内皮细胞及其前体细胞在治疗脱髓鞘疾病中的应用

摘要

本发明公开了内皮细胞及其前体细胞在治疗脱髓鞘疾病中的应用。本发明的研究发现，内皮细胞及其前体细胞可以促进OPC细胞增殖、迁移和成熟、促进星形胶质细胞反应、促进微胶质细胞/巨噬细胞激活从而促进髓鞘形成、再生和修复。本发明的研究成果为临床提供了一种主动调控髓鞘形成与再生的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及内皮细胞及其前体细胞在治疗脱髓鞘疾病中的应用。

背景技术

髓磷脂是围绕某些神经细胞的轴突从而形成电隔离层的脂肪白色物质。在人体中，大脑的大约40％含有白质，所述白质包括密集堆积的纤维，其中髓磷脂是主要成分(白质的50-60％的干重量)。髓磷脂是由中枢神经系统(CNS)中的少突胶质细胞合成和维持的。少突胶质细胞是神经胶质细胞的一种类型，其起到为CNS中的轴突提供支持和隔离的作用。少突胶质细胞是由少突胶质细胞前体细胞(OPC)产生的并且仅发现于CNS中。

髓磷脂是髓鞘的主要成分，其是包裹在神经元细胞轴突外面的一层膜(有施旺细胞和髓鞘细胞膜组成)，具有绝缘作用并提高神经冲动的传导速度，并有保护轴突的作用，维持神经细胞正常功能。因此，髓鞘是神经系统中实现其结构及功能完整的重要结构。脱髓鞘(demyelination)疾病是由于形成髓鞘有关的少突胶质细胞死亡而髓鞘永久性损伤脱失导致的严重疾病，发生在脑和脊髓中，以髓鞘破坏、炎性细胞浸润为主要病理特征。该疾病由多种原因，例如各种生物病原体感染后、疫苗接种后、异性蛋白过敏以及药物或化学品过敏反应所诱发，具体分子机制不明。

目前治疗脱髓鞘疾病模型的药物，多为免疫调节剂，如糖皮质激素：强的松，地塞米松，甲基强的松龙；免疫球蛋白及干扰素β-1，但上述药物长期使用副作用大，比如肥胖、胰岛素抵抗、血脂血压异常、消化性溃疡、骨质疏松并发骨坏死、皮疹、急性肾衰等等，并且这类药物能够减缓疾病进程，抑制炎症，起到一定的治疗作用，但是对髓鞘修复不起作用。髓鞘的再生和修复，完全靠机体的自我修复。

发明内容

为了解决现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种促进髓鞘形成、再生或修复的方法。本发明的上述方法通过EPC的使用，主动调控再生的过程，实现了髓鞘的生成，再生和修复。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种EC(endothelial cell，内皮细胞)或其前体细胞，EC或其前体细胞分泌BDNF。

进一步，所述EC或其前体细胞分泌BDNF的量高于神经母细胞瘤SHSY5Y分泌BDNF的量。

进一步，所述EC前体细胞包括EPC(endothelial progenitor cell，内皮祖细胞)；优选地，所述EC前体细胞是EPC。

本申请的EPC是一种可被诱导增殖的未分化细胞。EPC能够自我维持，使得随着每次细胞分裂，至少一个子细胞也将是EPC细胞。EPC能够被扩增100倍、250倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000或更多倍。

EPC可以在体外保持长期培养。EPC能够被传代培养2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次或更多次。

