用于治疗自身免疫疾病的VDAC抑制剂

摘要

本发明涉及用于治疗与1型干扰素信号传导相关的疾病的方法。具体地，本发明涉及电压依赖性阴离子通道(VDAC1)的特定抑制剂，如哌嗪衍生物和/或哌啶衍生物等，例如肽和寡核苷酸用于治疗自身免疫疾病的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月26日提交的标题为“VDAC INHIBITORS FOR TREATINGAUTOIMMUNE DISEASES”的美国临时专利申请号62/771,211的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗与1型干扰素信号传导相关的疾病的方法。具体地，本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的电压依赖性阴离子通道(VDAC1)抑制剂。

背景技术

当身体的免疫系统攻击并破坏健康的身体组织时，发生自身免疫疾病。自身免疫疾病多达80种，其中系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)是北半球最常见的自身免疫疾病，影响越来越多的患者。因此，自身免疫疾病是显著威胁人类健康的巨大的全球性问题。

通常，采用阻止免疫细胞攻击器官和组织的非特异性免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和环孢菌素治疗自身免疫疾病。然而，免疫抑制剂通常与显著的副作用相关联，例如毒性和对免疫系统的不期望的抑制。

自身DNA和I型干扰素信号传导在自身免疫疾病的发病机理中起核心作用。已显示胞质溶胶中主要的3’-至-5’核酸外切酶Trex1的缺陷导致胞质溶胶DNA的积累和环状GMP-AMP合酶(cGAS)和干扰素信号传导的激活，从而导致自身免疫疾病。在人类中，Trex1突变已与狼疮和艾卡尔迪-古铁雷斯(Aicardi-Goutieres)综合征有关。最新研究已显示，氧化线粒体DNA(mtDNA)以嗜中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps)(NET)和/或挤出的氧化拟核的形式从嗜中性粒细胞中胞外释放也是随后干扰素信号传导和狼疮样疾病发展的重要触发物。

线粒体DNA是编码37个基因的环状DNA，包括氧化磷酸化所必需的蛋白质复合物的亚基。尽管每个细胞中存在数千个拷贝的mtDNA，但大多数mtDNA不以游离形式存在，而是包装成拟核，即被束缚在线粒体内膜(IMM)基质侧的大结构。尽管机制尚不完全清楚，但是来自受到胁迫的线粒体的mtDNA可被释放至胞质溶胶中，在胞质溶胶中其可以与大量的免疫刺激性DNA传感器相互作用并将其激活。最有特点的DNA传感器之一是cGAS，其在与DNA结合后生成环状二核苷酸cGAMP。然后cGAMP与触发I型干扰素信号传导的干扰素基因的刺激物(STING)结合。释放mtDNA并激活cGAS的应激程度的范围可以从BCL-2样蛋白4(BAX)和BCL-2同源拮抗剂/杀伤剂(BAK)诱导的细胞凋亡到线粒体转录因子A(TFAM)的缺陷所诱导的适度mtDNA应激，该线粒体转录因子A对mtDNA包装至关重要。另一类mtDNA传感器是炎性体(inflammasomes)，其由细胞暴露于所谓的损伤相关分子模式(DAMP)触发，损伤相关分子模式是发出细胞应激或感染信号并随后释放mtDNA的分子。激活的炎性体通过刺激炎症细胞因子(如IL-1β和IL-18)的释放来诱导炎症。与在多种细胞类型中表达的cGAS不同，炎性体途径主要限于巨噬细胞。

mtDNA被释放至胞质溶胶中的机制知之甚少。其可能涉及某种类型的门控机制、膜损伤或两者的组合。一个可能的线索来自纯化的线粒体，其在Ca

由三种同种型(VDAC1、2和3)组成的电压依赖性阴离子通道(VDAC)是OMM中最丰富的蛋白质，并且调节新陈代谢、炎性体活化和细胞死亡。尽管VDAC是PTP打开所需的Ca

