色谱方法、测定在色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的影响的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法

摘要

本发明涉及色谱方法、测定在色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的影响的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法。

说明书

本发明涉及色谱方法、测定在色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的影响的方法及获得至少一种色谱方法参数的方法。基于从测定至少两种参数的相互依赖性的影响的方法或获得至少一种色谱方法参数的方法获得的结果进行色谱。

生物制药工业中的过程开发(PD)面临成本、质量、时间和可转移性限制。通过并行处理，减少进料量和优化方法，已知高通量筛查克服了实验限制。可转移性通常受到无可比性操作方法或流体动力学偏差的限制。

如大量研究中所证明的，色谱操作期间涉及的质量传递机理、流体动力学行为和动力学现象的分析和建模是关于放大目的、质量源于设计方式以及过程集成和优化的重要工具。已经提出了许多数学模型来描述在色谱操作期间获得的分布，其特征在于在相关质量传输现象的描述中不同的复杂性水平。一般性速率模型(GRM)可以被视为描述利用球形多孔颗粒的色谱法的最通用模型。在该模型中，考虑了对流、轴向分散和所有其它相关的质量传输阻力。这包括溶质分子从流动相到吸附剂颗粒外表面的外部质量传递、颗粒内的扩散和配体位点处的吸附-解吸过程，这通常通过各种吸附等温线如空间质量作用(SMA)、Langmuir或Freundlich来描述。一般性速率模型通常以简化形式重新布置，其中不同的质量传递过程表示为一个单项。

然而，模型参数测定是漫长且劳动密集的。必要参数的确定受到实验装置、相互依赖性效应、时间和偏差的限制。通常通过对实验结果进行模拟信号的拟合程序来完成参数的估计。这可以通过数学求解器，如ASA、CMinPack、Ceres、GaLib、IPOPT、MKL或OpenBeagle使实验结果与模拟结果之间的目标误差最小化来实现。

通过传统的实验设计的模型识别包括拟合参数线性的模型。在方程式(1)中示出了示例性响应曲面模型(RSM)。利用这种类型的模型(其参数是线性的)，执行设计，其中调整因子(x)，使得存在描述每个模型参数/系数(θ)的正交信息，这意味着在设计中存在唯一的信息以唯一地计算每个θ。

对于参数/系数高度相关的非线性模型，每个系数的估计可能是具有挑战性的。通常通过最小化测量数据与模拟数据之间的误差来找到系数，如方程式(2)所示。

对于例如以下方程式(8)中描述的模型，找到(2)中的该误差函数的全局最小值具有挑战性，产生许多局部最小值。全局优化算法是可用的，并且在最小化预测误差方面起到良好的作用，然而，这种解决方案经常产生分别在物理学正确的边界条件之外的没有物理意义的系数。在系数之间存在高相关性的情况下，使预测误差最小化的集θ实际上在物理上是不可实现的。必须修改模型校准程序以产生表示实际物理系统的系数，而不是使预测误差最小化。

模型校准可以通过约束系数空间(对每个系数的值施加限制)或者通过对系数进行解耦来修改。约束系数空间需要系统的详细知识，这可能是未知的。在本发明中，提出了用于对参数的识别进行解耦的模型校准程序。

模型的靶向目标是真实系统的数学和物理学正确的抽象/描述。建模通常分为系统分析、问题分析和模型选择。

-在系统分析中，结构连接被识别，相关的要素和参数被评估并且性质被组合。

-问题分析通过数学方程式来描述物理原理和副作用。

-对于模型选择，优选方程式必须显示所有必要的效果。

模型复杂度应该足够高以描述所有相关的效果并且通过物理学正确的描述对实验空间进行描述来实现外推，而复杂度应足够低以确定模型误差并且防止不必要的实验工作。

建模结束后，需要获取使用的方程式参数。这可以通过先验知识如制造信息、经验方程式或测量来完成。

鉴于上述情况，本发明所解决的技术问题在于提供对色谱方法物理学和数学正确的评估和抽象，其应得到准确的结果；提供使用上述的评估和抽象的色谱方法获得色谱方法参数的方法；以及采用所述评估和抽象的色谱方法或获得色谱方法参数的方法的色谱方法。