本文使用的术语“内皮祖细胞”意指其分化指向内皮细胞的细胞。内皮祖细胞可通过分析转录因子或细胞表面抗原的表达模式来确认。例如，单独或组合测量转录因子或细胞表面抗原的表达模式，其中其表达水平未被检测到或低(即使在诱导分化之前被检测到)，并且在诱导分化之后显著增加。有效用于确认内皮祖细胞的标志物包括UBXN11，LRRC75A，MMACHC，FXYD5，VMP1，KRT18，YIPF2，CNP，SPATA21，SAP30L-AS1，SLC12A6，ANP32E，CTNNB1，VIM，CNN3，RPL8，YWHAH，SDC4，HIST1H4I，SRPX2，DNASE1，MYO19，SH3KBP1，ASAP1，RNF24，SPNS2，S100A11，SOX4，RNF214，PLP2，PIH1D2，SGPL1，ELK3，F3，UGDH，RBMS2，FMNL3，RPL6，ATP2A1，EFCAB10，SLC12A2，UCKL1-AS1，ARHGAP18，RPE，SFT2D2，CXCL16，PAICS，ZBTB11-AS1，CLIC1，CERS5，CCDC85C，DHRS7，CTRL，TYMS，SPCS1，IFITM3，RPS27，RPL34，MZF1-AS1，TRAM1，SUPT7L，NOL9，MFSD11，PLD4，NQO1，NEAT1，GNAS，LDHA，UNKL，LDHB，CENPK，C1orf174，HSP90B1，TCF7L2，LENG8，IQGAP3，ANKRD13D，NPC1，MYH11，ATP2B4，FANCD2，TNRC6B，DDX17，TIRAP，HERC4，DSTN，FOXP3，ABL2，KDELR2，CCDC50，PARK7，CAPN2，ACAP1，SLC13A4，SEPT11，RAPH1，KRT8，LMO3，CIRBP，CYP20A1，LY6E，FAM69A，PRSS3，MEST，NPB，CLMP，MSN，SUCLA2，PCMTD1，PSMC3，TOMM7，GCHFR，MEIS1，TRIAP1，USP34，SPAG1，RPL39L，PDK1，LARS，MAP4K4，QTRT1，CLK1，TSC22D1-AS1，IL1B，MKRN2OS，ARL16，TSPAN13，HMGCS1，PSAP，SLC44A2，TNFRSF10B，MSC，ENG，TLDC2，TRIM41，CPM，CREB3L2，NSUN6，AHCY，NCBP1，N4BP2L2，RAB31，RNF149，SRPK2，SBDS，NAMPT，AES，SERPINF1，RPS27L，HAUS2，AP4B1-AS1，KDM2B，USP6NL，TONSL，FBLIM1，SLC31A2，ADGRL1，EFHC1，SMAD9，SLC7A11，LPIN1，DDAH2，PID1，SCAF11，BBS1，PCYOX1，CD55，PMEL，TOR1B，UBQLN1，DUSP5，CUEDC2，FKBP5，LMF2，LYRM7，NSG1，SAT2，LMAN1，NFX1，COMMD1，CCPG1，NINJ1，RNASEH1，SPATA5，CENPW，DNAJC4，PTTG1，TMEM109，MCTS1，TMEM63A，FBN1，TPM1，MAVS，ADPRHL2，CTSK，INSIG1，C16orf74，MAZ，MEG3，RFTN2，AGAP6，GPC6，PDLIM5，SLC25A5-AS1，RSL1D1，FAM219B，CFLAR，GNPTAB，PIGU，ITGB3BP，NTM，ZNF106，RPRD1B，ETS1，ITGAE，ECSCR，SND1，TRIO，ANGPTL1，SEC61G，CDR2，CRMP1，PNISR，OXLD1，PRKACA，NFKBIZ，MORN2，RAB3D，CRKL，MSL1，TMPO，GALNT2，CRELD2，ETS2，ALKBH4，PHF19，POLH，TRRAP，NET1，ADGRE5，GAS6，VEZF1，BMPR2，SMAD3，GFOD1，RABGAP1L，SLC39A7，TCTN1，CSRNP1，LRRN3，TNRC6A，MFAP2，TMEM98，SPATC1L，LINC00476，CENPQ，CSTF3，SLC8A1，E2F7，RPL7L1，ZFHX4，TXNDC11，STK4，STX16，TMEM11，PTK6，ZFAS1，U2AF2，TRIM16，ZBTB7A，P3H3，TMCO3，C15orf39，ACVRL1，SHQ1，GNS，SPRY1，DIAPH2，DLC1，TCF3，FAM229A，PTGES3L，RRP7A，MGRN1，GIT2，UBE2T，CSGALNACT2，EFEMP2，CSNK1E，MAGED2，C5AR1，ARHGAP45，CDKN2B-AS1，TMEM234，RNF213，SIDT2，TEX2，MCM3，TMEM67，ZKSCAN1，SLC2A1，MAD2L1，MGLL，NR3C1，PHGDH，SYT1，RERE，KIF1B，NCAPD3，NADK，FOXRED2，GNB5，TMEM204，USP24，KIF20B，GADD45B，ZNF135，TACC3，FOSB，ACOT9，EBF1，MYO1E，PPP1R10，NFKBIB，ROBO4，TPGS1，CFD，KIF22，EIF4A3，RNF14，NPAT，STX11，CDCA7，ST6GALNAC4，RBL1，NIF3L1，GLCE，CDCA7L，RASA3，STK10，EDNRA，ICA1L，DCTN5，GNG2，PTPN2，BST1，BMP1，RPS6KA2，SEC11C，TRMU，H1F0，STXBP5L，AP5B1，STAM，MCM2，ALDH3B1，SLC23A2，TNFAIP3，KLF7，DIP2C，KMT2B，GALNT7，NUAK2，PLXNA4，MRI1，FLNB，MBOAT2，TMEM136，AP3M2，ACSS2，AARS，DUS3L，NGLY1，ZNF274，ICAM1，FAM129A，PPP6R1，TIE1，NUMBL，PLXND1，ENC1，CCDC142，BCAN，PRR15，FLRT2，NUCB2，TARS2，POLB，RAB24，KBTBD6，SLC38A4，MAP2，PMP22，TOP3A，VAMP2，UBTD2，PLK4，MAPK8IP3，APBA2，TBC1D17，ZNF444，PLEKHG4B，MTOR，STIL，GBA，IFT88，B9D1，RAMP1，S1PR3，SHISA9，MOCS3，CEP104，TIAM1，KIF15，ZNF793，ZNF865，ABCB10，ANKHD1-EIF4EBP3，CMPK2，SYTL3，SHROOM1，SPATA6，PPP2R3B，TNFSF13B，FKBP7，CNTROB，PEX11A，LHFPL2，DOK3，ARMC9，RANBP10，ZNF561，SCAMP5，ARHGAP39，DENND3，ATP9A，DCPS，ZNF302，ARHGAP9，IP6K1，ADAM22，EMCN，CYFIP2，WDR90，PPM1M，C1QTNF6，DACH1，BMF，SETD4，TBC1D9，PIK3IP1，P4HTM，CD101，SCPEP1，TLDC1，GTPBP10，TAP2。

EPC包括内皮集落形成细胞，通常在1-3周的细胞培养后形成。根据Smardja等，Angiogenesis 14(1)：17-27(2011)，内皮集落形成细胞具有定向内皮谱系的前体细胞的特性，并且能够合并成到新生血管中。

EPC的分离、纯化、离体培养和特征在Hill等，N.Engl.J.Med.：593-600(2003)；Assmus等，Circulation 106：3009-16(2002)；王等，J.Am.Coll.Cardiol.4949：1566-71(2007)；和Kalka等，P.N.A.S.97：3422-7(2000)中被描述，其内容通过整体引用并入本文。此外，内皮集落形成细胞的分离、纯化、离体培养和特征在Yoder等，Blood 109：1801-1809(2007)；Ingram等，Blood 104：2752-2760(2004)和Smardja等，Angiogenesis 14(1)：17-27(2011)中被描述，其内容通过全文引用并入本文。

