正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法及过氧钨酸盐在将5hmC氧化为thT中的应用

摘要

本发明提供一种正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法（MAPS），步骤包括：DNA或RNA的5mC在TET酶的氧化作用下转化成5hmC；加入蛋白酶K消解TET酶，磁珠回收核酸；加入过氧钨酸盐，将5hmC氧化为thT，磁珠回收核酸；甲基化检测。本发明方法相比于现有的DNA甲基化检测方法，MAPS具有耗时短、转化率高、准确性高、假阳性低、灵敏度高、操作简单和安全性好等优点，既能够用于qPCR检测，也可以用于高通量测序检测。此外，MAPS不仅能够检测DNA甲基化的位点和水平，还可以对RNA的5mC进行检测。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种正向筛选胞嘧啶甲基化快速检测方法，以及过氧钨酸盐在将5hmC氧化为thT中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

核酸碱基的基团修饰是表观遗传学的重要研究内容。截止于目前为止，在DNA上检测到的化学基团修饰有17种，在RNA上检测到的化学基团修饰超过160种。这些修饰不仅能够调控基因的表达，染色质的状态和转录本的命运，而且在细胞分化、胚胎发育、个体成长、细胞衰老和疾病发生过程中能够发挥重要的作用。在这些修饰中，胞嘧啶甲基化（5mC）是最常见的碱基修饰方式，占胞嘧啶的1%-8%，被称为“第五种碱基”。近年来，大量研究表明DNA甲基化水平异常与肿瘤发生、恶化和细胞癌变进程有着密切的联系。因此，血液的cfDNA甲基化检测是临床上进行肿瘤早筛的重要手段，具有很高的灵敏度和特异性。此外，RNA甲基化也被报道与疾病的进程具有显著的相关性，为未来疾病的诊治提供了新的思路与靶标。

目前用于检测胞嘧啶甲基化位点和水平的技术主要分为三种：一种是基于反向筛选的重亚硫酸盐转化法，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成U，再通过PCR扩增将U转变成T。这种方法最终的结果为未甲基化的胞嘧啶转变成了胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生改变。但由于转化率只能达到99%，因此会存在大量的未甲基化的胞嘧啶没有发生转变，造成严重的假阳性。此外，重亚硫酸盐转化法会导致DNA损伤严重（约90%的DNA会发生断裂），从而导致甲基化检测的灵敏度和准确性降低。第二种是基于反向筛选的酶转化法（EM-seq），其原理是先利用DNA双加氧酶TET蛋白将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5caC，再利用APOBEC脱氨酶将未甲基化的C通过脱氨反应转变成U，最后通过PCR转变成T。这种方法对DNA的损伤小，能够检测低至10 ng的DNA样本中的甲基化位点和水平。但是这种方法也能够将5mC和5hmC也转变成T，且APOBEC脱氨酶对未甲基化C的转化率只有95%，因此，使用EM-seq进行DNA甲基化位点和水平检测会产生严重的假阳性和假阴性。此外，基于反向筛选的DNA甲基化检测法需要将所有的未甲基化胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，这极大地影响了测序数据的质量和比对准确性。第三种方法是基于正向筛选的酶转化法（TAPS），其原理是利用TET蛋白将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5fC和5caC，再通过吡啶硼烷将5fC和5caC转化成二氢尿嘧啶（DHU），最后通过PCR转变成T。这种方法的优势是只将甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，因此数据质量好，灵敏度高以及准确性高。但吡啶硼烷具有较差的水溶性，导致转化效率偏低（70%-95%）、重复性差、耗时长（一共需要两天）、DNA损失大。此外，吡啶硼烷具有易挥发性和强烈毒性，且易燃易爆，严重影响了操作和运输的安全性。因此，寻找更加安全高效且准确的DNA甲基化正向筛选方法，成为DNA甲基化检测的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法(MAPS)，具有耗时短、转化率高、准确性高的优点。

本发明采取的技术方案为：一种正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法，其特征在于其步骤包括：