上述技术问题的解决方案通过提供权利要求所限定的主题来实现。

在第一方面，本发明涉及测定色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的影响的方法，所述方法包括以下步骤：(ia)选择至少一种化合物；(ib)选择至少一个固定相；(ic)选择至少一个流动相；(id)选择具有包含至少一个固定相和至少一个流动相的色谱床的至少一个色谱装置；(iia)确定色谱方法的物理原理；(iib)根据物理原理确定相关参数；(iiia)从相关参数中选择至少两种参数；(iiib)使用至少一个色谱装置和至少一种化合物测定至少两种参数的相互依赖性；(iv)使用测定的至少两种参数的相互依赖性来评估相关参数；(v)评估色谱方法的物理原理的有效性。

通过(iiib)使用至少一个色谱装置和至少一种化合物测定至少两种参数的相互依赖性，本发明涵盖了新的物理链接的模拟参数估计方法的用途，其减少了参数估计误差并且涵盖了基于物理的参数估计。

根据本发明，这种方法产生了基于物理的参数集的全局最小参数估计和可靠的模拟结果。准确且物理学正确的模拟参数的估计对于被研究系统的正确模拟预测是必要的。

色谱法是分离的物理方法，其中待分离的组分分布在两个相之间，其中一个相是固定的(固定相)，而另一个相(流动相)在预定方向上移动。

本发明的方法不限于特定类型的色谱法。例如，本发明的方法可以用于吸附色谱法、亲和色谱法、柱色谱法、置换色谱法、洗脱色谱法、排阻色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶渗透色谱法、迎头色谱法、气相色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法、混合模式色谱法、等温色谱法、液相色谱法、正相色谱法、分配色谱法、平面色谱法、程序化流动色谱法、程序化压力色谱法、程序化温度色谱法、热解-气相色谱、反应色谱法、反相色谱法、超临界流体色谱法、二维色谱法等。根据本发明的方法特别适用于离子交换色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法和混合模式色谱法。

步骤(ia)中选择的至少一种化合物不受特别限制。例如，它可以选自小分子(Mn≤8000g/mol，基于聚苯乙烯标准物通过GPC测定)、药物、蛋白质、核苷酸、核苷、生物细胞、病毒、病毒样颗粒、抗体-药物缀合物、电荷变化抗体、抗体片段、聚氨基酸和多肽。优选地，至少一种化合物包含或为蛋白质和/或药物。

根据本发明，步骤(ib)不受特别限制。原则上，可以使用适于色谱法的任何固定相。合适的固定相是例如多孔和无孔球形颗粒、多孔和无孔非球形颗粒(例如二氧化硅颗粒)、色谱树脂、色谱膜、色谱整料、膜吸附剂、织造物、非织造物和混合基质。根据本发明，优选在步骤(ib)中选择色谱膜(例如离子交换色谱膜)、膜吸附剂、整料、无孔球形颗粒或非球形颗粒作为固定相。

就由多孔颗粒材料构成的固定相而言，色谱床的总孔隙率ε

·内部孔隙率/空隙率ε

·体相孔隙率/空隙率ε

两个孔隙率值ε

ε

色谱床的特征还可以在于

·固定相孔隙率ε

由颗粒材料构成的固定相不仅可以通过上述参数ε

内部孔隙率ε

逆体积尺寸排阻色谱法(iSEC)是广泛使用的相对于分子尺寸测定色谱介质的空隙率和孔隙率的方法。必须选择用于逆体积尺寸排阻色谱法的参考分子(示踪物分子)。参考分子的尺寸应与至少一种化合物(例如目标分子)的尺寸相匹配。优选参考分子不与固定相相互作用。具有窄且限定的尺寸分布的参考分子的优选分子种类特别地但不限于多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、胶乳珠。(逆体积尺寸排阻色谱法可以另外用于使用各种模型计算孔径分布。)