例如，细胞群通过阳性选择或通过阳性选择和阴性选择两者以任一次序的混合而分离。将祖细胞群纯化。纯化的EPC群比从该细胞中分离的粗细胞群含有显著更高比例的EPC。

EPC和EPC子代可以通过任何本领域已知的方法进行冷冻保存直至需要它们。(参见，例如，美国专利第5071741号，PCT国际专利申请WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862和WO98/14058，Karlsson等，65Biophysical J.2524-2536(1993))。可以将EPC悬浮在含有特定冷冻保存剂的等渗溶液中，优选细胞培养基。这种冷冻保存剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油等。这些冷冻保存剂以5-15％(例如，8-10％)的浓度被使用。细胞被逐渐冷冻到-10℃至-150℃的温度(例如，-20℃至-100℃、或-70℃至-80℃)。

本发明分离的内皮祖细胞可直接分化成内皮细胞，或者内皮祖细胞可在维持培养一次之后分化成内皮细胞，同时保持内皮祖细胞的分化状态。

本文使用的术语“内皮细胞”意指表达至少一种内皮细胞标志物比如PE-CAM(CD31)、VE-钙粘蛋白(CD144)、内皮糖蛋白(CD105)和冯维勒布兰德因子(vWF)的细胞。此处，表达CD31的细胞为优选，和表达CD31和CD144两者的细胞为更优选。

内皮细胞可根据其分化阶段更精细地分类。在内皮细胞中，更加未分化的细胞称为“幼年内皮细胞”，和具有分化进展的细胞称为“成熟内皮细胞”。内皮细胞的分化阶段可通过分析转录因子或细胞表面抗原的表达模式来确认。具体来说，单独或组合测量转录因子或细胞表面抗原的表达模式，其中其表达水平根据内皮细胞的分化进展而显著变化。有效确认内皮细胞的分化阶段的标志物包括例如上述内皮细胞标志物(CD31、CD144、CD105、vWF)和CD34。CD34为造血干细胞或内皮祖细胞的标志物。另外，CD34也在幼年内皮细胞上表达。表达CD31和CD34两者的细胞(下文中CD31+/CD34+细胞)为(但不特别限于)幼年内皮细胞的一个实例。

根据用于产生内皮细胞的方法，可产生各种内皮细胞比如血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞或角膜内皮细胞。

通过继续培养内皮细胞可获得更大量的内皮细胞。作为用于该步骤的培养基，可使用通过适当地组合基础培养基和各种组分制备的培养基，并且优选的是该步骤在不存在RepSox的情况下进行。可使用作为用于培养内皮细胞的培养基(例如用于增殖内皮细胞的培养基)销售的市售可得的培养基。例如，内皮细胞可通过使用用于增殖内皮细胞的培养基，并且继续培养同时每1-3天进行培养基更换和传代培养来产生。由此产生的内皮细胞可长期保持内皮细胞的特性。

进一步，所述EPC的来源包括外周血、骨髓、脐血、诱导多能干细胞。

在本发明的具体实施方案中，所述EPC是由iPSC诱导分化而成。

进一步，iPSC可以来源于体细胞，由体细胞诱导分化而成。

所述体细胞可以是干细胞或成熟细胞。这些细胞可以被称为“供体细胞”。成体干细胞是遍布全身的未分化细胞。它们可以通过细胞分裂增殖以补充死细胞并再生受损的组织。已在许多器官和组织中鉴定出成体或体干细胞，这些器官和组织包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝、卵巢上皮和睾丸。它们被认为位于每个组织中被称为“干细胞巢”的特定区域并仅为那个组织提供细胞来源。成体干细胞的类型包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞。

如果收获成熟细胞作为供体细胞，则它们可以来自任何组织、器官、体液或身体分泌物。因此，细胞可以是皮肤细胞、毛囊细胞、血细胞、从尿液中提取的细胞、通过活检之类从任何组织或器官中收集的细胞，这些组织或器官包括但不限于骨骼、牙齿、牙齿组织、心脏、肺、脑、胰腺、肝、肾脏、膀胱、子宫、肠、胃、胆囊、肌肉、脂肪、睾丸、粘膜、眼、包皮、前列腺、脾或任何其他组织。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种细胞群体，所述细胞群体包含前面所述的EC或其前体细胞。

进一步，所述细胞群体可以包含不分泌BDNF的EC或其前体细胞。

进一步，所述细胞群体可以包含iPSC。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包含前面所述的EC或其前体细胞、前面所述的EC或其前体细胞的分泌物、前面所述的细胞群体或前面所述的细胞群体的分泌物。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂。

如本文所用，术语“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是pH缓冲水溶液。合适的药物载剂的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。。

包含此类载剂的药物组合物可通过熟知的常规方法配制。溶剂或稀释剂优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水，生理盐水(例如，氯化钠)，林格氏溶液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，汉克氏溶液(Hank's solution)和其他生理平衡盐水溶液(参见，例如最新版的Remington:The Science and PracticeofPharmacy，A.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins)。

药物组合物被适当地缓冲以供人使用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如，PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够维持生理或弱碱性pH(例如，约pH 7至约pH 9)的Tris缓冲液。在一些实施例中，还可以通过添加合适的张力改性剂如甘油使药物组合物与血液等渗。

在一些实施例中，药物组合物包含在单次使用的小瓶中，例如单次使用的密封小瓶。在一些实施例中，药物组合物包含在多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装包含在容器中。

