一种猪circRNA序列及其应用、成环鉴定方法

摘要

本发明基于最常见的一类肠道炎症性疾病——仔猪细菌性腹泻（PDW），其中F18大肠杆菌（E.coli F18）是引起断奶仔猪细菌性腹泻的主要病原，而地方品种猪对其抗性的调控机制有待系统阐明。前期通过组学测序筛选出1个大肠杆菌F18感染调控的关键候选RNA—circRNA_27388，由于circRNA_27388本体基因为FUT8，因此将其命名为circ_FUT8，在此基础上，本研究对circ_FUT8序列进行成环鉴定，为后续验证circRNA功能及调控机制奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及仔猪细菌性腹泻（PDW）circRNA中circ_FUT8的成环验证及其应用。

背景技术

F18大肠杆菌是导致当今养猪业断奶仔猪细菌性腹泻的重要致病病原菌之一，它与其所释放的脂多糖直接与小肠上皮细胞上的受体结合，致使小肠上皮细胞发生病变，从而导致仔猪出现水肿和腹泻等症状。因此，断奶仔猪能否抵抗大肠杆菌F18侵染，首要在于小肠黏膜上皮细胞的大肠杆菌F18受体是否表达。国外研究发现1型H抗原，参与组成ABH血型抗原，是F18大肠杆菌黏附受体的最小抗原决定簇，主要由α-（1, 2）岩藻糖转移酶（FUT2酶）催化，而FUT2酶的功能活性由FUT1和FUT2基因共同调控；国外学者发现FUT1基因可以影响 F18大肠杆菌受体蛋白的表达，且FUT1基因M307位点的遗传突变可作为国外猪大肠杆菌F18腹泻的抗病育种标记，但不适合中国地方猪品种。因此，迫切需要深入探讨断奶仔猪在抵抗大肠杆菌F18侵染时的分子机理，以期挖掘和鉴定与仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染存在关联的关键候选基因。

环状 RNA（circRNA）是近年来继微小RNA（microRNA）和长链非编码 RNA（lncRNA）研究之后发现的一种新的内源性非编码RNA，是RNA研究领域的一个热点。与其他线性非编码RNA不同，circRNA不具备5’末端帽子和3’末端poly（A）尾巴，是以共价键形成闭合的连续环（Qu et al., 2015）。随着高通量测序技术的发展，截止到2013年，研究人员已从RNA-Seq数据中鉴定出人类、小鼠、线虫中的circRNA数目分别为1950种、1903种和724种。目前对circRNA功能的研究主要集中在与miRNA互作、蛋白调控以及癌症等疾病方面，然而关于猪circRNA研究相对比较少。

发明内容

对于F18大肠杆菌引起的仔猪腹泻病，本研究前期以梅山断奶仔猪为对象，通过系统的大肠杆菌感染攻毒试验，经过表型观测和肠段中的菌株定量、组织学检查、肠道中菌株黏附性定量检测、粪便中的菌株定量、大肠杆菌毒力基因的检测等一系列试验，获得了F18大肠杆菌抗性型和敏感型断奶仔猪，并利用多组学测序及联合分析已经筛选出1个关键环状RNA—circRNA_27388，由于circRNA_27388本体基因为FUT8，因此将其命名为circ_FUT8，在此基础上，本研究对circ_FUT8序列进行成环鉴定，为后续验证circRNA功能及调控机制奠定基础。

有鉴于此，本发明实施例提供一种猪肠道circ_FUT8序列成环的鉴定方法，主要目的是为其在仔猪抗大肠杆菌肠道腹泻的功能验证。

circRNA 的功能验证的前提是候选circRNA在细胞质或者核能以环状的形式存在，方可对其进行进一步的功能展开研究。因此本申请想通过对仔猪肠道circ_FUT8的成环验证，以期获得其标准的操作流程。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

第一方面，一种与猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性相关的circRNA，命名为circ_FUT8，其序列如下：

CATGTAGAATCCATGAAGCACAGGTAAATAAAGCTTCCTACTGATACCACCAGGAAAATCTCTTTGAAAGAGTCACCACAGGACTACCACAGAGACTAATTTGTCTGAAGCATCATGTGTTGAAACAAGAGAGGACTGCTGGCCTTGCACAAGCTAGAAACAGAGTTACGATGTTTTCAATTCTTTGAGCTCTAGGAAGCCACGAAAGTGAGTTGAAAGTCTGAAAATGCGGCCATGGACTGGTTCGTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTGCTATTTTACATAGGTGGTCACTTGGTACGAGATAATGACCACTCTGATCACTCTAGCCGAGAACTGTCCAAGATTTTGGCAAAGCTGGAACGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAATCTCTCCGAATACCAGAAGGCCCCATTGATCAGGGGCCAGCTTCAGGAAGAGTTCGTGCTTTAGAAGAGCAATTTATGAAGGCCAAAGAACAGATTGAAAATTATAAGAAACAAACTAAAAATGGTCCAGGGAAGGATCATGAAATCCTAAGGAGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAGTTGAAGAAATTAAAGAATTTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAATTTCTATCAGATTTGGGACATCATGAAAGGTCTATAATGACGGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGGGGCAGGTGATTGGCGTGAAAAGGAGGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGAGAATAACATATCTTCAG（SEQID NO:1）。