统计矩的常规方法表示了主要的分析方式。该方法适用于由示踪物的窄矩形脉冲注入系统导致的色谱峰，该方法是计算色谱床实际体积、空隙率(孔隙率)和分散系数D

按照矩分析技术，可以使用以下方式计算取决于缓冲条件和分子尺寸的空隙率值：

其中ε表示示踪物分子(参考分子)可达到的体积分数，V表示色谱床体积，

对于所有信号，第一矩(μ

该校正程序可以通过测定在没有色谱介质的情况下测量的示踪物信号的第一矩(μ

μ

其中μ

如果色谱床没有内部孔隙率，则可以通过应用式(3)、式(4)和式(6)直接获得相对于所用分子尺寸的体相孔隙率ε

如果色谱床具有内部孔隙率ε

小示踪物分子可以完全达到反映停滞相的内部空隙率ε

大的示踪物分子i被完全排除在内部空隙率ε

相同的方式可以用于内部孔隙率ε

因此，确定ε

在未知色谱床的内部孔隙率ε

在固定相由颗粒材料(例如二氧化硅颗粒)构成的情况下，色谱床的内部孔隙率ε

根据本发明的优选实施方案，固定相是色谱膜(例如离子交换色谱膜)、色谱树脂或整料，优选色谱膜或整料。

根据本发明的另一个优选实施方案，固定相是可逆溶胀的。如果与固定相接触的流动相的组成的变化导致固定相的体积的变化，则固定相被认为是“可溶胀的”。当固定相的体积改变时，孔隙率也改变。因此，根据本发明，如果与固定相接触的流动相的组成的变化导致内部孔隙率ε

例如，内部孔隙率ε

根据本发明的优选实施方案，当流动相与固定相接触时，在固定相的至少一部分表面上形成凝胶，优选水凝胶。在此，“凝胶”被认为是非流体网络，其通过流动相膨胀遍及其整个体积。优选地，凝胶形成在固定相的整个表面上。“水凝胶”是通过作为水性介质的流动相膨胀的凝胶。

根据本发明的优选实施方案，固定相的至少一部分表面由结合到固定相支撑结构表面的聚合物构成。固定相支撑结构不受特别限制，并且可以具有颗粒、珠或多孔膜的形式。优选地，固定相的整个表面由聚合物构成。根据本发明的特别优选的实施方案，如上所述，当聚合物与流动相接触时，由聚合物形成凝胶。甚至更优选该凝胶是水凝胶。

根据本发明，可以在步骤(ic)中选择可以用于色谱方法的任何流动相。流动相优选为液体。此外，流动相可以包括或为有机溶剂或有机溶剂的混合物。除了一种或多种有机溶剂之外，流动相可以包括水。优选地，流动相是水性介质。流动相的组成可以在色谱方法期间变化(梯度色谱法)。例如，当流动相包括一种或多种有机溶剂时，一种或多种有机溶剂的浓度可以在色谱法期间改变。此外，当流动相是水性介质时，流动相的pH和/或盐浓度可以在色谱方法期间变化。对于此类情况(例如，在pH和/或盐浓度变化的情况下)，必须获得流动相的各种组成(即，变化的pH和/或变化的盐浓度)的吸附等温线。

根据本发明，流动相的pH原则上可以取任何值。优选地，pH值为0至14、更优选2至12、特别优选3至11、甚至更优选4至10、最优选5至9。当然，pH在色谱方法期间也可以保持恒定。

根据本发明，流动相的盐浓度原则上可以取任何值，只要不超过盐在流动相中的溶解度即可。优选地，盐浓度的值为0至10mol/L、更优选0至5mol/L、特别优选0至3mol/L、最优选0至1mol/L。当然，盐浓度也可以在色谱方法期间保持恒定。

根据本发明，如上所述，一种或多种盐可以溶解在流动相中。一种或多种盐不受特别限制。优选地，一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、碳酸钠、硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、脲盐酸盐、胍盐酸盐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、甘氨酸、柠檬酸三钠及其组合。替代地或另外地，流动相可以含有相应的酸，例如盐酸、硫酸、柠檬酸等。