VDAC由两亲性的26个氨基酸长的N-末端α-螺旋区域和嵌入膜的β-桶状结构(β-barrel)构成。高度动态的N-末端区域被认为在孔内移动，并且也从孔内易位至通道表面。当N-末端区域位于孔内时，VDAC孔的直径约为1.5nm，而当N-末端区域位于孔外时，其直径为3与3.8nm之间。单体的孔可能太小而无法使mtDNA(2nm直径)穿过OMM，但发现VDAC处于单体状态与寡聚状态之间的动态平衡中，并且寡聚体可形成的孔要显著大于单体的孔。

因此，对于治疗1型干扰素介导的疾病(具体地自身免疫疾病)的改进的方法的需求仍然未得到满足，这种改进的方法提供增强的功效但不涉及广泛的免疫抑制。

发明内容

本发明提供了用于减慢自身免疫疾病的进展或治疗自身免疫疾病的方法，包括降低对其有需要的对象中VDAC的表达或活性。

本发明部分地基于以下发现：释放至胞质溶胶和/或胞外空间中的线粒体DNA(mtDNA)在1型干扰素信号传导中起主要作用。现在显示，在比如在核酸内切酶G(EndoG)缺陷的成纤维细胞中胞质溶胶mtDNA增加的条件下，干扰素刺激基因(ISG)表达增加。本发明的发明人首次显示，通过各种手段，例如通过已知抑制VDAC1寡聚并在下文中称为“VBIT-4”的特定哌嗪衍生物抑制VDAC1表达或VDAC1活性，显著降低了mtDNA释放至EndoG

现在进一步公开了mtDNA与VDAC通过其N-末端结构域相互作用，并且这种相互作用增加了VDAC寡聚体的形成，后一过程显示出对胞内mtDNA释放是重要的。

出乎意料地，本发明的发明人公开了对患有狼疮样疾病的小鼠给予VBIT-4，阻断了皮肤损伤的发展，减少了脾和淋巴结的重量，并显著降低了ISG诱导、肾免疫复合物沉积、血清抗dsDNA、蛋白尿和脱细胞(cell-free)mtDNA。另外，本发明公开了VBIT-4抑制从狼疮患者获得的嗜中性粒细胞形成嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)，该过程已知触发自身免疫。

因此，本发明提供了用于治疗1型干扰素介导的疾病，具体地自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮的高效方法，其避免了广泛的免疫抑制。此方法也可以有效治疗其它干扰素病(interferonopathies)，包括但不限于艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutièressyndrome)(AGS)、视网膜血管病变伴有脑白质营养不良(Retinal vasculopathy withcerebral leukodystrophy)(RVCL)和STING相关幼年发病性血管病变(STING-associatedvasculopathy,infantile-onset)(SAVI)。

根据一个方面，本发明提供了用于减慢自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给予包含治疗有效量的VDAC抑制剂的药物组合物。

在一些实施方式中，所述VDAC抑制剂是通式(I)的化合物：

其中：A是碳(C)或氮(N)；R

根据一些实施方式，所述化合物具有选自式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的式。

根据一个实施方式，所述化合物是N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)丁酰胺(式1)，在整个说明书中被称为VBIT-4。

根据另一实施方式，所述化合物是1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮(式2)，在整个说明书中被称为VBIT-3。

根据进一步的实施方式，所述化合物是(1-(萘-2-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-羰基)甘氨酸(式3)，在整个说明书中被称为VBIT-12。

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-26的肽：包含：(i)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个突变，(ii)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸的截短，或其组合。

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是1-25个氨基酸的肽，其包含衍生自包含氨基酸序列：MAVPPTYADLGKSARDVFTKXYXFX(SEQ ID NO:2)的人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26的连续序列(毗邻序列，contiguous sequence)，其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸。

根据某些示例性实施方式，所述肽包含选自SEQ ID No.:4-13的氨基酸序列。

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是VDAC沉默寡核苷酸分子或包含其的构建体。任何VDAC沉默寡核苷酸分子都可以用于本发明的方法，只要所述寡核苷酸包含与SEQID NO:17、与其所编码的mRNA分子或与和其互补的序列相同的至少15个连续核酸即可。