第二方面，提供一种检测仔猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂，所述试剂检测样品circ_FUT8表达水平。

优选的，所述的试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circ_FUT8表达水平。

优选的，所述的试剂采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circ_FUT8的表达水平。

优选的，试剂含有与circ_FUT8杂交的探针或扩增circ_FUT8的特异性引物。更优选的，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3。

优选的，所述的试剂，样品为猪小肠上皮组织。

所述circ_FUT8用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性中的应用；

所述的circ_FUT8用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用；

所述的circ_FUT8用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。

所述试剂用于预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性中的应用；

所述试剂用于制备预测或辅助预测猪对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性的试剂中的应用；

所述试剂用于选育具有对大肠杆菌或细菌性腹泻抗性猪中的应用。

所述的circ_FUT8 的成环鉴定方法，包括：

以猪小肠上皮细胞基因组DNA以及反转录cDNA为模板，设计成环引物和定量引物，利用RT-PCR扩增显示circ_FUT8不能在线性化基因组DNA中扩增出来，仅仅在反转录cDNA文库中；

放线菌素D处理猪小肠上皮细胞一定时间后，环状circ_FUT8比本体基因FUT8表现出更好的稳定性；

利用RNA线性化酶处理猪小肠上皮细胞一定时间后，环状circ_FUT8表达水平基本不受到影响，而线性化FUT8、GAPDH基因表达水平出现极显著下降。

所述成环引物序列为：F: 5’-GACTTGAGGAGAATGGCTGAAT-3’ （SEQ ID NO:2）；

R: 5’-TTCATTTTGTTGTTTTAAGCGT-3’ （SEQ ID NO:3）。

所述定量引物序列为：F: 5’-TGGTCCAGCGGAGAATAACATATC-3’ （SEQ ID NO:4）；

R: 5’-TTAGTCTCTGTGGTAGTCCTGTGG-3’ （SEQ ID NO:5）。

附图说明

图1抗性与敏感型猪差异表达circRNA聚类分析筛选circ_FUT8；

图2 circ_FUT8序列特征分析及PCR扩增、测序验证；

图3 cDNA和基因组DNA定量检测circ_FUT2和FUT8表达；

图4放线菌素D（Actinomycin D）处理IPEC-J2细胞，检测circ_FUT8和FUT8表达；

图5 RNA线性化酶（Rnase R）处理IPEC-J2细胞，RT-PCR检测circ_FUT8和FUT8表达；

图6 RNA线性化酶（Rnase R）处理IPEC-J2细胞，qPCR检测circ_FUT8和FUT8表达；

图7 circ_FUT8在IPEC-J2细胞中的核质分离定位，U6为细胞核，GAPDH为细胞质；

图8 circ_FUT8在IPEC-J2细胞中的RNA FISH定位，U6为细胞核，18S为细胞质。

具体实施方式

1. 材料与方法

1.1 RNA和基因组DNA（gDNA）提取

本研究使用Trizol抽提试剂盒（Invitrogen, USA）提取猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）总RNA，按照说明书操作加入裂解液对细胞进行裂解，随后加入结合液混匀过柱，用洗涤液过柱清洗两次，最后洗脱RNA并检测RNA的纯度、浓度和完整性。细胞基因组DNA（gDNA）提取按照试剂盒（Sangon Biotech, China）说明书进行操作。

1.2 RNase R处理、cDNA合成以及PCR扩增

取相同等分的RNA（2 μg）样本，在37 °C下加入3 U/μg RNase R（EpicenterTechnologies, USA）共孵育30分钟，其次通过RNeasy MinElute纯化试剂盒（Qiagen,Germany）进行处理。根据反转录试剂盒说明书进行操作，以RNA为模板进行cDNA合成根据反转录试剂盒说明书进行操作，以RNA为模板进行cDNA合成。针对环状RNA-circ_FUT8序列全长进行PCR扩增，引物F: 5’-GACTTGAGGAGAATGGCTGAAT-3’ （SEQ ID NO:2）；R: 5’-TTCATTTTGTTGTTTTAAGCGT-3’ （SEQ ID NO:3），PCR产物进行2%琼脂糖检测和测序分析。

1.3 荧光定量PCR（qRT-PCR）

实时荧光定量PCR扩增体系20 µL：cDNA（100~500 ng）1 µL，上游和下游引物（10 µmol•L

1.4 放线菌素D（Actinomycin D）处理

IPEC-J2细胞中加入2 μg/ml放线菌素D（Actinomycin D）进行培养，在不同培养时间下（0h、12h、24h）分别提取细胞RNA，进行荧光定量PCR检测。

1.5 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）

（1）脱蜡

首先利用二甲苯脱蜡，脱蜡3次，每次5 min，之后加入无水乙醇洗涤两次， 2 min/次；放置在湿盒中除去表面的无水乙醇，静置于通风橱内干燥。

（2）蛋白酶处理

将染色缸置于37℃水浴锅中预热，首先加入40 mL 2×柠檬酸钠缓冲溶液，等待至缓冲液温度上升后添加蛋白酶K，搅拌混匀继续孵育20 min备用，取出切片使用孵育好的缓冲液进行3次洗片，1 min/次，随后使用50%无水乙醇、70%无水乙醇、80%无水乙醇、95%无水乙醇和100%无水乙醇在-20℃下进行梯度脱水。

