利用基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性

摘要

本发明提供了一种利用基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性的方法。利用这一方法可以快速培育高抗水稻黑条矮缩病的水稻品种，减少病害带来的损失。

说明书

技术领域：

本发明涉及利用基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性，属于农业科学技术领域。

背景技术：

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)属于呼肠孤病毒(Reoviridae)科，斐济病毒(Fijivirus)属，通过昆虫介体灰飞虱以持久性方式传播。在我国，RBSDV引起水稻黑条矮缩病，感病植株症状为浓绿矮缩，不抽穗或穗小。发病田块一般减产10％-40％，重病田甚至颗粒无收。虽然目前对RBSDV的病毒粒子形态、基因组序列和编码蛋白理化特性等已有较多的研究，但水稻抗病毒机制还少见报道。由于生产上缺乏抗病品种，该病害的防控主要依赖化学农药防治传毒介体昆虫。因此，利用CRISPR-cas9基因编辑技术创制抗病水稻材料，培育抗病品种，对当前水稻生产有重要的意义。

CRISPR-cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-CRISPR associated genes 9)基因编辑系统广泛存在于细菌及古细菌中，是机体长期进化过程中形成的RNA介导降解病毒或噬菌体DNA的适应性免疫机制(Makarova etal.，Nat.Rev.Microbiol.，2015，13：722-736)。Cas9是由1490个氨基酸组成的核酸酶，包含RuvC-like和HNH核酸酶功能域(Dominguez et al.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2016，17：5-15)。Cas9可以切割与crRNA互补配对的双链DNA，切割位点位于PAM(protospacer adjacentmotif，NGG)上游3nt处产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)(Gaj et al.，Trends Biotechnol.，2013，31：397-405)。DNA损伤产生的DSBs激活细胞内非同源末端连接(non-homologous ending-joining，NHEJ)或同源重组(homologous re-combination，HR)两种不同的修复机制对损伤的DNA进行修复，从而实现对基因组的定点编辑(Wyman andKanaar，Annu.Rev.Genet.，2006，40：363-383)。CRISPR-cas9技术已经在细菌、酵母、动物、植物中得到广泛应用。

由于CRISPR-cas9基因编辑系统的作用靶标为DNA，在植物抗病毒研究中，CRISPR-cas9基因编辑最先应用于DNA病毒双生病毒科(Geminiviridae)的抗性研究。烟草瞬时表达以BSCTV(beet severe curly top virus)，BeYDV(bean yellow dwarf virus)基因组DNA为靶标的sgRNA-cas9构件，抑制病毒积累并且在靶序列诱导突变；过量表达sgRNA-cas9转基因烟草植株表现对病毒免疫(Ji et al.，Nat.Plants，2015，1：15144；Baltes et al.，Nat.Plants，2015，1：15145)。sgRNA靶序列研究表明，针对TYLCV(tomato yellow leafcurl virus)基因组复制点IR(intergenic region)区域的sgRNA在烟草中表达最有效减缓或降低病毒DNA积累，显著减轻病害症状(Ali et al.，Genome Biol.，2015，16：238)。而以TYLCV CP(coat protein)编码序列为靶标的CRISPR-cas9基因编辑系统会诱导病毒产生突变体，这种病毒突变体能克服CRISPR-cas9基因编辑抗性，在植株细胞中复制和扩展(Aliet al.，Sci.Rep.，2016，6：26912)。

最近的研究表明，CRISPR-cas9基因编辑系统能成功增强植株对RNA病毒的抗性。马铃薯Y病毒(potyviruses)利用病毒VPg(viral genome-linked protein)蛋白招募寄主植物eIF4E(eukaryotic translation initiation factors)或其同源异构体(isoform)eIF(iso)4E，两者互作在病毒的复制中起至关重要的作用(Robaglia and Caranta，TrendsPlant Sci.，2006，11：40-45)。利用CRISPR-cas9基因编辑系统构建黄瓜eIF4E基因突变体植株，表现对Cucumber vein yellowing virus，Zucchini yellow mosaic virus，Papayaring spot virus产生抗性(Chandrasekaran et al.，Mol.Plant Pathol.，2016，17：1140-1153)。相似的，利用CRISPR-cas9基因编辑构建拟南芥eIF(iso)4E基因点突变非转基因植株，能显著增强对TuMV(Turnip mosaic virus)的抗性(Pyott et al.，Mol.PlantPathol.，2016，17：1276-1288)。以上研究表明，通过CRISPR-cas9构建参与病毒复制、运动以及致病的寄主因子基因编辑植株，是增强病毒抗性的有效途径。

发明内容：

本发明提供了利用基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒的抗性方法，该方法可以广泛应用于水稻抗水稻黑条矮缩病育种过程。

本发明所提供的一种基因编辑提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性的方法，通过以下方法获得：

1)根据水稻eIF4G基因核苷酸序列(LOC_Os07g36940，http：//rice.uga.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi？orf＝LOC_Os07g36940.1)，通过CRISPR PLANT tools(http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)设计靶向eIF4G sgRNA序列；

