养基添加试剂盒是单独包装的，使得能够在免疫细胞培养的每个阶段将其添加到培养基中。培养基添加试剂盒包括组分不同的B单元(也称为基础溶液或B溶液)、C1-1单元(细胞因子1-1溶液)、C1-2单元、C2单元、A1单元、A2单元和D单元。各个单元的详细描述和使用这些单元培养免疫细胞(NKTM培养过程)的具体条件的详细描述公开于韩国专利申请公开10-2018-0057359(以下简称“在先专利”)中。因此，下文给出的描述将仅聚焦于与在先专利中描述的那些不同的部分。

实施例1

1.B溶液的制备

将2.2mg IL-2和500mM L-谷氨酰胺溶液溶解在用于悬浮细胞培养的基础培养基中以制备10LB溶液。当基础培养基中已经存在IL-2或L-谷氨酰胺时，调整加入基础培养基中的IL-2或L-谷氨酰胺溶液的量以满足最终浓度。

2.细胞因子1-1溶液的制备

将20ug IL-2和125ug IL-18溶于蒸馏水中以制备10mL细胞因子溶液(C溶液)。将1mL C溶液溶解于1000mL基础溶液(B1溶液)中以制备细胞因子1-1溶液(C1-1溶液)。

3.制备NK细胞培养用添加剂组合物

NK细胞培养基用添加剂组合物1通过将地塞米松磷酸钠溶解在细胞因子1-1溶液中至1ug/mL的浓度来制备。

实施例2

将泼尼松龙(Sorondo片剂,5mg/片,Yuhan Corporation)以对应于167ug/mL浓度的量溶解在RPMI培养基中，然后将所得溶液用C1-1溶液稀释20倍，以获得浓度为8.3ug/mL的NK细胞培养基用添加剂组合物2。

实施例3

将甲泼尼龙(PD片剂，4mg/片，Choongwae Pharmaceutical)以对应于80ug/mL浓度的量溶解于RPMI培养基中，将所得溶液用C1-1溶液稀释10倍，以制备浓度为8ug/mL的NK细胞培养基用添加剂组合物3。

实施例4

作为倍他米松磷酸钠(Hanol倍他米松，5.2mg/1mL安瓿，Hanol Biopharma)，使用1uL Hanol倍他米松。将1uL的Hansol倍他米松溶解在10mL的C1-1溶液中以制备浓度为0.4ug/mL的NK细胞培养基用添加剂组合物4。

实施例5

如下培养NK细胞。

1.培养基添加试剂盒的制备

(1)A溶液：如下制备的溶液：将抗CD16抗体和抗CD56抗体溶解在B1溶液中使得抗CD16抗体和抗CD56抗体各自所含浓度为0.01至1.5ug/ml。

(2)A1溶液：如下制备的溶液：将抗CD16抗体溶解在C1-1溶液中，使得抗CD16抗体的所含浓度为0.1～15ug/mL。

(3)A2溶液：如下制备的溶液：将抗CD56抗体溶解在C1-1溶液中，使得抗CD56抗体的所含浓度为0.1至15ug/mL。

(4)B1溶液：如下制备的溶液：将IL-2溶解在用于悬浮细胞培养的基础培养基中，使得IL-2的所含浓度为1000至4000IU/mL。

(5)B2溶液：IL-2的浓度为B1溶液中的两倍的溶液。

(6)C1-1溶液：如下制备的溶液：将IL-12和IL-18溶解在B1溶液中，使得IL-12的所含浓度为0.5至5ng/mL且IL-18的所含浓度为2至50ng/mL。