在步骤(id)中选择的色谱装置不受特别限制。色谱装置可以具有从实验室规模(其中色谱床的体积V

优选地，步骤(id)不仅包括色谱装置的选择，还包括至少一个罐、液体泵、检测器、多个阀和过程控制软件(色谱设备的选择)的选择，但不限于此。色谱设备在其机械和系统上可能因加工复杂性而变化。例如，当色谱法是连续色谱方法时，可以省略罐。在图1所示的示例性色谱设备中，往复泵P1将进料溶液从进料罐B1提供至色谱装置，在此是膜吸附剂MA1。优选在色谱装置MA1的下游检测相应的检测器信号。此后，优选将流动相收集在罐B2中或进一步纯化。优选将杂质导向废物收集器(图1中未显示)。

根据本发明，色谱温度不受特别限制，只要可以在选定的温度下进行色谱即可。优选地，色谱温度大于0℃、更优选至少1℃、特别优选至少5℃、甚至更优选至少15℃。色谱温度的上限优选小于100℃、优选80℃或更低、更优选70℃或更低、特别优选60℃或更低、甚至更优选50℃或更低。色谱温度可以在色谱方法期间变化，优选在上述范围内变化。优选地，色谱温度是恒定的。

在本发明方法的步骤(iia)中，确定色谱方法的物理原理。

通常，色谱方法领域的技术人员充分了解用于考虑实际色谱设定来确定相关色谱方法的物理原理和基础方程式。

作为实例，根据本发明，更详细地讨论未结合示踪物物质在色谱柱中的流体动力学行为。

使用方程式(8)可以实现问题的基于模型的描述。

在这种情况下，内部速度与可能的管道的直径物理关联(方程式(9)和方程式(10))。

现有技术的数学求解器将独立于物理学限制或关联估计一种或多种参数，因此结果可能是物理学不正确的。然而，根据本发明，考虑相互依赖性来评估至少两种相关参数，得到关于相应色谱方法的物理学正确的结果。

在本文中，根据本发明，关联的模型参数的另一个重要实例是关于离子交换色谱介质的结合容量和离子容量。作为实例，在图2中显示了针对各种离子容量，牛血清白蛋白(BSA)在阴离子交换膜吸附剂上的结合容量。

可以观察到，取决于膜吸附剂的离子容量的函数关系可以描述静态结合容量。为了确定例如等温线参数，必须考虑两种参数之间的这种关联。描述离子交换材料上的结合的显著等温线模型是空间质量作用(SMA)等温线。对于单个组分，数学形式示出在方程式(11)中：

确定上述等温线参数的现有技术方法可以是使用不同算法的色谱图拟合(获得模拟信号与实验信号之间的最小偏差的拟合程序)，而没有限制或参数限制。如图2所示，两种等温线参数Λ和q

关于上述等温线参数，本领域技术人员能够基于其背景知识确定吸附等温线。例如，吸附等温线可以是如以上所述的空间质量作用(SMA)吸附等温线、Langmuir吸附等温线或Freundlich吸附等温线。

根据本发明的优选实施方案，SMA等温线可以用作吸附等温线。根据影响因素如盐浓度和/或pH，可以使用SMA等温线以便描述至少一种化合物的吸附。SMA等温线可以如Brooks,Clayton A.；Cramer,Steven M.(1992):Steric mass-action ionexchange.Displacement profiles and induced salt gradients.In AIChE J.38(12),pp.1969–1978.DOI:10.1002/aic.690381212；and in Journal of Chromatography A,1233(2012)54-65“Determination of parameters for the steric mass action model-Acomparison between two approaches”中详细描述所测定。当固定相是离子交换色谱膜时，优选SMA等温线。

