一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种基于RT‑RPA方法的微量核酸释放剂，其包括TritonX‑100、Tween‑20、异硫氰酸胍、乙醇、异戊醇和水。本发明提供的微量核酸释放剂，所需的原料价钱便宜，易于获得，且对身体无害。该微量核酸释放剂可快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放核酸，可大大缩短核酸提取纯化的时间，无需复杂的操作步骤，操作简便。本发明的微量核酸释放剂所需样本量少，可对微量珍贵样本进行检测。本发明的微量核酸释放剂可以直接对血清、全血、血浆、咽拭子、粪便等样本核酸进行提取，无需加热，离心等复杂步骤，只需要一步加样过程，30分钟内即可完成核酸的提取和释放过程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用，属于生物试剂技术领域。

背景技术

核酸提取技术是分子生物学研究的基础，现已广泛应用于病原微生物检测、环境微生物检测、食品安全检测等领域。传统的核酸提取物理方法有煮沸法、磁珠法、超声波法等；化学方法有表面活性剂、碱裂解法等；生物方法主要有酶法等。目前，提取核酸释放剂存在的主要问题有细胞裂解不完全，造成核酸释放不彻底，所得核酸不稳定尤其是RNA，受温度、酶等因素易降解；细胞内蛋白含量较高，且含有大量抑制核酸检测的物质，造成提取试剂与检测体系不匹配，因此还需要采用传统方法利用多步骤、多种不同试剂等来去除PCR反应的抑制剂。

RT-RPA是与荧光定量PCR最为相似的检测技术，该方法具有较高的灵敏度及特异性，但是其没有一个成熟的引物探针筛选规则，只能通过设计和筛选大量的引物探针，形成灵敏度高、特异性强的检测试剂。微量核酸释放剂与PCR相结合的检测方法报道较多，但目前未见微量核酸释放剂与RT-RPA方法相结合检测病原微生物的文献报道。

目前核酸提取技术迅猛发展，但仍存在一些缺点，比如，苯酚氯仿抽提法虽然采用了实验室常见的试剂，做起来成本比较低廉。但是使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，且需要反复抽提，核酸的回收率较低，损失量较大。磁珠法虽安全无毒，但是成本较高。离心柱法虽有利于RNA保护，但需要较多的样本，耗材多，且需反复离心，不便于高通量、自动化操作。

传统的PCR方法所需的时间较长，需要变性、退火、延伸等多个步骤，通常1-2小时才能完成核酸检测。如何能快速实现核酸有效提取，是亟需解决的技术问题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂、其制备方法及应用，其与RT-RPA的检测方法相结合，对(血清、血浆、粪便等)样本实现进行快速、灵敏的检测目的。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种基于RT-RPA方法的微量核酸释放剂，其包括Triton X-100、Tween-20、异硫氰酸胍、乙醇、异戊醇和水。

如上所述的微量核酸释放剂，优选地，所述Triton X-100按体积百分比占0.03～10％，所述Tween-20按体积百分比占0.03～10％，所述乙醇按体积百分比占10～30％，异戊醇按体积百分比占15～25％，余量体积为无酶无菌水，所述异硫氰酸胍的终浓度为40～80mmol/L。

如上所述的微量核酸释放剂，优选地，所述Triton X-100按体积百分比占0.05％，所述Tween-20按体积百分比占0.05％，所述乙醇按体积百分比占25％，异戊醇按体积百分比占20％，余量体积为无酶无菌水，所述异硫氰酸胍的终浓度为50mmol/L。

如上所述微量核酸释放剂的制备方法，其包括将Triton X-100、Tween-20、乙醇和异戊醇按体积份数计分别为取Triton X-100 0.03～10份，Tween-20 0.03～10份，乙醇10～30份，异戊醇15～25份，用水补足100份后，混匀，按终浓度为40～80mmol/L加入异硫氰酸胍，混合均匀。

如上所述的微量核酸释放剂在RT-RPA检测方法中的应用。

如上所述的应用，优选地，所述微量核酸释放剂与待测样品用量按1:1混合使用。

如上所述的应用，优选地，待测样品为血清、全血、血浆、咽拭子、粪便为10％的液体溶液。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供的微量核酸释放剂，所需的原料价钱便宜，易于获得，且对身体无害。该微量核酸释放剂可快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放核酸，可大大缩短核酸提取纯化的时间，无需复杂的操作步骤，操作简便。本发明的微量核酸释放剂所需样本量少，可对微量珍贵样本进行检测。本发明的微量核酸释放剂可以直接对血清、全血、血浆、咽拭子、粪便等样本核酸进行提取，无需加热，离心等复杂步骤，只需要一步加样过程，即可完成核酸的提取和释放过程。利用自动移液系统和RT-RPA的检测方法，30分钟内即可完成核酸提取和检测的全过程，大大缩短等待检测结果的时间，可实现检测的现场化和自动化。

附图说明

图1为运用本发明试剂的检测结果。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例中微量核酸释放剂是由50mmol/L异硫氰酸胍、体积分数为0.05％Tween-20、0.05％Triton X-100、25％乙醇、20％异戊醇和无酶无菌水组成。配置方法为取TritonX-100 0.05mL，Tween-20 0.05mL，乙醇25mL，异戊醇20mL，用无酶无菌水补足100mL，混匀，称取异硫氰酸胍0.59g加入配制好的混合液中即得含50mmol/L异硫氰酸胍的微量核酸释放剂。

本实施例所用样本为人员粪便样本A、B、C、D、E、F，其中A、B、C、D、E为按梯度浓度添加广州邦德盛生物科技有限公司2019新型冠状病毒室内质控品即阳性样本的样本，F为阴性样本，处理方式为用一次性移液管或无菌棒取绿豆大小的粪便(约1g)，用1mL的PBS或生理盐水稀释成10％左右的粪便悬液。涡旋震荡1分钟，在10000rpm下离心5分钟，使固体沉淀，取30μL上清于30μL上述微量核酸释放剂中震荡重悬。

操作步骤如下(采用新冠病毒核酸检测试剂盒进行)：

1)每个干粉管中加入29.4μL A buffer(注意：A buffer需完全融化混匀)，

2)每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针，

3)向反应管中加入13.5μL所述微量核酸释放剂和样本，

4)向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合，

5)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入一体机内进行检测。荧光检测程序为：恒温42度；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min。

结果如图1所示，①～⑤为A～E样本检测结果，⑥为F样本检测结果。运用本发明的方法能快速将粪便样本中的核酸提取出来，且检测结果与先进行核酸提取后，PCR上机检测结果一致。

运用本发明的方法无需复杂的核酸提取过程，所用试剂无毒无害且价格低廉，全程仅需30分钟即可完成样本从提取到检测的全流程，相比于传统的核酸提取与PCR检测相结合的方法(约2.5～3h)，可大大节约检测时间。

实施例2

将实施例1中的微量核酸释放剂用于提取血液中的核酸，将微量核酸释放剂与血液按1:1进行混合，涡旋震荡1分钟，在1000rpm下离心5分钟，使固体沉淀，取5μL上清用于后续检测，重复提取10个平行样，经验证的核酸检测试剂盒进行检测，结果说明没有差异，检出率为100％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。