根据某些实施方式，所述沉默寡核苷酸包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；和SEQ ID NO:25。

根据一些实施方式，自身免疫疾病选自涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病和涉及单个器官或单个细胞类型障碍的自身免疫疾病。

根据另外的实施方式，涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、斯耶格伦氏综合征、全身性硬皮病、和大疱性类天疱疮。每种可能性代表本发明的单独实施方式。根据某个实施方式，涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病是SLE。根据进一步的实施方式，涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病是RA。根据又一实施方式，涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病是多发性硬化，其中对象不患有抑郁或任何其它情绪障碍。

根据进一步的实施方式，涉及单个细胞类型自身免疫障碍的自身免疫疾病选自桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性睾丸炎、古德帕斯彻氏病、自身免疫性血小板减少、重症肌无力(MG)、格雷夫斯氏病、原发性胆汁性肝硬变、膜性肾小球病(膜性肾病，membranousglomerulopathy)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(AGS)、视网膜血管病变伴有脑白质营养不良(RVCL)和STING相关幼年发病性血管病变(SAVI)。

根据一些实施方式，所述药物组合物被配制用于口服给予途径或用于肠胃外给予途径。根据另外的实施方式，所述药物组合物被配制成溶液、悬浮液、乳液、片剂、锭剂、粉末、喷雾、泡沫、膏状物、凝胶、或栓剂。

根据一些实施方式，所述药物组合物通过口服给予途径或肠胃外给予途径给予。根据另外的实施方式，所述肠胃外给予途径选自静脉内、皮下、肌肉内、经皮、局部、鼻内和阴道内给予。根据某些实施方式，所述药物组合物口服给予。

根据另外的实施方式，所述药物组合物进一步包含已知影响自身免疫疾病的至少一种另外的活性剂。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方式，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以本专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是示例性，而不意图必须是限制性的。

根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅以示例的方式给出，因为根据此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术而言将变得显而易见。

附图说明

图1A-图1K是显示核酸内切酶G(EndoG)缺陷对增加胞质溶胶mtDNA和I型干扰素信号传导的影响的图、显微照片和热图。图1A显示了由热图呈现的野生型和EndoG

图2A-图2N是显示释放游离的内mtDNA片段需要VDAC的图、显微照片和非限制性示例。图2A显示了通过实时PCR评估的WT和VDAC1/3

图3A-图3K是显示mtDNA与VDAC相互作用并使寡聚体稳定的非限制性示意图、图和显微照片。图3A显示了通过将VDAC重构为平面脂双层(PLB)的通道电导性测定的示意图。图3B-图3C显示了在先前暴露于高电压(60mV)之后mtDNA对VDAC1通道电导的抑制。VDAC1的全长被纯化并重构为大豆磷脂(azolectin)-平面脂双层膜。在+10mV和+40mV下沿顺式(图3B)或反式(图3C)方向添加mtDNA之前，和之后15分钟，在指示电压下使用双层重构的VDAC1获得的代表性电流迹线。图3D显示了在将指示浓度的mtDNA添加至顺式侧后，在±10mV和±40mV下测量的双层重构的VDAC1单通道稳态电流的抑制百分比。(●)和(○)分别指示在正电压和负电压下记录。图3E显示了mtDNA对VDAC1ΔN的通道电导。图3F是VDAC寡聚的示意图，显示了在寡聚状态下，VDAC1的N-末端区域(红色)易位至大的寡聚体孔中。N-末端区域中带正电荷的氨基酸残基(+:K12、R15、K20)在大孔周围形成可以与mtDNA相互作用并促进其穿过OMM的带正电荷的环。图3G显示了mtDNA诱导的VDAC1寡聚。用EGS(100μM)使纯化的WTVDAC1(图3G)与60nM mtDNA片段一起孵育。使用VDAC1抗体，通过蛋白质印迹法测定寡聚。图3h显示了三聚体、四聚体和多聚体的定量分析。图3I显示了VDAC1N-末端26个氨基酸的肽序列。带正电荷的氨基酸突变为丙氨酸(A：红色)。图3J显示了mtDNA片段与VDAC1 N-末端26肽的WT和丙氨酸突变体的相互作用。图3K显示了通过实时PCR在WT和丙氨酸突变体MEF中测量的ISG表达。所有值均表示为平均值±SEM。使用双尾非配对t检验评估图3J-图3K中的统计显著性；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns，不显著。