在以下三个方程式中，电中性依赖于至少一种化合物的空间因子σ

色谱介质的离子容量Λ限定色谱主链上配体的数量。离子容量(或色谱介质的容量)Λ可以通过主链上的配体与结合至每个配体的特征组分的化学反应来测定或通过滴定来测定。对于离子交换色谱(IEX)，通过用相应的酸或碱滴定带电配体来测定离子容量Λ。

对于快速平衡或处于平衡状态，SMA等温线可以写成如下方程式。

在上述方程式中，c

特征电荷v

在方程式中

使用对数容量因子对对数盐浓度的线性回归，通过斜率和截距得到电荷v

根据本发明的另一个优选实施方案，可以获得Langmuir等温线。

Langmuir等温线可以写成以下形式的多种组分(即，在至少一种化合物的数量为2或更大的情况下)

其中q

按照由Yamamot等人(Biotechnology and Bioengineering，Vol XXV，Pp.1465-1583(1983))和Forrer(Nicola Forrer，“Antibody purification with ion-exchangechromatography”，dissertation，ETH Zurich 2008)公开的著作，Langmuir参数，即最大结合容量q

q

K

参数a

根据本发明，如以上方程式所示，可以相对于等温线参数和流动相中的条件来识别参数相互依赖性。

q

K

使用系数a

在选自色谱温度、流动相的pH和流动相的盐浓度中的一个或多个条件是变化的情况下，对于每个各自变化的条件需要获得若干吸附等温线，以便覆盖色谱温度的整个范围、流动相的pH的整个范围和/或流动相的盐浓度的整个范围。在这种情况下，根据本发明可以获得仅用于一些变化条件的吸附等温线，而其它条件的吸附等温线可以使用描述所获得的数据集的函数关系借助内插法来获得。对于等温线参数的盐依赖性所描述的类似方法可以用于温度或pH依赖性。

在本发明方法的步骤(iib)中，测定根据物理原理的相关参数。

首先，应注意，如上文已经给出的涉及/相关的参数的相应描述也适用于下文对根据本发明的方法的步骤(iib)给出的描述和定义。

根据本发明，考虑色谱法中的参数限制和关联。

在本文中，首先，考虑如此的色谱装置。

根据本发明，线流速是相关方面。

特别地，线流速与不同的模型参数相关联。即体积流速

流动横截面取决于色谱装置的几何性质。在使用圆柱形柱的情况下，横截面与管的半径/直径d相关联。

色谱装置体积与装置的几何面积及其填充高度h相关联。

V＝A·h

几何装置刻度在由制造程序驱动的特定范围内变化，或者在由人工装置制备产生的误差的一般质量误差源内变化。这样的误差源可以是但不限于个体的人为误差、材料偏差和程序偏差。

根据本发明的另一方面是体相/内部/固定相孔隙率ε。

色谱床的孔隙率主要由材料本身及其填充特性(压力、压缩等)决定。这些值不能低于0％或高于100％。如果色谱介质显示出可逆溶胀行为，则孔隙率与周围的流动相条件如pH值、盐浓度和温度相关联。

ε＝f(T，pH，c(盐))

此外，不同的孔隙率值(内部孔隙率ε

ε

对于具有在分子范围内的孔径分布的固定相，内部孔隙率是分子大小的函数。在这种情况下，分子只能进入直径等于或大于分子直径的孔。

ε

根据本发明的下一方面是轴向分散系数。

对于具有完全充满流体的一个间隙速度和在高Peclet数(＞＞1)下的均匀多孔介质，轴向分散系数降低至：

D

这些条件通常在色谱操作期间得到满足，这意味着轴向分散系数通过分散性因子α与线流速直接相关。如实施例1所示，通过在不同的线流速下测量轴向分散系数，经由线性回归可以确定该因子。以类似的方式，至少一种化合物在假设的DPF(“分布式活塞流”)中的轴向分散系数D

或者，轴向分散系数D

在上述方程式中，Bo是博登斯坦数，v是线速度，并且L是特征长度。博登斯坦数是通过脉冲示踪实验确定的，在脉冲示踪实验中，轴向分散系数或者以误差最小化与实验数据拟合，或者使用矩分析。特征长度是色谱床高度(参见Octave Levenspiel；TraxerTechnology Modeling of the Flow of Fluids ISBN：978-1-4419-8073-1)。