进一步，所述试剂盒可以包括前面所述的药物组合物。

所述试剂盒还可以包含一种或多种另外的组分，例如容器、试剂、培养基、诱导物、细胞因子、缓冲液、抗体等，以允许细胞进行繁殖或诱导。试剂盒还可以包含用于将药物组合物局部施用(例如，注射)的装置。

本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供另外的组分，例如缓冲液和解释信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(例如，密封小瓶)、瓶、罐、软质包装等。试剂盒的一些组分可以以水性介质或以冻干形式包装。

所述试剂盒还可以标签或包装插页指示药物组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装插页将进一步包括用于将药物组合物施用于个体的说明书。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。

药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防脱髓鞘疾病的其它药剂组合施用。

进一步，所述其他药剂包括但不限于皮质类固醇激素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗生素、维生素B、醋酸格拉替雷、奥瑞珠单抗或其药学上可接受的盐、那他珠单抗或其药学上可接受的盐。

皮质类固醇激素的实例包括地塞米松、甲强龙。

免疫抑制剂的实例包括环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤和环孢霉素A。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的EC或其前体细胞、前面所述的EC或其前体细胞的分泌物、前面所述的细胞群体或前面所述的细胞群体的分泌物的应用，所述应用包括以下任一项：

1)在制备促进髓鞘生成、髓鞘再生或髓鞘修复的药物中的应用；

2)在制备促进神经轴突功能恢复的药物中的应用；

3)在制备招募OPC富集在髓鞘损伤区域的药物中的应用；

4)在制备促进星状胶质细胞反应的药物中的应用；

5)在制备促进少突胶质前体细胞增殖、迁移或成熟的药物中的应用；

6)在制备激活小胶质细胞或巨噬细胞的药物中的应用；

7)在制备促进小胶质细胞或巨噬细胞由M1型向M2型转变的药物中的应用；

8)在制备BDNF中的应用；

9)在制备治疗脱髓鞘疾病的药物中的应用；

10)在制备促进白质重塑的药物中的应用；

11)在制备增加病灶脑组织中小胶质细胞或巨噬细胞数量的药物中的应用；

12)在制备增加病灶脑组织中反应性星形胶质细胞数量的药物中的应用。

进一步，所述脱髓鞘疾病包括中枢神经系统脱髓鞘疾病、外周神经系统脱髓鞘病；优选地，所述脱髓鞘疾病包括多发性硬化症、视神经脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病变、中央脑桥髓鞘溶解症、脊髓病变、脊髓痨、梅毒性脊髓病变、脑白质病变、脑白质营养不良、阿尔茨海默病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、抗MAG外周神经病变、夏柯-馬利-杜斯氏病、易于压迫性麻痹的遗传性神经病变、外周神经病变、视神经病变、进行性炎性神经病变、巴洛同心圆硬化、谢尔德病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、进行性炎性神经病、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脊髓神经病、进行性多灶性白质脑病、帕金森氏病、中风、糖尿病神经并发症、脑小血管病变。

在本发明的具体实施方案中，所述脱髓鞘疾病是中风。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种制备BDNF的方法，所述方法包括培养前面所述的EC或其前体细胞，或前面所述的细胞群体。

优选地，所述方法还可包括收集纯化BDNF的步骤。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括以下任一项：

1)一种促进星状胶质细胞增反应的方法；

2)一种促进少突胶质前体细胞增殖、迁移或成熟的方法；

3)一种激活小胶质细胞或巨噬细胞的方法；

4)一种促进小胶质细胞或巨噬细胞由M1型向M2型转变的方法；

所述方法包括使用前面所述的EC或其前体细胞、前面所述的EC或其前体细胞的分泌物、前面所述的细胞群体或前面所述的细胞群体的分泌物。

在一些实施例中，所述方法包括将所述EC或其前体细胞与所述星状胶质细胞、所述少突胶质前体细胞、所述小胶质细胞或巨噬细胞共培养。

在一些实施例中，所述方法包括将所述EC或其前体细胞的分泌物与所述星状胶质细胞、所述少突胶质前体细胞、所述小胶质细胞或巨噬细胞接触。

在一些实施例中，所述方法包括将前面所述的细胞群体与所述星状胶质细胞、所述少突胶质前体细胞、所述小胶质细胞或巨噬细胞共培养。

在一些实施例中，所述方法包括将前面所述的细胞群体的分泌物与所述星状胶质细胞、所述少突胶质前体细胞、所述小胶质细胞或巨噬细胞接触。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括以下任一项：

1)一种促进髓鞘生成、髓鞘再生或髓鞘修复的方法；

2)一种促进神经轴突功能恢复的方法；

3)一种招募OPC富集在髓鞘损伤区域的方法；

4)一种治疗脱髓鞘疾病的方法；

5)一种促进白质重塑的方法；

所述方法包括给有需要的受试者施用前面所述的EC或其前体细胞、前面所述的EC或其前体细胞的分泌物、前面所述的细胞群体、前面所述的细胞群体的分泌物或前面所述的药物组合物。

进一步，所述脱髓鞘疾病包括中枢神经系统脱髓鞘疾病、外周神经系统脱髓鞘病；优选地，所述脱髓鞘疾病包括多发性硬化症、视神经脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病变、中央脑桥髓鞘溶解症、脊髓病变、脊髓痨、梅毒性脊髓病变、脑白质病变、脑白质营养不良、阿尔茨海默病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、抗MAG外周神经病变、夏柯-馬利-杜斯氏病、易于压迫性麻痹的遗传性神经病变、外周神经病变、视神经病变、进行性炎性神经病变、巴洛同心圆硬化、谢尔德病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、进行性炎性神经病、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脊髓神经病、进行性多灶性白质脑病、帕金森氏病、中风、糖尿病神经并发症、脑小血管病变。