（1）DNA或RNA的5mC在TET酶的氧化作用下转化成5hmC；

（2）加入蛋白酶K消解TET酶，磁珠回收核酸；

（3）加入过氧钨酸盐，将5hmC氧化为thT，磁珠回收核酸；

（4）甲基化检测。

优选的，步骤（3）中所述过氧钨酸盐为过氧钨酸钾或过氧钨酸钠。

优选的，步骤（1）中还加入还原剂以抑制5hmC进一步氧化成5fC或5caC。

优选的，所述还原剂为氨硼烷锂、氨硼烷或硼氢化钠中的一种或数种的混合物。

优选的，步骤（1）中所述TET酶为NgTET1、mTET1、mTET2、hTET1、hTET2、hTET3或者其截短的催化结构域。

优选的，所述TET酶为mTET2。

优选的，步骤（1）中反应温度为30-40℃，反应时间为10-120 min，TET酶浓度为2-20 μM。

其中TET酶的反应缓冲液为：50 mM HEPES-KOH（pH 8.0）、100 mM NaCl、100 μM Fe(NH

优选的，步骤（2）中蛋白酶K的处理浓度为0.3-3 mg/ml，处理温度为50-55℃，处理时间为10-30 min。

优选的，步骤（3）的反应体系中过氧钨酸盐浓度为10-50 mM，处理温度为50-90℃，处理时间为1-4 h。

甲基化检测的方式包括但不限于荧光定量PCR、一代Sanger测序、二代短读长高通量测序和三代长读长高通量测序。

优选的，使用二代短读长高通量测序进行甲基化检测时，文库构建方法可使用双链DNA建库和单链DNA建库，其中单链DNA建库方法最佳。

过氧钨酸盐作为将5hmC氧化为thT的氧化剂的应用。

优选的，所述过氧钨酸盐为过氧钨酸钾或过氧钨酸钠。

本发明的目的在于提供一种正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法，并命名为MAPS（Methyl-C Ammonia borane and Peroxytungstate sequencing，如图1）。相比于现有的DNA甲基化检测方法，MAPS具有耗时短、转化率高、准确性高、假阳性低、灵敏度高、操作简单和安全性好等优点，既能够用于qPCR检测，也可以用于高通量测序检测（将其命名为MAPS-seq）。此外，MAPS不仅能够检测DNA甲基化的位点和水平，还可以对RNA的5mC进行检测。因此，能够广泛应用于DNA和RNA甲基化的科学研究和临床检测领域，尤其是肿瘤早期筛查方向。