作为替代，可以由以下方程式计算轴向分散系数D

在上述方程式中，HETP是等于一个理论板的高度，并且v如上所定义。HETP可以通过示踪实验测定，其中使用在给定线速度v和特征长度L(色谱床高度)下的相应峰的方差

根据本发明的另一方面是有效扩散系数。

固定相中的有效扩散系数与体相扩散系数相关联，并且通常通过曲折因子τ来缩减。

由于在狭缩的孔系统中的运动，有效扩散系数D

因此，基于体相扩散系数D

然而，曲折因子可以与固定相孔隙率相关联。

按照由Mackie和Meares(J.S.Mackie,P.Meares,The Diffusion ofElectrolytesin a Cation-Exchange Resin Membrane.I.Theoretical,Proc.R.Soc.London.Ser.A.Math.Phys.Sci.232(1955)498–509.http://rspa.royalsocietypublishing.org/content/232/1191/498.abstract.)公开的相关性，可以使用固定相孔隙率ε

特别地，如果目标分子的体相扩散系数是已知的，则可以基于相关性计算有效扩散系数D

作为另一种替代，可以使用爱因斯坦-斯托克斯(Einstein-Stokes)方程式基于分子半径r、溶剂的动态粘度η、温度T和玻耳兹曼(Boltzmann)常数k

在限定的条件下，可以使用动态光散射测定分子半径r。该方法依赖于由溶液中的分子运动引起的散射光的强度波动。该方法也允许直接获取扩散系数。

可以使用落球粘度计测定溶液粘度η。斯托克斯定律是落球粘度计的基础，其中流体在垂直玻璃管中是静止的。允许已知尺寸和密度的球体下降通过液体。如果正确选择，则其达到最终速度，所述最终速度可以通过其经过管上的两个标记所花费的时间来测量。电子感测可以用于不透明流体。已知最终速度、球体的尺寸和密度以及液体的密度，斯托克斯定律可以用于计算流体的粘度。

固定相孔隙率ε

根据本发明的下一方面是结合容量。

根据用于描述目标分子在固定相上的结合的模型，可以识别配体密度与结合容量之间的关联性：

从图2可以看出，取决于膜吸附剂的离子容量的函数关系可以描述静态结合容量。为了确定例如等温线参数，必须考虑两种参数之间的这种关联。描述离子交换材料上的结合的显著等温线模型是如上所述的空间质量作用(SMA)等温线。对于单个组分，数学形式示于方程式(11)中：

此外，可以规划离子容量与空间位阻因子和/或分子大小之间的关联性。此外，分子大小或结构形式(例如圆形或针状)可以是pH依赖性的。

σ

根据本发明的实施方案，除了色谱装置之外，还可以对外部系统进行评估和抽象。

在许多情况下，色谱装置不仅包含固定相/色谱床。可以存在辅助元件，如阀、管、流量分配器等。这些辅助元件，即流动相流经并且与色谱床不同的色谱装置的部分，被称为“外部系统”。这些辅助元件对色谱装置的流体动力学性质的影响可以考虑如下所述。