图4A-图4H是显示线粒体外膜相关蛋白、VDAC、Bax/Bak对ISG表达水平的调控的图和显微照片。图4A显示了WT和Bax/Bak-/-MEF中的cmtDNA水平。图4B显示了通过RT-qPCR测量的WT、Bax/Bak-/-、和EndoG敲低的Bax/Bak-/-MEF中ISG的表达水平。图4C-图4D显示了通过qPCR测量的WT和VDAC1/3-/-MEF中的cmtDNA水平(C)和mtDNA拷贝数(D)。图4E显示了在用100μM DIDS处理后LMTK-1(WT)和LMEB-4(ρ0)细胞的Ifi44表达水平。图4F-图4H显示了感染HSV-1-RFP(MOI 0.1)的WT和VDAC1/3-/-MEF中的病毒表达。在UV显微镜下观察到斑块大小和红色荧光强度(图4F)，通过FACS测定RFP阳性细胞的百分比(图4G)。通过病毒生长曲线测定HSV-1-RFP的复制动力学。MEF感染有HSV-1-RFP并在所示的时间收获。然后在Vero细胞中测定病毒滴度(图4H)。所有值均表示为至少三次独立实验的平均值±SEM。使用双尾非配对t检验评估a-e、g和h中的统计显著性。**p<0.01；***p<0.005；ns，不显著。

图5A-图5C是显示VDAC N-末端区域的功能的序列比对、3维结构图片和图。图5A显示了各个物种中VDAC1 N-末端区域序列的分析。图5B显示了通过SWISS-MODEL服务器预测的VDAC1 WT和突变体的N-末端结构域结构。图5C显示了通过实时PCR测量的WT和表达VDAC1ΔN的MEF中的ISG表达水平。所有值均表示为三次独立实验的平均值±SEM。使用双尾非配对t检验评估图5C中的统计显著性。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns，不显著。

图6A-图6K是显示ROS、Ca

图7A-图7L是显示VDAC寡聚抑制剂VBIT-4对狼疮样疾病的防护的图像、图和显微照片。图7A显示了VBIT-4-处理的MRL/lpr小鼠面部和背部区域的脱毛和皮肤损伤中的红斑的抑制。经处理小鼠的皮肤用苏木精和伊红(H&E)染色。图7B显示了图7A中小鼠的脱毛的定量。图7C显示了16周龄的经处理小鼠的脾和淋巴结的重量。图7D显示了经处理小鼠的脾中的ISG表达。通过实时PCR测量ISG表达水平。图7E显示了经处理小鼠的肾小球，用抗补体C3(绿色)和IgG(红色)的抗体染色。用Hoechst(蓝色)对细胞核染色。比例尺，50μm。图7F显示了图7E中小鼠的肾组织切片中C3和IgG的荧光强度。图7G-图7I显示了经处理小鼠的抗dsDNA水平(图7G)、白蛋白：肌酐比(图7H)、和血清mtDNA水平(图7I)。图7J显示了在与MitoSOX一起孵育1h后，通过荧光测量对健康对照(HC)或系统性红斑狼疮(SLE)对象的PBMC中线粒体ROS的定量。图7K(左)VBIT-4(5μM)对低密度粒细胞(LDG，SLE)的自发NET形成的抑制。(右)VBIT-4对正常密度粒细胞(NDG，SLE)的A23187刺激的NET形成的抑制。绿色代表人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)，而蓝色代表DNA(Hoechst)。比例尺，10μm。图7L显示了通过SYTOX-PicoGreen板测定测量来自HC或SLE对象的NDG的NET形成(每组n＝3)。所有值均表示为平均值±SEM。使用t检验评估图6B-图6D、图6F-图6I、和图6L中的统计显著性。使用Mann-Whitney U检验(HC对SLE)(j)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图8A-图8E是显示VDAC在狼疮样疾病模型中的作用的图和图像。高通量基因表达数据库(基因表达大篷车，Gene Expression Omnibus)(GEO)分析显示在健康对照和SLE(狼疮)患者中，EndoG和Tftam基因表达降低(图8A)，VDAC1/3表达增加(图8B)，而VDAC2、HSP60、Bak和Bax的表达水平没有差异(图8C)。原始数据获自GEO登录号GSE13887。图8D显示了11和16周龄的溶媒(vehicle)和VBIT4处理的小鼠的体重(每组n＝10)。使用双尾非配对t检验评估图A-图D中的统计显著性。*p<0.05；**p<0.01；ns，不显著。图8E显示了来自溶媒和VBIT4处理的SLE(狼疮)小鼠的脾和淋巴结的代表性照片。