(7)C5溶液：IL-2和IL-18的浓度为C1-1溶液中的五倍的溶液。

(8)D溶液：如下制备的溶液：将抗CD3抗体溶解在C1-1溶液中，使得抗CD3抗体的所含浓度为1至12ug/mL。

(9)R溶液：用于悬浮细胞培养的基础培养基溶液，该溶液含有浓度为3至12mM的L-谷氨酰胺但不含细胞因子或抗体。

2.培养过程

以与在先专利中相同的方式进行淋巴细胞的提取和自体血浆的制备。

第0天：将从血液中分离出的1.0×10

第1天：将1mL A2溶液加入正在培养的细胞中。

第2天：将1mLD溶液加入正在培养的细胞中。

第3天：将NK细胞培养基用添加剂组合物1以5mL的量加入正在培养的细胞中。

第4天：如果需要，将细胞转移到更大的培养容器中，然后在那里温育。将3mL R溶液加入正在培养的细胞中，或者用10mL C1-1溶液置换培养基。

第5天：将20mL A1溶液加入正在培养的细胞中。

第6天：将20mL的A溶液加入正在培养的细胞中。

第7天：将40mL B1溶液加入正在培养的细胞中。

第8天：将300mL R溶液加入正在培养的细胞中。

第10天：将300mLR溶液加入正在培养的细胞中。

第11天：将300mL B2溶液和50mL C5溶液加入正在培养的细胞中。

第14天至第19天：收获细胞。

实施例6

除了在第3天添加4.5mLNK细胞培养基用添加剂组合物2之外，以与实施例5相同的方式培养NK细胞。

实施例7

除了在第3天添加4.5mLNK细胞培养基用添加剂组合物3之外，以与实施例5相同的方式培养NK细胞。

实施例8

除了在第3天添加4.5mLNK细胞培养基用添加剂组合物4之外，以与实施例5相同的方式培养NK细胞。

比较例1

除了在第3天不添加NK细胞培养基用添加剂组合物1之外，以与实施例5相同的方式培养NK细胞。

实验例1

为了确认包含一种或多种Treg活性抑制物质作为活性成分的NK细胞培养基用添加剂组合物对NK细胞培养的影响，观察了以与实施例5相同的方式培养NK细胞的情况下的细胞增殖的结果以及以与比较例1相同的方式培养NK细胞的情况下的细胞增殖结果。观察结果示于表1(单位：×10

[表1]

[表2]

从表1和图1可以看出，在培养免疫细胞的过程中，第2天用抗CD3抗体进行处理，刺激Th细胞。第3天，如实施例5那样，将含有1uL地塞米松(类固醇注射剂)的NK细胞培养基用添加剂组合物加入培养基中。第4天，将现有培养基替换为C1溶液以消除由Th2细胞和Treg细胞产生的细胞因子，然后在C1溶液中培养NK细胞。然后，比较通过实施例5的方法获得的NK细胞的数量和通过未使用类固醇的比较例1的方法获得的NK细胞的数量。比较结果显示，在培养14天时，通过实施例5的方法培养的NK细胞的增殖速率是比较例1的方法的4.3倍以上，在培养17天时是5.9倍以上。此外，从表2和图2A和2B可以看出，当通过实施例5的方法培养NK细胞时，培养基中NK细胞占所有细胞的比例和NK细胞的激活程度高于通过比较例1的方法培养NK细胞的情况。当使用实施例5的方法时，如果在第4天更换培养基后再加一次类固醇，效果可以更好。但可以看出，即使在第3天仅进行一次类固醇处理的情况下，效果也足够好。

此外，在使用通过淋巴细胞培养获得的激活的淋巴细胞作为效应细胞并使用血癌细胞系(K562)作为靶细胞、并且将激活的淋巴细胞与癌细胞之比设为10:1的条件下，进行滴度分析以测量激活的淋巴细胞对血癌细胞系的杀伤能力。由于NK细胞与激活的淋巴细胞之比越高、杀伤能力值自然也越高，因此可以预期激活的淋巴细胞(其中通过本发明的培养方法培养的NK细胞的比例高)的治疗效果是优异的。

实验例2

为了确认包含各种类固醇作为Treg活性抑制物质的NK细胞培养基用添加剂组合物的效果，观察了根据实施例6至8的方法进行的NK细胞培养获得的细胞增殖结果。观察结果示于表3(单位：×10

[表3]

代替NK细胞培养基用添加剂组合物1中所含的地塞米松的是，NK细胞培养基用添加剂组合物2含有泼尼松龙，添加剂组合物3含有甲泼尼龙，添加剂组合物4含有倍他米松。从表3可以看出，在分别使用添加剂组合物2、添加剂组合物3和添加剂组合物4代替添加剂组合物1的实施例6、7、8中，NK细胞增殖非常好。

实验例3

以与实施例5相同的方式培养细胞，不同之处在于：使用NK细胞比例为约50％的细胞，NK细胞培养基用添加剂组合物中包含的类固醇的浓度增至约2倍，并且在细胞培养期间的第3、4和8天添加所述添加剂组合物。此外，以与比较例1相同的方式培养细胞，不同之处在于使用NK细胞比例为约50％的细胞。各情况下的细胞增殖结果示于图3A和3B中。