附图说明

图1 MAPS原理及流程示意图。

图2 5mC甲基化和去甲基化过程示意图。

图3 NgTET1氧化5mC效率。

图4 mTET1氧化5mC效率。

图5 mTET2氧化5mC效率。

图6 hTET1氧化5mC效率。

图7 hTET2氧化5mC效率。

图8 hTET3氧化5mC效率。

图9 hTET2(NEB)氧化5mC效率。

图10 还原剂促进TET氧化5mC成5hmC效率的原理。

图11 三种还原剂促进各类TET酶氧化5mC成5hmC的效果。

图12 HPLC/MS检测氨硼烷锂促进mTET2氧化5mC成5hmC的效果。

图13 氨硼烷锂浓度对mTET2氧化5mC成5hmC效率的影响。

图14 mTET2浓度对氧化5mC成5hmC效率的影响。

图15 mTET2处理时间对氧化5mC成5hmC效率的影响。

图16 过氧钨酸盐氧化5hmC成thT原理示意图。

图17 过氧钨酸钠和过氧钨酸钾氧化5hmC成thT的效率。

图18 过氧钨酸钾处理温度对氧化5hmC成thT的效率的影响。

图19 过氧钨酸钾处理时间对氧化5hmC成thT的效率的影响。

图20 MAPS流程示意图。

图21 MAPS 将5mC转化成thT的效率。

图22 5mC DNA标准品序列。

图23 5mC DNA标准品经MAPS流程转化后的序列变化。

图24 一代Sanger测序检测MAPS将5mC转化成thT的效果。

图25 MAPS-qPCR检测DNA甲基化示意图。

图26 MAPS-qPCR检测DNA甲基化效果。

图27 三种二代NGS测序建库方式对MAPS产量的比较。

图28 三种二代NGS测序建库方式对MAPS转化率的比较。

图29 Nanopore三代测序MAPS转化率的检测效率。

图30 四种高通量甲基化检测技术流程图。

图31 四种高通量甲基化检测技术比较。

图32 四种高通量甲基化检测技术在5mC DNA标准品检测上文库产量比较。

图33 四种高通量甲基化检测技术在5mC DNA标准品检测上转化效率比较。

图34 四种高通量甲基化检测技术在5mC DNA标准品检测上检测准确性分析。

图35 四种高通量甲基化检测技术在甲基化pUC19标准品检测上文库产量比较。

图36 四种高通量甲基化检测技术在甲基化pUC19标准品检测上转化效率比较。

图37 四种高通量甲基化检测技术在甲基化pUC19标准品检测上检测准确性分析。

图38 5mC RNA标准品序列。

图39 5mC RNA标准品经MAPS流程转化后的序列变化。

图40 一代Sanger测序检测MAPS将5mC RNA转化成thT的效果。

图41 MAPS-RT-qPCR检测RNA甲基化示意图。

图42 MAPS-RT-qPCR检测RNA甲基化效果。

图43 RNA NGS测序检测MAPS对RNA 5mC的转化率。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示。

表1 探针及引物序列

实施例1：TET酶对5mC oligo的氧化动力学曲线测定。

在本实施例中，我们测定了不同来源TET酶对5mC甲基化标准品的氧化动力学曲线，示意图如图1和图2，具体实施方式如下：

表2

10× mTET buffer：500 mM HEPES buffer (pH 8.0), 1 M NaCl, 10 mM α-酮戊二酸, 20 mM L-AA, 25 mM DTT, 15 mM ATP。

10× NgTET1 buffer：500 mM MOPS buffer (pH 6.9), 500 mM NaCl, 10 mM α-酮戊二酸, 20 mM L-AA, 10 mM DTT。

NgTET1(Active Motif)在34℃消化1 min，5 min，10 min，30 min，60 min和120min。hTET1(Active Motif)、hTET2(Active Motif)、hTET3(Active Motif)、mTET2(NEB)、mTET1(WiseGene)、mTET2(Creative Biomart)在37℃消化1 min，5 min，10 min，30 min，60min和120 min。

反应结束后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应10 min。使用QIAquickNucleotide Removal Kit (Qiagen)回收DNA进行LC-MS/MS分析。5mC、5hmC、5fC和5caC含量占比分析流程见Hideharu Hashimoto

实验结果如图3-图9所示，NgTET1、mTET1、mTET2、hTET1、hTET2和hTET3都能够将5mC通过逐步反应氧化成5hmC、5fC和5caC（示意图见图2），随着氧化时间的延长，最终产物5caC的占比逐渐升高。NgTET1和hTET2能够高效地将5mC氧化成5caC，最终5caC占据氧化产物的绝大部分。而mTET2的氧化产物主要是5hmC，5fC和5caC的占比较少。mTET1和hTET1的氧化产物也主要以5caC为主，其中包含一些未完全转化的5hmC和5fC。而hTET3的氧化产物中5hmC、5fC和5caC的分布比较均匀，随着时间的延长，5caC缓慢升高。为保证5mC氧化产物中5hmC的占比，我们选定mTET2作为下游MAPS流程建立使用的TET酶。

实施例2：还原性添加剂对各类TET酶氧化产物中5hmC占比的影响。

在实施例1中，我们验证了5 μM 各类TET，酶处理DNA甲基化标准品中产生的5hmC产物的占比，其中mTET2效果最佳。在本实施例中，我们验证了还原性添加剂对各类TET酶氧化产物中5hmC占比的影响，示意图见图10。具体实施方式如下：