（3）变性

首先配置不同梯度的无水乙醇（50%无水乙醇、70%无水乙醇、80%无水乙醇、95%无水乙醇和100%无水乙醇），放置于-20℃预冷，随后在染色缸中添加40 mL变性缓冲液，水浴锅设置温度为78℃，温度达到后将染色缸置入水浴锅孵育8 min，快速转移至此前准备的不同梯度无水乙醇中进行脱水，完成后放置于通风橱内干燥。

（4）杂交

探针的设计和制备交由武汉金开瑞生物工程有限公司完成，将处理后的切片置于湿盒中，使用移液器吸取10 μL探针轻轻打在切片样本处，盖上盖玻片，随后放置于37℃孵育箱中盖上湿盒密闭条件下过夜孵育。第二天轻轻夹取盖玻片后将切片放置于病理切片架上43℃水浴锅中进行杂交，随后置于水流下轻轻冲洗15 min。随后使用预热好的2×柠檬酸钠缓冲液洗涤10 min，洗涤两次。清洗后放置于PBS缓冲液中洗涤片刻取出后置于湿盒，用移液器吸取30 μL罗丹明抗-地高辛抗体添加至切片上盖上塑料盖膜，孵育箱中孵育20min，随后去除盖膜置于PBS缓冲液中浸泡洗涤3次，5 min/次。取出切片后放置于湿盒中轻轻倾斜湿盒以去除切片表面的液体，使用移液器添加30 μL抗卵白素抗体至切片上轻轻贴上盖膜，孵育箱中孵育20 min，随后同样去除盖膜置于PBS缓冲液中浸泡洗涤3次，5 min/次。

（5）核染

最后进行细胞核的染色，将切片从病理切片架上转移至湿盒中，使用移液器吸取20 μL DAPI滴加至切片上，盖上盖玻片后放置于孵育箱中孵育5 min，即可通过荧光显微镜进行观察拍照。

1.6 核质分离测定

使用Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit对IPEC-J2的核质RNA进行分离提取。

（1）细胞组分制备

培养IPEC-J2细胞直至细胞量达到1×10

（2）细胞质RNA与柱结合

使用移液器吸取200 μL Buffer SK添加至包含细胞质RNA的上清液中，使用涡旋振荡器充分混匀，随后吸取200 μL无水乙醇继续振荡混匀，最后将充分混合后的溶液添加到旋转柱中，柱插入2 mL离心管中，并以6000 RPM离心1 min，丢弃流通液，重新组装离心柱及其收集管。

（3）细胞核RNA与柱结合

使用移液器吸取400 μL Buffer SK加入细胞沉淀中，使用涡旋振荡器充分混匀，随后吸取200 μL无水乙醇继续振荡混匀，最后将充分混合后的溶液添加到旋转柱中，柱插入2 mL离心管中，并以6,000 RPM离心1 min，丢弃流通液，重新组装离心柱及其收集管。

（4）RNA洗脱

将离心柱放入新的1.7 mL 洗脱管中，将50 μL Elution Buffer E加到离心柱中，以2000 RPM离心2 min，然后以14000 RPM离心1 min，纯化的RNA 样品置于-70°C进行长期保存。

1.2 结果与分析

本研究前期已经通过攻毒后表型以及体外黏附试验等综合分析获得确证的梅山猪F18大肠杆菌敏感型与抗性型个体各3头，在此基础上进行了circRNA测序分析，F18大肠杆菌敏感组与抗性组间筛选出152个差异表达circRNA（pvalue<0.05&|log2FC|>1），其中敏感组上调46个，挑选前30个进行聚类可视化分析（图1），针对环状RNA本体基因以及结合前期转录组测序结果，本研究筛选出1个感兴趣circRNA—circ_FUT8。对于本体基因FUT8而言，包含13个外显子区域，并且通过PCR扩增及测序分析鉴定circFUT8成环特征，其全长为823 bp，由外显子5~外显子8（位于染色体ch7: 89519703-89589111）环化而成（图2）。以IPEC-J2细胞基因组DNA（gDNA）以及反转录cDNA为模板，分别设计成环引物和普通定量引物，利用RT-PCR扩增显示circ_FUT8不能在线性化基因组DNA（gDNA）中扩增出来，仅仅在反转录cDNA文库中（图3）。放线菌素D处理IPEC-J2细胞12h、24h后，环状RNA circ_FUT8比本体基因

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种猪circRNA序列及其应用、成环鉴定方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 823

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgtagaat ccatgaagca caggtaaata aagcttccta ctgataccac caggaaaatc 60

tctttgaaag agtcaccaca ggactaccac agagactaat ttgtctgaag catcatgtgt 120

tgaaacaaga gaggactgct ggccttgcac aagctagaaa cagagttacg atgttttcaa 180

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