图9A-图9B是非限制性示意图，显示了ROS增加所导致的线粒体膜中VDAC寡聚及其在cmtDNA释放和干扰素信号传导中的作用(图9A)和VBIT-4在人嗜中性粒细胞中对VDAC寡聚和NETosis的抑制作用(图9B)。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗由1型干扰素信号传导介导的疾病的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC抑制剂或包含其的药物组合物。

本发明进一步提供了用于治疗自身免疫疾病、减慢自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给予VDAC抑制剂或包含其的药物组合物。

在一些实施方式中，所述方法包括给予治疗有效量的至少一种如本文以下公开的哌嗪衍生物或哌啶衍生物。

哌嗪化合物

根据一些实施方式，用于本发明的方法的哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(I)：

其中：A是碳(C)或氮(N)；R

在一些实施方式中，所述方法包括向对其有需要的对象给予至少一种通式(I)的化合物，条件是当A是碳(C)，L

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R1是被三氟甲氧基取代的苯基。在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，L

术语“亚吡咯烷基”指代作为二价取代基的吡咯烷环。亚吡咯烷基包括未取代的和取代的环，如，但不限于吡咯烷-2-5-二酮、2-吡咯烷酮、5-硫代-2-吡咯烷酮、5-甲氧基-2-吡咯烷酮等。

在一个实施方式中，当A是氮(N)时，连接基团L

在另一实施方式中，A是碳(C)，R

本发明还涉及根据本发明的通式(I)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物、和盐，具体是生理学上可接受的盐。

根据某些实施方式，所述至少一种哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式Ia：

其中：A、R

根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Ib)：

其中：A、R

根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Ic)：

其中：A、R

根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Id)：

其中：L

在一些实施方式中，L

本发明还涉及根据本发明的通式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物和其盐。表1提供了通式(I)的化合物的非限制性实例。其包括以下化合物：N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)丁酰胺(式1)；1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮(式2)；(1-(萘-2-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-羰基)甘氨酸(式3)；1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式4)；1-(4-氯苯基)-5-硫代-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式5)；1-(4-氯苯基)-5-甲氧基-4-(4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)哌啶-1-基)吡咯烷-2-酮(式6)；1-(4-氯苯基)-5-硫代-4-(4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)哌啶-1基)吡咯烷-2-酮(式7)；4-(4-氯苯基)-4-氧基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式8)；和N-(4氯苯基)-4-羟基-N-甲基-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式9)。