表3

37℃消化10 min，20 min和30 min。按照实施例1的流程鉴定氧化产物中5hmC的含量占比。

结果如图11和图12所示，还原性添加剂氨硼烷锂、氨硼烷和硼氢化钠都能够有效的促进各类TET酶将5mC氧化成5hmC产物，并且减少5fC和5caC产物的生成。其中，氨硼烷锂和mTET2处理可以获得最高占比的5hmC产物。并且随着mTET2氧化时间的延长，5hmC的占比逐渐升高。因此，在后续的实验中，为保证5mC氧化产物中5hmC的占比，我们选定mTET2作为下游MAPS流程建立使用的TET酶，并选择氨硼烷锂作为有效的还原剂来阻止5hmC被进一步氧化成5hC和5caC（如图12）。

实施例3：反应体系中氨硼烷锂浓度对mTET2酶氧化产物中5hmC占比的影响。

在本实施例中，我们验证了反应体系中氨硼烷锂浓度对mTET2氧化产物中5hmC占比的影响。具体实施方式如下：

表4

x为0，1，2，5，10。

37℃消化30 min。按照实施例3的流程鉴定氧化产物中5hmC的含量占比。

结果如图13所示，当氨硼烷看处理浓度在10-20 mM时，反应产物中5hmC的含量最高，可达到97%以上。过多的氨硼烷锂会抑制mTET2对5mC的氧化效果。

实施例4：mTET2酶投入量对氧化产物中5hmC占比的影响。

在本实施例中，我们验证了mTET2酶投入量对氧化产物中5hmC占比的影响氧化产物中5hmC占比的影响。具体实施方式如下：

表5

x为2，5，8，10，20。

37℃消化30 min。按照实施例1的流程鉴定氧化产物中5hmC的含量占比。

结果如图14所示，当反应体系中mTET2的终浓度达到8-10 μM时，5hmC的占比最高（高于98%）。在后续实验中，我们使用10 μM作为mTET2处理的最佳浓度。

实施例5：mTET2酶处理时间对氧化产物中5hmC占比的影响。

在本实施例中，我们验证了mTET2酶处理时间对氧化产物中5hmC占比的影响氧化产物中5hmC占比的影响。具体实施方式如下：

表6

37℃反应5、10、20、30、60 min。按照实施例1的流程鉴定氧化产物中5hmC的含量占比。

结果如图15所示，当mTET2的处理时间为20-30 min时，5hmC的含量占比最高，可达到99%以上。

实施例6：过氧钨酸盐浓度对5hmC的转化效果。

在本实施例中，我们验证了过氧钨酸盐浓度对5hmC的转化效果，示意图见图16，具体方案如下：

1）过氧钨酸盐的制备：在冰水浴条件下，15 ml 6 mM 钨酸钾或钨酸钠水溶液加入10 ml 30%过氧化氢，溶液变黄，逐滴加入稀释的盐酸溶液直至溶液变成无色（pH 2.5）, 4度放置24 h使得过氧钨酸钾沉淀下来（白色沉淀），离心或过滤收集沉淀，无水乙醇洗涤沉淀一次，离心去上清，晾干。

2）过氧钨酸盐处理：

表7

x为1，2，3，4，5。

60℃处理4 h。反应结束后，使用QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen)回收DNA进行LC-MS/MS分析。5hmC和thT含量占比分析流程见Hideharu Hashimoto

结果如图17所示，过氧钨酸钾和过氧钨酸钠都可以将5hmC氧化成为thT，并随着过氧钨酸盐的处理浓度升高，thT产物的含量逐渐增多。其中过氧钨酸钾的转化效率要略高于过氧钨酸钠。