2)构建pRGEB32-eIF4G CRISPR/Cas9基因编辑载体；

3)利用农杆菌介导水稻转化获得T0代水稻转基因植株(pRGEB32-eIF4G)；

4)T0代水稻植株eIF4G位点基因编辑植株鉴定；

5)获得T2代水稻eif4g纯和基因编辑植株，并且不携带转基因成分；

6)T2代水稻eif4g纯和基因编辑植株水稻矮缩病毒抗性鉴定以及农艺性状研究。

本发明提供的特异性靶向水稻eIF4G基因sgRNA序列如下：

gagggatttatgtcccagcg。

利用基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性的应用包括：水稻黑条矮缩病抗性水稻育种。

利用这一方法可以快速培育水稻黑条矮缩病抗性品种，不携带转基因成分，减少水稻黑条矮缩病带来的损失。

附图说明：

图1：水稻eIF4G基因编辑植株分子鉴定(A，设计特异性靶向水稻eIF4G的sgRNA；B，PCR-酶切方法检测eIF4G基因编辑植株；C，克隆测序方法检测eIF4G基因编辑植株；D，qRT-PCR检测基因编辑植株中eIF4G转录水平)。

图2：T1代水稻eif4g基因编辑植株遗传分析(A，RT-PCR方法检测转基因成分在T1代eif4g基因编辑植株中的分布；B，RT-PCR检测eif4g大片度缺失突变体的遗传分析)。

图3：水稻eif4g基因编辑植株水稻黑条矮缩病毒抗性鉴定(A，B，水稻eif4g基因编辑植株接种水稻黑条矮缩病毒病害症状；C，水稻eif4g基因编辑植株接种水稻黑条矮缩病毒发病率；D，qRT-PCR检测水稻eif4g基因编辑植株中RBSDV P9-1转录水平；E，蛋白杂交检测水稻eif4g基因编辑植株中RBSDV P6表达水平)。

图4：水稻eif4g基因编辑植株农艺性状检测(A，水稻eif4g基因编辑植株生长表型；B，水稻eif4g基因编辑植株株高统计；C，水稻eif4g基因编辑植株千粒重统计；D，检测水稻eif4g基因编辑植株每株分蘖数；E，检测水稻eif4g基因编辑植株穗长)。

具体实施方式：

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1，基因编辑技术提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性

(1)设计特异性靶向eIF4G基因sgRNA

根据水稻eIF4G基因核苷酸序列(LOC_Os07g36940)，通过CRISPR PLANT tools(http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)设计靶向eIF4G sgRNA序列gagggatttatgtcccagcg(图1A)。

(2)构建水稻eif4g基因编辑植株

靶向eIF4G基因gRNA序列由南京金斯瑞生物有限公司合成并克隆至pRGEB32(Yinong Yang，Pennsylvania State University，Addgene plasmid#63142)，测序验证后，转化农杆菌(GV3101)，利用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化方法转化水稻(日本晴)。利用PCR-酶切以及克隆测序方法鉴定T0代转基因水稻eif4g基因编辑植株(图1B，C)。提取10株eif4g T0代水稻转基因植株基因组DNA，PCR扩增BsgI酶切电泳图表明，5株(#2，#3，#4，#5，#7)酶切图谱与野生型不同，表明这些植株在eif4g靶点产生基因编辑，基因编辑率为50％(图1B)。选取eif4g#2基因编辑植株eif4g PCR产物测序，测序表明eif4g#2植株在eIF4G靶点缺失三个碱基，蛋白水平上缺失一个氨基酸(Pro，脯氨酸)(图1C)。

种植eif4g#2，eif4g#4 T1代基因编辑水稻植株，分别提取单株植株提取基因组DNA，cas9 PCR检测表明其中eif4g#2(4，7，8单株)基因编辑单株不含有转基因成分(图2A)。eif4g#4 T1代水稻植株群体中表现出不同的编辑类型，包括大片段缺失以及缺失三个氨基酸和野生型，但没有发现纯和的大片段缺失突变体，这表明eIF4G基因对水稻生长发育至关重要，功能丧失纯和子是致死的(图2B)。

(3)水稻eif4g基因编辑植株水稻黑条矮缩病毒抗性鉴定

利用eif4g#2 eif4g#5 T2代水稻纯和基因编辑植株人工接种水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)。RBSDV抗性鉴定表明eif4g基因编辑植株显著增强对病毒的抗性，野生型水稻发病率为90％，而eif4g#2，eif4g#5水稻基因编辑植株为38％和41％，不到野生型的一半(图3A，B，C)。qRT-PCR实验表明，eif4g基因编辑植株中RBSDV P9-1转录水平较野生型水稻显著降低(图3D)。蛋白杂交结果也显示，eif4g基因编辑植株中RBSDV P6蛋白表达较野生型水稻显著降低(图3E)。以上的数据表明，水稻eif4g基因编辑植株能显著增强对RBSDV的抗性。

(4)水稻eif4g基因编辑植株农艺性状分析

为了解析eif4g基因编辑植株(eif4g#2，eif4g#5)对水稻生长发育的影响，我们检测了多个水稻农艺性状(图4A)。检测结果表明，eif4g基因编辑植株没有对水稻生长发育产生不利影响，其株高(图4B)，千粒重(图4C)，分蘖数(图4D)与野生型水稻没有差异；eif4g基因编辑植株穗长较野生型显著增加(图4E)。以上结果表明，eif4g基因编辑水稻植株不影响正常的生长发育，在水稻抗RBSDV育种中有重要的应用价值。

基因编辑提高水稻植株对水稻黑条矮缩病毒抗性的方法应用包括：利用基因编辑培育水稻黑条矮缩病抗性品种。

上述实施不以任何形式限定本发明。