考虑外部系统，根据本发明一个方面是线流速。

外部系统中的线流速可以与不同的参数相关联。这取决于外部系统部件的几何性质。如果考虑外部系统的管道，则可以提出以下关系：

流动横截面也取决于外部系统的几何性质。在管的情况下，横截面与管的半径/直径d相关联。

考虑到外部系统，根据本发明的另一方面是轴向分散系数。

如果通过分布式活塞流模型(“DPF模型”)描述外部系统，则轴向分散系数显示与色谱装置相同的限制。它取决于线流速：

D

根据本发明，考虑到外部系统的另一方面是系统体积。

总系统体积与外部系统的几何性质高度相关。如果外部系统主要由导管和管组成，则体积可以与几何尺寸相关联

其中l反映导管/管长度。

在本发明方法的步骤(iiia)中，从相关参数中选择至少两种参数。

根据本发明，色谱方法所包括的相互依赖的任何两种参数可以被选择为所述至少两种参数。根据本发明的优选实施方法，至少两种参数是色谱装置的内部速度和直径：

其中

v表示色谱床中的流动相的速度，

A表示色谱装置的横截面积，

ε

d表示色谱装置的直径。

根据另一个优选实施方案，至少两种参数是至少一个固定相的结合容量q

其中

c

q

k

Λ表示总离子容量，

v

σ

根据本发明，用于确定/识别物理关联/限制参数的方法是例如几何分析、文献已知的相关性、实验设计方法和使用供应商提供的相关性，其中这些方法可以单独使用或以任何组合使用。

在本发明方法的步骤(iiib)中，使用至少一个色谱装置和至少一种化合物测定至少两种参数的相互依赖性。原则上，可以使用全局物理学正确的参数集的误差最小化来估计所述相互依赖性。相应的方法可以被描述为例如使用不同算法的拟合程序。根据本发明的优选实施方案，确定至少两种参数的相互依赖性的步骤(iiib)包括一个或多个实验室实验。

在本发明方法的步骤(iv)中，使用所确定的至少两种参数的相互依赖性来评估相关参数。在考虑例如边界条件、限制和物理关联的所述参数评估导致无效的情况下，必须重新开始如上所述的建模程序，以便克服实际评估的无效性。

在本发明方法的步骤(v)中，评估色谱方法的物理原理的有效性。根据本发明，根据前述步骤(iv)，在色谱方法的物理原理看起来无效的情况下，必须重新开始上述建模程序，以便克服色谱方法所凭借的物理原理的无效性。

然而，在得到有效色谱方法的情况下，根据本发明，可以执行相应色谱过程的详细/机械建模，以便进一步开发该过程，从而内插和外推相应的过程参数，并将相应的装置从实验室放大到工业规模。

本发明的上述方面的概述在图3中以流程图给出。

根据本发明的优选实施方案，步骤(iia)通过考虑制造的实施、估计容差、副作用、偏差和/或误差范围来执行。

在另一方面，本发明涉及获得至少一种色谱方法参数的方法，所述至少一种色谱方法参数选自固定相、流动相和色谱装置，所述方法包括以下步骤：(I)执行如上所述的测定在色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的方法；以及(II)基于步骤(I)的结果选择至少一个固定相、至少一个流动相和/或至少一个色谱装置。

此外，在另一个方面，本发明涉及色谱方法，其包括如上所述的测定在色谱方法中至少两种参数的相互依赖性的影响的方法，以及(vi)进行色谱法的步骤。

在另一方面，本发明涉及色谱方法，其包括如上所述的获得至少一种色谱方法参数的方法，以及(III)基于步骤(II)中选择的至少一种色谱参数进行色谱法的步骤。

与现有技术相比，本文所述的根据本发明的参数估计程序包括附加步骤，所述附加步骤集成了物理关联/限制参数的必要标识，这有利地产生全局物理逻辑参数估计的误差最小化。

根据本发明的优选实施方案，除了物理连接的参数测定之外，可以通过实施制造或估计公差来规定估计。这些边界条件允许物理学关联的可能的参数空间，其中期望建立的模型必须以在期望的准确度存在。可以识别、评估、拒绝和修改不一致的模型建立，这将导致可转移性的失效。此外，成功的模型可以基于已知的公差来预测处理中的缩短。

此外，根据本发明，如果一种以上的物理参数是未知的并且需要估计，则制造公差的实现允许有条件地证明的误差最小化/参数估计。这通过物理限制减少了建模中的高的可变性，并且使得评估和建模本身有利地更容易。模型中可能的误差的评估是模拟中的主要挑战之一，其在没有根据本发明的可靠的模型可转移性和预测的情况下导致无效的结果。