实施例7：过氧钨酸钾处理温度对5hmC的转化效果。

在本实施例中，我们验证了过氧钨酸钾处理温度对5hmC的转化效果，具体方案如下：

表8

50℃、60℃、70℃、80℃、90℃处理4 h。反应结束后，按照实施例6的流程分析反应产物中5hmC和thT含量。

结果如图18所示，过氧钨酸钾在60-80℃条件下处理时，thT产物的含量最高。其中70℃时效果最佳。

实施例8：过氧钨酸钾处理时间对5hmC的转化效果。

在本实施例中，我们验证了过氧钨酸钾处理时间对5hmC的转化效果，具体方案如下：

表9

70℃处理1、2、3、4 h。反应结束后，按照实施例6的流程分析反应产物中5hmC和thT含量。

结果如图19所示，过氧钨酸钾处理时间越长，thT的占比越高。当处理时间超过3 h时，氧化产物thT的占比越高。当处理时间超过3 h时，thT的占比达到99%。

实施例9：MAPS流程的建立和对5mC-thT转化率的检测。

在本实施例中，我们建立了MAPS的流程以及检测了MAPS对5mC转化成thT的效率，示意图如图20，具体方案如下：

1）mTET2氧化处理：

表10

37℃反应20 min后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应10 min。使用QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen)回收DNA，14 μL ddH2O洗脱。

2）过氧钨酸钾处理：

表11

70℃处理3 h。反应结束后，按照实施例6的流程分析反应产物中5mC、5hmC、5fC、5caC和thT含量。

结果如图21所示，经MAPS流程进行5mC>thT的转化，转化效率可达98.6%。这说明MAPS流程具有较高的甲基化检测效率和灵敏度。

实施例10：5mC DNA标准品的制备

在本实施例中，我们利用PCR技术构建了DNA甲基化标准品（5mC DNA标准品序列如图22所示），具体方案如下：

表12

混匀后按照以下程序进行反应：

表13

PCR结束后，加入40 μL Agencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇；再次加入200 μL新鲜配制的80%乙醇静置30 s，吸干净乙醇，室温静置晾干3 min。加入20 μL ddH2O悬浮磁珠后，室温静置5 min。将将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，取上清，Nanodrop测定回收的PCR产物浓度，Qsep测定PCR产物纯度，一代测序测定PCR产物序列。

实施例11：MAPS流程对不同5mC DNA标准品投入量的转化效率。

在本实施例中，我们建立了MAPS对5mC DNA标准品的转化流程以及检测方式，示意图如图23所示，具体流程如下：

1）mTET2氧化处理：

表14

37℃反应20 min后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应10 min。加入50 μLAgencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上述方法回收处理后的DNA，14 μL ddH2O洗脱。

2）过氧钨酸钾处理：

表15

70℃处理3 h。反应结束后，加入50 μL Agencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上述方法回收处理后的DNA，20 μL ddH2O洗脱。

3）转化率检测

回收的DNA使用qPCR进行检测，检测引物见表1(C-引物、T-引物)。

回收的DNA进行一代DNA测序。

回收的DNA使用NEB的NEBNext Ultra™ II DNA Library Prep Kit forIllumina、翊圣生物的Hieff NGS OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina或SwiftBiosciences的ACCEL-NGS® 1S DNA LIBRARY KITS等进行建库并测序。

回收的DNA使用Nanopore的Ligation Sequencing Kit进行建库并使用NanoporeGridION测序平台进行测序。

结果如图24所示，5mC DNA标准品经MAPS流程转化后，我们使用一代Sanger测序验证了转化的结果。5mC DNA标准品中的5mC位点被转化成了T，且正常的C位点并没有发生变化。这说明MAPS能够特异高效地将5mC转化成thT。

基于MAPS的原理，我们开发了一种新的DNA甲基化定量检测技术，称为MAPS-qPCR，原理如图25所示。结果显示，MAPS-qPCR是一种高效准确的DNA甲基化定量检测技术（如图26）。

同时，基于MAPS原理，我们开发了一种新的DNA甲基化高通量检测技术，称为MAPS-seq。我们测试了三种建库试剂盒对MAPS处理后的DNA进行建库并测序。结果如图27-图28所示，使用Swift Biosciences的ACCEL-NGS® 1S DNA LIBRARY KITS对MAPS处理后的DNA进行建库并测序具有更高的建库产量、更高的转化率（98.4%）和更低的假阳性率（0.14%）。因此，单链DNA建库是对MAPS处理后的DNA更加适用。这可能是由于经MAPS高温处理后的DNA会出现大量的单链DNA片段，且单链DNA具有更高的转化效率导致的。因此经MAPS处理后的DNA通过单链DNA建库并测序是MAPS-seq最佳的检测流程。