在本发明的具体实施方案中，所述脱髓鞘疾病是中风。

进一步，所述受试者包括哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，个体是人。

如本文所用，“治疗”，“疗法”和/或“治疗方案”是指响应于患者表现出的疾病，病症或生理状况或患者可能易感的疾病，病症或生理状况而进行的临床干预。治疗的目的包括缓解或预防症状，减缓或停止疾病，病症或病况的进展或恶化和/或缓解疾病，病症或病况。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。

基于所治疗的疾病和期望的结果，本领域技术人员可以选择本发明的药物组合物的施用途径。因此，在一个实施方案中，所述药物组合物的施用可通过局部组织注射，经鞘内(例如，施用到椎管内，或施用进入蛛网膜下腔，或施用进入脑蛛网膜下的空间)，或经脑内(例如，施用进入大脑)。在一些实施方案中，所述药物组合物通过鞘内注射施用，例如通过鞘内注射。在一些实施方案中，所述药物组合物通过局部组织注射施用，例如，进入周围神经受损的局部区域。例如，在某些实施方案中，局部组织注射可以进入与受损神经相邻的组织(例如，前列腺，横膈膜，四肢，膀胱，肠等)。

本发明的药物组合物可以单剂量施用。本发明的药物组合物还可以在一段时间(例如，数分钟，数小时或甚至数天)内以多剂量(例如，每次治疗两次，三次或更多次单剂量)施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可以在以下的时间段中施用：约1秒至约3分钟，例如，约60秒至约120秒，或约90秒至约120秒，或超过约60秒至约180秒，超过约90秒至约180秒，或超过约1秒至约15秒，或超过约5秒至约15秒，或超过约1秒至约30秒，或超过约5秒至约30秒，或约15秒至约60秒，或约15秒至约90秒。

本发明的EC或其前体细胞、包含其的细胞群体可以以治疗有效浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物中的细胞浓度为约1×10

任何合适的药学上可接受的载体可用于本发明的组合物中。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体是林格氏乳酸盐溶液。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体是林格氏溶液，Tyrode溶液或盐溶液。

术语“脱髓鞘”，也称为“脱髓鞘疾病”，为发生在神经系统中的髓鞘被损害的病理过程。髓鞘是由称为少突胶质细胞的神经胶质细胞在CNS中以及雪旺细胞在PNS中形成的脂肪物质。对髓鞘的破坏损害了在受影响的神经中的信号传导。因此，传导能力的降低导致感觉、运动、认知和/或取决于所涉及的神经的其他功能的不足。脱髓鞘过程可能是由于遗传、传染原、自身免疫反应以及未知因素引起的。根据神经系统中脱髓鞘的主要部位，这些疾病分为涉及CNS的中枢脱髓鞘和影响PNS的外周脱髓鞘。脱髓鞘疾病还可以根据炎症的存在或缺乏分为炎性和非炎性疾病，并且可以根据脱髓鞘的根本原因进一步分为髓鞘碎裂性疾病(myelino-clastic disease)，其中正常和健康的髓鞘被有毒、化学或自身免疫性物质破坏；和脱髓鞘性白细胞营养不良疾病，其中该髓鞘异常并退化。

如本文所用，术语“治疗”涉及以脱髓鞘为特征或与脱髓鞘相关的疾病、障碍或病症，是指如上所述的治疗有效量的药物组合的施用，其有效缓解与所述疾病、障碍或病症相关的不良症状；在此类症状出现之前预防它们出现；减慢所述疾病、障碍或病症的进展；减缓症状的恶化；增强缓解期的开始；减缓在所述疾病、障碍或病症的进展性慢性阶段引起的不可逆的损害；延迟所述进展阶段的开始；减轻所述疾病、障碍或病症的严重性或治愈所述疾病、障碍或病症；提高存活率或更快恢复；和/或预防所述疾病、障碍或病症的发生。

附图说明

图1显示神经脱髓鞘模型构建成功的结果图，其中A：注射模式图；B：损伤前；C：损伤后；

图2显示hiPSC-EC移植对髓鞘再生影响的结果图；

图3显示OPC富集在损伤区域荧光图；

图4显示增殖实验的结果图，其中A：细胞培养模式图，B：荧光图，C：统计图；

图5显示迁移实验的结果图，其中A：细胞培养模式图，B：荧光图，C：统计图；

图6显示EPC中基因表达丰度统计结果图；

图7显示EPC中信号通路基因富集程度结果图。

具体实施方式

除非另有指明，否则“一”或“一个”是指“一个或多个”。

除非特别限定，否则本文使用的所有技术术语和科学术语应被视为具有与本领域(例如在干细胞生物学、细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)的普通技术人员理解的相同的含义。

除非另有说明，否则在本发明中使用的细胞培养和免疫学技术是本领域的技术人员所公知的标准方法。这种技术通过文献来源来描述和解释，例如J.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)；J.Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour实验室出版社(1989)；T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology:A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRL出版社(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning:A Practical Approach，第1-4卷，IRL出版社(1995年和1996年)；以及F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988年，包括直到目前的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour实验室(1988)；以及J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons(包括直到目前的所有更新)，并且其通过引用并入本文。

实施例1hiPSC-EC移植对髓鞘形成的影响

1、构建神经脱髓鞘小鼠模型

采用1％的lysoletinin(Lyso)直接注射在小鼠corpus callosum(CC)部位造成神经脱髓鞘(注射模式图见图1A)，具体方法参考文献(A new EAE model of braindemyelination induced by intracerebroventricular pertussis toxin.BiochemBiophys Res Commun.2008May 23；370(1):16-21)。同时使用环孢素以防止异种排斥反应。