图3A和3B显示了当使用本发明的添加剂组合物时，NK细胞比例为81.35％，而在不使用时，NK细胞比例为51.76％。即使在NK细胞比率高的条件下开始NK细胞培养，当在NK细胞培养过程中加入本发明的添加剂组合物时，NK细胞增殖速率也能够增加。

实验例4

为了确认本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物的效果，用典型的NK细胞培养方法培养了NK细胞，而不使用实施例中的NK细胞培养添加试剂盒。分离淋巴细胞(1×10

表4和图4A和4B显示了当在NK细胞培养期间的培养第三天将本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物添加到培养基中时，即使在仅使用细胞因子和抗CD3抗体而不使用额外的培养基添加试剂盒来培养NK细胞的情况下，NK细胞的增殖也超过不使用本发明的添加剂组合物的情况下的两倍。此外，NK细胞的比例为31.1％，高于不使用添加剂组合物时的比例，并且NKT细胞的比例也高达26.2％。

[表4]

实验例5

为了确认本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物的效果，使用下述方法培养了细胞，而不使用实施例中的NK细胞培养添加试剂盒。即，使用常规的NK细胞培养方法培养NK细胞，所述方法中使用了固定化的抗CD3抗体。将抗CD3抗体固定在T25烧瓶中，使分离的淋巴细胞(0.8×10

表5和图5A和5B显示了在不使用额外的培养基添加试剂盒时将抗CD3抗体固定在T25烧瓶中并且使用细胞因子、抗CD16抗体和抗CD56抗体培养NK细胞的情况下的NK细胞培养结果。即使在这种情况下，当在培养的第3天将本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物添加到培养基中时，培养14天后的NK细胞增殖也超过不用本发明的添加剂组合物时的两倍。此外，NK细胞的比例显著增加至49.72％。

[表5]

实施例9

为了评估本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物对活力降低的细胞(即，疲惫的细胞)的再激活的影响，将培养25天的老年细胞重新培养，同时使用实施例5的方法抑制Treg细胞。如下尝试再激活。为了去除已有的培养基，通过离心去除上清液，将剩余的沉积物放入普通培养基(RPMI)中并培养约2小时，将培养基更换为C1溶液并培养3天。

实验例6

测定实施例9中再激活的NK细胞的活性，结果示于表6。

如下表6所示，观察到活性没有被Treg抑制而是增加，并且细胞数量没有迅速减少。然而，尽管可以认为是测量误差，但观察到细胞数量略有减少，达到细胞数量因老化而自然减少的程度。这种方法能够在很短的时间内(例如1到3天)激活NK细胞。这种方法不仅能够激活老细胞，还可以激活从外周血直接分离出的PBMC中的NK细胞。预期该方法能非常有效地激活因冷冻解冻而失去活力的NK细胞。

[表6]

实施例10

以与实施例5相同的方式培养NK细胞，不同之处在于，PBMC是从血液中具有高浓度IL-10并且Treg细胞可能被高度激活的人获得的。第12天，取出细胞，除去已有的培养基，用C1溶液培养细胞2天。接下来，分离NK细胞，并获得剩余的培养基组合物。

实验例7

对实施例10中获得的培养基组合物的成分进行鉴定，结果示于表7中。

[表7]

表7显示出在培养的第12天和随后的两天培养中，用C1溶液进行刺激显著增加了细胞数量并且显著增加了IFN-γ和IL-10。在这种情况下，产生的IL-8的量很小。另一方面，当在没有用C1溶液激活的情况下分离出细胞时，细胞因子含量的总体增加很小。从实验例可以看出，当用本发明的NK细胞培养基用添加剂组合物处理甚至存在大量Treg细胞的人免疫细胞、并随后在培养第12天用C1溶液进行刺激时，人免疫细胞数量也不减少反而增加，并产生了大量的IFN-γ和IL-10。另一方面，已知IL-8是吸引嗜中性粒细胞的细胞因子并且与炎症高度相关，且已知IL-10通过诱导巨噬细胞变为M2b型而起到消除炎症的作用。因此，认为由此获得的培养基组合物可有效治疗由炎症引起的皮肤病。

虽然已经参照上述优选实施方式对本发明进行了说明和描述，但本发明不限于上述实施方式，本领域普通技术人员将理解各种变化和修改在不脱离本发明的精神的情况下是可行的。