此外，我们也使用三代Nanopore长读长纳米孔测序对MAPS处理后的DNA进行检测。结果如图29所示，MAPS处理后的DNA能够通过三代Nanopore长读长纳米孔测序对DNA甲基化位点进行高效准确的检测。

综上，我们开发的基于过氧钨酸盐和氨硼烷锂正向筛选的DNA甲基化处理流程MAPS能够利用一代Sanger测序、荧光定量PCR、二代短读长高通量测序和三代长读长高通量测序对DNA甲基化位点进行高效准确的检测。

实施例12：四种DNA甲基化高通量检测技术的对比。

在本实施例中，我们比较了BS-seq、EM-seq、TAPS-seq和MAPS-seq四种DNA甲基化高通量测序检测技术的性能对比，具体方式见如下：

BS-seq：DNA甲基化标准品和Control DNA CpG methylated pUC19使用EZ DNAMethylation-Gold kit进行重亚硫酸盐法转化，处理后回收的DNA使用Swift Biosciences的ACCEL-NGS® 1S DNA LIBRARY KITS进行文库构建。

EM-seq：DNA甲基化标准品和Control DNA CpG methylated pUC19使用NEBNext®Enzymatic Methyl-seq Kit（NEB，E7120）进行文库构建。

TAPS-seq：DNA甲基化标准品和Control DNA CpG methylated pUC19按照YibinLiu

MAPS-seq：DNA甲基化标准品按照实施例11的流程进行处理并使用SwiftBiosciences的ACCEL-NGS® 1S DNA LIBRARY KITS等进行建库和测序。Control DNA CpGmethylated pUC19的处理流程如下：

1）mTET2氧化处理：

表16

37℃反应20 min后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应10 min。加入50 μLAgencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上述方法回收处理后的DNA，14 μL ddH

2）过氧钨酸钾处理：

表17

70℃处理3 h，4度保存。

3）DNA片段化：

表18

37℃处理25 min。加入5 μl of 0.5 M EDTA后，加入90 μL Agencourt AMPure XPbeads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上述方法回收处理后的DNA，20μL ddH2O洗脱。

4）文库构建：使用Swift Biosciences的ACCEL-NGS® 1S DNA LIBRARY KITS等进行建库和测序。

四种建库流程示意图及特点如图30和图31所示，相较于传统的DNA甲基化高通量检测方法（化学转化法，BS-seq），酶转化法（EM-seq、TAPS-seq和MAPS-seq）对DNA的损伤更小，产量更高。相较于BS-seq和EM-seq等负向筛选法，TAPS-seq和MAPS-seq等正向筛选法具有准确性高和灵敏度高等优势。相较于TAPS-seq，MAPS-seq具有耗时短、操作简单、准确性高、灵敏度高和毒性小等优势。我们随后验证了MAPS-seq与另外三种DNA甲基化检测技术的性能比较。结果如图32-图37所示，无论是对于我们制备的5mC DNA甲基化标准品还是对于Control DNA CpG methylated pUC19标准品，MAPS-seq具有产量高、准确性高、灵敏度高、假阴性和假阳性低等优势。因此，MAPS-seq是一种更加高效准确的DNA甲基化技术检测技术。

实施例13：MAPS-seq对不同投入量DNA甲基化标准品的检测效果。

在本实施例中，我们验证了MAPS-seq对10 pg-1000 ng DNA甲基化标准品的检测效果，具体方式见如下：

1）mTET2氧化处理：

表19

37℃反应20 min后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应10 min。加入50 μLAgencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，室温静置孵育5 min。按照上述方法回收处理后的DNA，14 μL ddH2O洗脱。98℃处理2 min，立即置于冰上。