2、由iPSC诱导分化形成EPC/EC细胞

步骤：采用专利技术(参见公开号：CN108384746B，专利名称：一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法)，将iPSC诱导分化形成EPC/EC细胞。

3、检测iPSC诱导产生的EPC分泌BDNF

步骤：将iPSC诱导产生的EPC采用4％多聚甲醛固定20分钟，随后用BSA封闭30分钟，接着加入BDNF鼠源一抗4℃条件下过夜孵育，洗涤后继续室温孵育携带绿色荧光的抗鼠二抗1小时，洗涤后采用共聚焦荧光显微镜观察荧光强度并拍照。

4、EC细胞移植

步骤：方法参考文献(Endothelial cells support survival,proliferation,and neuronal differentiation of transplanted adult ischemia-induced neuralstem/progenitor cells after cerebral infarction.Stem Cells.2009Sep；27(9):2185-95)。

5、结果

图1B和图1C结果显示，利用本实施例的方法成功构建了神经脱髓鞘模型。

图2结果显示，移植hiPSC-EC 8天后，通过免疫组织化学分析发现脱髓鞘部位的神经髓鞘再生。

结果显示，iPSC诱导产生的EPC可以分泌BDNF，分泌的量高于神经母细胞瘤SHSY5Y的分泌量。BDNF是一种神经营养因子，可以促进神经元的发育与生长再生具有维持和促进作用。

实施例2hiPSC-EC移植对神经再髓鞘化和轴突修复的影响

为了评估hiPSC-EC(人诱导性多能干细胞诱导分化而成的EC)移植对脱髓鞘诱导的轴突损伤的神经元保护的影响，将corpus callosum(CC)脱髓鞘区域的轴突用NF200标记。hiPSC-EC移植有效地提高了NF200标记的染色强度(采用FujiIntDen统计荧光强度，hiPSC-EC组0.82高于对照组的0.24，p<0.05)，NF200+纤维结构更清晰，意味着神经保护或快速恢复。这种轴突保护与iPSC-EC移植促进的髓鞘脂保护/再髓鞘化有关。注：对照组按同样方法注射了与hiPSC-EC组相同体积的溶媒(即PBS溶液)。

实施例3hiPSC-EC移植对招募OPC富集的影响

1、步骤

采用1％的lysoletinin(Lyso)直接注射在小鼠corpus callosum(CC)部位造成神经脱髓鞘，具体方法参考文献(A new EAE model of brain demyelination induced byintracerebroventricular pertussis toxin.Biochem Biophys Res Commun.2008May23；370(1):16-21)。同时使用环孢素以防止异种排斥反应。造模3天后在损伤原位移植hiPSC-EC，8天后观察OPC在损伤区域的富集情况。为了更好地观察内源性OPC的富集情况，采用携带SOX10-GFP报告基因的小鼠品系(英国UCL大学的W.Richardson教授馈赠)开展上述试验。

2、结果

结果显示，移植后可以看到OPC富集在损伤区域(图3)。

实施例4hiPSC-EC促进了OPC的生长、迁移和成熟

1、增殖实验

为了评估hiPSC-EC对OPC的影响，用transwell共培养体系培养hiPSC-EC和OPC。其中大鼠OPCs在井底播种，hiPSC-EC镀在transwell膜上(培养模式见图4A)。使用OPC培养基(DMEM-Sato基础生长培养基中添加10ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor和10ng/ml PDGFAA(platelet-derived growth factor AA)培养4天后，总Olig2+OPC细胞数显著增加，且总Olig2+OPC细胞中Ki67+Olig2+OPC细胞的增殖率最高(比对照组高出55.10％，p<0.05)(结果见图4B-C)。

2、迁移实验

OPC置在插入物的膜上，在井中生长hiPSC-EC(培养模式见图5A)。在hiPSC-ECs存在的情况下，通过孔隙迁移到膜底部的OPC量显著增加(比对照组高出38.2％，p<0.05)(结果见图5B-C)。

3、分化实验

接下来，测试hiPSC-EC是否会影响OPC的分化。当与hiPSC-EC共培养的OPC切换为分化条件(DMEM-Sato基础生长培养基中添加T3，T3浓度为30ng/ml)2天时，总Olig2+细胞中新形成少突胶质细胞的MBP比例与非hiPSC-EC共培养细胞没有显著差异。然而，hiPSC-EC共培养组中，具有结构更复杂、更长的突起的MBP标记细胞所占百分比增加了(对照组12.2％，hiPSC-EC组53.6％，p<0.01)。这表明，从hiPSC-ECs中释放出来的因子并没有加速从增殖到分化的转变，而是促进了新形成的少突胶质细胞的成熟。

实施例5hiPSC-EC移植对星形胶质细胞的影响

星形细胞在修复中枢神经系统脱髓鞘中起着关键作用。为了阐明iPSC-EC移植后星形胶质细胞的反应，我们观察了它们在结构和GFAP标记上的激活。与对照组相比，在hiPSC-EC组病变的周围区域，反应性星状胶质细胞的区域密度更高，表现为更强的GFAP标记和更厚的细胞结构(细胞体和突起)。通过计数GFAP+物体与覆盖网格的交叉点来量化反应性星形胶质细胞，发现在iPSC-EC组中，较厚的GFAP标记细胞突起结构的比例明显较高(16.6％control vs 38.9％hiPSC-EC，P<0.01％)。所有这些都表明hiPSC-EC移植会导致了更广泛的星形胶质细胞反应进一步表明了这两种细胞类型之间的交叉对话。