此外，根据本发明，在此描述的模型校准程序导致可靠地表示物理组件的性能的系统模型(和参数/系数)。相对于最小化预测误差的传统模型拟合程序，根据本发明的方法能够外推到新的条件和配置。与此相反，根据现有技术，使用传统方法校准的模型适于在校准空间的类似条件下预测，但不包含因果信息，这意味着它们通常不能用于优化或先行控制。

根据本发明，在色谱方法中确定至少两种参数的相互依赖性的影响的方法产生了以下益处：真实的模型选择/评估、相应色谱系统的放大/缩小的可能性、具有新配置的系统性能的预测、操作空间的优化探索(潜在地在校准空间之外)，以找到最佳操作条件，并且可以在新条件下模拟系统性能中的模拟。

通过以下非限制性实施例进一步例示本发明。

实施例1

对于示例性建模程序，选择包括用于结合物质的系统分散体的色谱系统的行为。使用的色谱介质是膜吸附剂。

建模程序概述如下：

-系统将流体递送至色谱装置/柱/介质

-流体通过壁效应、返混、固相来分布

-在流体分配效应中可以发生时间/速度依赖性

-液相与固相的连接(吸附)

-色谱介质与溶解的流体实体相互作用(动态效应)

-可以发生时间/速度依赖性

-可以发生反应动力学

-动态效应

-输送限制

-流体动力学

-吸附和动态效应

可以使用基于速率的模型来描述问题。由于膜吸附剂中较小的质量传递限制，质量传递效应由集中膜扩散系数来描述。一般模型描述如下：

о色谱系统的流体动力学

·显示所有显著效果的一般模型

·搅拌罐

·连续活塞流反应器

о色谱介质的流体动力学

·承载多孔介质的连续活塞流反应器

о质量传递

·用于参数评估的经验方程式

·集中膜扩散系数

·等温线

·SMA

通过泵提供的体积流量除以横截面积乘以总孔隙率来计算速度。对于管，孔隙率等于1，对于色谱介质，必须确定外部孔隙率。横截面积由管直径计算。

因此，必须基于LC系统和色谱介质的尺寸来计算线流速。

对于具有完全充满流体的一个间隙速度和在高Peclet数(>>1)下的均匀多孔介质，轴向分散系数降低至：

D

其中α是分散性因子。该因子可以通过在不同的线流速下测量轴向分散系数来测定。这种与线流速的函数关联限制了轴向分散系数值。

关于流体动力学行为，可以建立柱/系统尺寸、线流速和轴向分散系数之间的物理关联。

必须相对于该关联执行通过拟合程序的参数测定，以测定物理上有意义的参数集。

在已开发的装置中制备不同数量的膜样品。不同的床体积使得能够分离装置和固定相对流体动力学的影响。

通过平衡分散性模型对LC系统和MA进行了模拟。总体LC系统是管长为2943mm，体积为1.3mL，并且孔隙率为1。总体MA装置由6.1至13.3mm床高度、3.5至7.6mL床体积和54％孔隙率表示。

装置(图4)和系统(图5)的流体动力学分别用示踪实验来表征。因此，注入含5％丙酮的2mL 20mM TRIS HCl并记录所得色谱图。分别研究了LC或实验室MA的18.9-566mm/s和0.05-0.514mm/s的线速度。对于实验室装置，系统的体积为1.3mL和3.5mL。通过模拟和实验示踪实验的误差最小化，测定了速度和轴向分散系数的函数。然后将该函数用于计算每个其它实验轴向分散系数。

示踪实验进一步用于装置和膜体积测定。物理学已知的参数使得能够对膜/装置分离的线速度和轴向分散系数进行先行的物理关联的参数估计。

D

装置和膜对流体动力学的影响的分离使得能够转移到不同的装置几何形状。在没有装置体积、直径、床高度以及速度和轴向分散的物理关联性的情况下，确定了其它数学求解误差最小的方法。增强的物理关联估计量仅具有一个确定的全局最小值。

概括而言，增强的估计途径找到了模拟参数的全局最小值，同时考虑了它们的物理相互依赖性。