2）过氧钨酸钾处理：见实施例11。

3）ssDNA建库：处理后的DNA使用Swift Biosciences的ACCEL-NGS® 1S DNALIBRARY KITS等进行建库并测序。

结果如表20所示，MAPS-seq可以对10 pg-1000 ng DNA投入量检测甲基化位点的检测，且具有较高的准确性（97.7%）。这说明MAPS-seq在DNA甲基化的检测上具有较高的灵敏度。

表20

实施例13：RNA甲基化标准品的制备

在本实施例中，我们利用体外转录技术构建了RNA甲基化标准品（5mC RNA标准品序列如图38所示），具体方案如下：

1）PCR

表21

混匀后按照以下程序进行反应：

表22

PCR结束后，加入60 μL Agencourt AMPure XP beads（Beckman，A63881）混匀后，按照上述方法回收PCR产物。Nanodrop测定回收的PCR产物浓度，Qsep测定PCR产物纯度，一代测序测定PCR产物序列。

2）体外转录5mC-RNA

表23

37℃反应4 h。加入2 µL DNase I (1 U/µL)，37℃反应30 min。

反应结束后，使用翊圣生物的Hieff NGS® RNA Cleaner（Cat#10602）进行RNA回收。加入88 µL Hieff NGS® RNA Cleaner，充分混匀后静置5 min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL DEPC H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。重复漂洗一次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5 min）。加入22 μL DEPC H2O，吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中。用Nanodrop测定RNA浓度。

实施例14：MAPS流程对不同5mC RNA标准品投入量的转化效率。

在本实施例中，我们建立了MAPS对5mC RNA标准品的转化流程以及检测方式，示意图如图39所示，具体流程如下：

1）mTET2氧化处理：

表24

34℃反应20 min后，加入1 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，50℃反应1 h。加入60 µLHieff NGS® RNA Cleaner，充分混匀后静置5 min。按照上述方法回收处理后的RNA，13 μLddH2O洗脱。98℃处理2 min，立即置于冰上。

2）过氧钨酸钾处理：

表25

70℃处理3 h。反应结束后，加入60 µL Hieff NGS® RNA Cleaner，充分混匀后静置5 min。按照上述方法回收处理后的RNA，10 μL ddH2O洗脱。

3）转化率检测

回收的RNA经过RT-PCR后，逆转录引物使用RT-R，PCR引物使用RT-F和RT-R，PCR产物使用Sanger测序进行检测，测序引物用RT-F。

回收的RNA使用RT-qPCR进行检测，检测引物见表1(RNA-C-引物、RNA-T-引物)。

回收的RNA使用NEB的NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Kit forIllumina进行建库并测序。

结果如图40所示，5mC RNA标准品经MAPS流程转化后，我们使用一代Sanger测序验证了转化的结果。5mC RNA标准品中的5mC位点成功被转化成了T。

基于MAPS的原理，我们开发了一种新的RNA甲基化定量检测技术，称为MAPS-RT-qPCR，原理如图41所示。结果显示，MAPS-RT-qPCR是一种高效准确的RNA甲基化定量检测技术（如图42）。

同时，基于MAPS原理，我们开发了一种新的RNA甲基化高通量检测技术，称为MAPS-RNA-seq。结果如图43所示，MAPS-RNA-seq在RNA甲基化检测上具有较高的检测效率和较低的假阳性。

综上，本发明开发了一种基于过氧钨酸盐和氨硼烷锂正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法，并命名为MAPS（Methyl-C Ammonia borane and Peroxytungstatesequencing）。相比于现有的DNA甲基化检测方法，MAPS具有耗时短、转化率高、准确性高、假阳性低、灵敏度高、操作简单和安全性好等优点，既能够用于qPCR检测，也可以用于高通量测序检测（我们将其命名为MAPS-seq）。此外，MAPS不仅能够检测DNA甲基化的位点和水平，还可以对RNA的5mC进行检测。因此，能够广泛应用于DNA和RNA甲基化的科学研究和临床检测领域，尤其是肿瘤早期筛查方向。

序列表

<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司

<120> 正向筛选的胞嘧啶甲基化快速检测方法及过氧钨酸盐在将5hmC氧化为thT中的应用

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