实施例6hiPSC-EC移植对小胶质细胞/巨噬细胞的影响

Microglia表型对再髓鞘化有强烈影响，而损伤后有效的髓鞘修复需要小胶质细胞(M2表型)的主要亲再生反应。为了评估hiPSC-EC移植对小胶质细胞/巨噬细胞激活的影响，检查了IBA1和CD11b标记的小胶质细胞/巨噬细胞，hiPSC-EC移植后病变区域中IBA1标记细胞染色强度更高，这也反映在hiPSC-EC移植后的病变区域中CD11b+结构的面积密度大于对照CC(52.57％对照和90.07％hiPSC-EC，p<0.05)。

为了评估hiPSC-ECs是否改变了小胶质细胞表型，在病变区域用m2标记Arg1双标记了小胶质细胞/巨噬细胞(CD11b+)。免疫组化学表明，hiPSC-EC移植后，病变区域Arg1+CD11B+双标记细胞密度显著增加(control：27.28/mm2 vs hiPSC-EC：57.54/mm2，p<0.01)，Arg1标记Arg1+在总CD11b+细胞中的比例也增加(48.38％vs 65.88％，p<0.05)。这些数据表明，hiPSC-EC调节了小胶质细胞/巨噬细胞的激活，并促进了表型M1切换为M2，这对OPC的分化和成熟有益。

实施例7hiPSC-EPC/EC与天然EPC/EC的区别

1、收集天然EPC/EC

采用脐带血来源的EPC/EC，EC分离和培养的方法如前所述(Sci Rep 20177(1)：14749，J Cell Sci 2016 129(2):290-7)。EPC的分离和培养方法如前所述(Hypertension2012 59(5):1037-43)。

2、RNAsquence

采用RNAsquence对比天然EPC/EC和hiPSC-EPC/EC。结果如下：

通过3批iPSC来源的EPC的RNAseq的测序，同时和自然EPC RNAseq测序进行比较，得出结论：iPSC来源的EPC表达自然EPC所有的特征基因(531个)和表达97.39％(14824个)自然EPC的基因；iPSC诱导EPC和自然EPC主要的组成部分都是内皮祖细胞(EPC)和内皮细胞(EC)，含有一致的特征基因。然后根据不同类型细胞的特征基因及FPKM累计表达值做统计和比较，可得出iPSC来源EPC含有更多的内皮祖细胞(EPC)，同时说明iPSC诱导的EPC具有更好基因表达丰度(图6)。

531个特征基因如下：UBXN11，LRRC75A，MMACHC，FXYD5，VMP1，KRT18，YIPF2，CNP，SPATA21，SAP30L-AS1，SLC12A6，ANP32E，CTNNB1，VIM，CNN3，RPL8，YWHAH，SDC4，HIST1H4I，SRPX2，DNASE1，MYO19，SH3KBP1，ASAP1，RNF24，SPNS2，S100A11，SOX4，RNF214，PLP2，PIH1D2，SGPL1，ELK3，F3，UGDH，RBMS2，FMNL3，RPL6，ATP2A1，EFCAB10，SLC12A2，UCKL1-AS1，ARHGAP18，RPE，SFT2D2，CXCL16，PAICS，ZBTB11-AS1，CLIC1，CERS5，CCDC85C，DHRS7，CTRL，TYMS，SPCS1，IFITM3，RPS27，RPL34，MZF1-AS1，TRAM1，SUPT7L，NOL9，MFSD11，PLD4，NQO1，NEAT1，GNAS，LDHA，UNKL，LDHB，CENPK，C1orf174，HSP90B1，TCF7L2，LENG8，IQGAP3，ANKRD13D，NPC1，MYH11，ATP2B4，FANCD2，TNRC6B，DDX17，TIRAP，HERC4，DSTN，FOXP3，ABL2，KDELR2，CCDC50，PARK7，CAPN2，ACAP1，SLC13A4，SEPT11，RAPH1，KRT8，LMO3，CIRBP，CYP20A1，LY6E，FAM69A，PRSS3，MEST，NPB，CLMP，MSN，SUCLA2，PCMTD1，PSMC3，TOMM7，GCHFR，MEIS1，TRIAP1，USP34，SPAG1，RPL39L，PDK1，LARS，MAP4K4，QTRT1，CLK1，TSC22D1-AS1，IL1B，MKRN2OS，ARL16，TSPAN13，HMGCS1，PSAP，SLC44A2，TNFRSF10B，MSC，ENG，TLDC2，TRIM41，CPM，CREB3L2，NSUN6，AHCY，NCBP1，N4BP2L2，RAB31，RNF149，SRPK2，SBDS，NAMPT，AES，SERPINF1，RPS27L，HAUS2，AP4B1-AS1，KDM2B，USP6NL，TONSL，FBLIM1，SLC31A2，ADGRL1，EFHC1，SMAD9，SLC7A11，LPIN1，DDAH2，SCAF11，BBS1，PCYOX1，CD55，PMEL，TOR1B，UBQLN1，DUSP5，CUEDC2，FKBP5，LMF2，LYRM7，NSG1，SAT2，LMAN1，NFX1，COMMD1，CCPG1，NINJ1，RNASEH1，SPATA5，CENPW，DNAJC4，PTTG1，TMEM109，MCTS1，TMEM63A，FBN1，TPM1，MAVS，ADPRHL2，CTSK，INSIG1，C16orf74，MAZ，MEG3，RFTN2，AGAP6，GPC6，PDLIM5，SLC25A5-AS1，RSL1D1，FAM219B，CFLAR，GNPTAB，PIGU，ITGB3BP，NTM，ZNF106，RPRD1B，ETS1，ITGAE，ECSCR，SND1，TRIO，SEC61G，CDR2，CRMP1，PNISR，OXLD1，PRKACA，NFKBIZ，MORN2，RAB3D，CRKL，MSL1，TMPO，GALNT2，CRELD2，ETS2，ALKBH4，PHF19，POLH，TRRAP，NET1，ADGRE5，GAS6，VEZF1，BMPR2，SMAD3，GFOD1，RABGAP1L，SLC39A7，TCTN1，CSRNP1，LRRN3，TNRC6A，MFAP2，TMEM98，SPATC1L，LINC00476，CENPQ，CSTF3，SLC8A1，E2F7，RPL7L1，ZFHX4，TXNDC11，STK4，STX16，TMEM11，PTK6，ZFAS1，U2AF2，TRIM16，ZBTB7A，P3H3，TMCO3，C15orf39，ACVRL1，SHQ1，GNS，SPRY1，DIAPH2，DLC1，TCF3，FAM229A，PTGES3L，RRP7A，MGRN1，GIT2，UBE2T，CSGALNACT2，EFEMP2，CSNK1E，MAGED2，C5AR1，ARHGAP45，TMEM234，RNF213，SIDT2，TEX2，MCM3，TMEM67，ZKSCAN1，SLC2A1，MAD2L1，MGLL，NR3C1，PHGDH，SYT1，RERE，KIF1B，NCAPD3，NADK，FOXRED2，GNB5，TMEM204，USP24，KIF20B，GADD45B，ZNF135，TACC3，FOSB，ACOT9，EBF1，MYO1E，PPP1R10，NFKBIB，ROBO4，TPGS1，CFD，KIF22，EIF4A3，RNF14，NPAT，STX11，CDCA7，ST6GALNAC4，RBL1，NIF3L1，GLCE，CDCA7L，RASA3，STK10，EDNRA，ICA1L，DCTN5，GNG2，PTPN2，BST1，BMP1，RPS6KA2，SEC11C，TRMU，H1F0，STXBP5L，AP5B1，STAM，MCM2，ALDH3B1，SLC23A2，TNFAIP3，KLF7，DIP2C，KMT2B，GALNT7，NUAK2，PLXNA4，MRI1，FLNB，MBOAT2，TMEM136，AP3M2，ACSS2，AARS，DUS3L，NGLY1，ZNF274，ICAM1，FAM129A，PPP6R1，TIE1，NUMBL，PLXND1，ENC1，CCDC142，BCAN，PRR15，FLRT2，NUCB2，TARS2，POLB，RAB24，KBTBD6，SLC38A4，MAP2，PMP22，TOP3A，VAMP2，UBTD2，PLK4，MAPK8IP3，APBA2，TBC1D17，ZNF444，PLEKHG4B，MTOR，STIL，GBA，IFT88，B9D1，RAMP1，S1PR3，SHISA9，MOCS3，CEP104，TIAM1，KIF15，ZNF793，ZNF865，ABCB10，ANKHD1-EIF4EBP3，CMPK2，SYTL3，SHROOM1，SPATA6，PPP2R3B，TNFSF13B，FKBP7，CNTROB，PEX11A，LHFPL2，DOK3，ARMC9，RANBP10，ZNF561，SCAMP5，ARHGAP39，DENND3，ATP9A，DCPS，ZNF302，ARHGAP9，IP6K1，ADAM22，EMCN，CYFIP2，WDR90，PPM1M，C1QTNF6，DACH1，BMF，SETD4，TBC1D9，PIK3IP1，P4HTM，CD101，SCPEP1，TLDC1，GTPBP10，TAP2。

细胞所有的功能都是由信号通路进行调节，信号通路在一定程度上能够反映细胞的功能。通过KEGG分析RNASeq的结果，iPSC来源的EPC包含所有自然EPC重要的信号通路(KEGG分析)，且在几个关键的功能调控信号通路上(PI3K/Akt，Notch，MAPKs，Jak-STAT)具有更多的信号基因的表达以及更高的基因富集程度(图7)。反映了iPSC来源的EPC在功能上优于自然来源的EPC细胞。诱导的EPC能够更好的在功能上符合EPC在内皮及血管的修复功能，可以排除因衰老、生理和病理等因素造成的基因表达下调。

通过以上分析得出结论：iPSC诱导EPC和自然EPC主要的组成部分都是内皮祖细胞(EPC)和内皮细胞(EC)，含有一致的特征基因。iPSC诱导的EPC，RNASeq结果比较一致反映了iEPC在体外诱导，没有复杂的因素刺激，批次间的差异小。不同的自然EPC RNASeq结果差异大，这真实反映了在不同个体，由于每个人的不同生理病理状态，这些生理病理的过程会上调、下调或沉默某些基因的表达。同时，从人体内分离出来的自然EPC包含着不同衰老状态的细胞的集合体，因此与衰老相关的基因表达会因为个体有很大差异。而IPSC来源的EPC的细胞年龄是比较一致的。

综上所述，由于iPSC来源的EPC在功能上优于自然来源的EPC细胞，故将iPSC来源的EPC用于临床治疗时如治疗神经髓鞘性疾病时效果应该比自然的EPC效果要强。

实施例8hiPSC-EPC移植的影响

蛋白是细胞功能的执行者，通过RNAseq的比对，IPSC来源的EPC包含所有自然EPC重要的信号通路(KEGG分析)，且在几个EPC功能相关的信号通路上(PI3K/Akt，Notch，MAPKs，Jak-STAT)富集程度显著高于自然EPC，反映了iPSC来源的EPC在功能上优于自然来源的EPC细胞。通过移植实验也可以证明，由于分化的细胞年龄年轻，因此功能更加稳定。