表1：通式(I)的化合物的实例

在一些实施方式中，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物(在本文也被称为取代的N-杂环)由选自式#1(VBIT-4)、式#2(VBIT-3)、式#3(VBIT-12)、式#4(VBIT-5)、式#5(VBIT-6)、式#6(VBIT-9)、式#7(VBIT-10)、式#8(VBIT-7)或式#9(VBIT-8)的式或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐表示。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4、VBIT-3、VBIT-12、VBIT-5、VBIT-6、VBIT-9、VBIT-10、VBIT-7或VBIT-8或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。每种可能性都代表单独的实施方式。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4、VBIT-3或VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4或VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4或VBIT-3或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-4或其对映异构体、非对映异构体、或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-3或其对映异构体、非对映异构体、或盐。

下文更具体地定义了本文用于描述根据本发明的化合物的一些术语。

术语“N-杂环”和“氮-杂环”可以互换并且表示具有5至7个环原子的杂环化合物，其中至少一个是氮。N-杂环尤其包括哌啶和哌嗪。

术语“卤素”表示选自F、Cl、Br和I的原子，优选Cl和Br。

本文关于通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的R

术语“C

术语“C

术语“C

术语“C

术语“C

术语“C

通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如WO 2018/116307和US 2018/0078548，其内容通过引用并入本文，如同在本文全部阐述一样)。

本发明还涉及通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物的立体异构体，如非对映异构体和对映异构体、混合物和盐，具体是生理学上可接受的盐。

通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物、或通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的合成中的中间产物可以使用本领域已知的方法基于其物理-化学差异解析(resolved)成其对映异构体和/或非对映异构体。例如，顺式/反式混合物可以通过色谱法解析成其顺式和反式异构体。例如，可以通过对手性相的色谱法或通过从旋光溶剂中重结晶或通过对映异构体富集的晶种来分离对映异构体。

通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物可以转化为其盐，具体是用于药物用途的生理学上可接受的盐。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物的合适的盐可以用有机酸或无机酸，包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸形成。可以用有机碱或无机碱将含有羧基的通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物转化为其盐，具体转化为生理学上可接受的盐，用于药物用途。用于此目的的合适的碱包括，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、精氨酸或乙醇胺。

根据某些实施方式，所述化合物具有通式(IIa)：

其中：A是碳(C)；R

在一些实施方式中，A是碳(C)，R

在一些实施方式中，A是碳(C)，R

根据某些实施方式，本发明的方法包括向对象给予至少一种根据通式(IIa)的化合物，其具有选自式10和式11的结构式：

式10的化合物在本文中也标识为AKOS022或AKOS022075291。

式11的化合物在本文中也标识为DIV 00781。

通式(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式10和11的化合物，可以转化为其盐，具体是生理学上可接受的盐，用于药物用途。通式(IIa)的化合物——包括但不限于结构式10和11的化合物——的合适的盐可以用有机酸或无机酸，诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸形成。可以用有机碱或无机碱将含有羧基的通式(IIa)的化合物转化为其盐，具体转化为生理学上可接受的盐，用于药物用途。用于此目的的合适的碱包括，例如，钠盐、钾盐、精氨酸盐、铵盐、或乙醇胺盐。

肽

本发明还部分地基于以下出乎预料的发现，即mtDNA与VDAC1的相互作用需要VDAC1的N-末端结构域。N-末端结构域含有三个带正电荷的残基(K12、R15、K20)，其可以与mtDNA的带负电荷的骨架相互作用。事实上，与表达WT VDAC1的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)相比，表达N-末端或N-末端截短蛋白突变的VDAC1(ΔN-VDAC1)的小鼠胚胎成纤维细胞中ISG表达显著降低，表明N-末端结构域在与mtDNA相互作用和激活cGAS途径两者中的重要性。

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是这样的肽，其衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-26并且包括：(a)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个突变；(b)相比于SEQ ID NO:1的至少1个氨基酸的截短；或其任意组合，并且其中突变的、截短的或两者的VDAC抑制性肽缺乏促凋亡活性。

在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽不对细胞凋亡进行诱导、引发、传播、或其任意等同表达(equivalent)。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含至少1个突变，其中所述突变使所述肽具有抗凋亡性或非促凋亡性。

应理解，本发明包括具有1-25个氨基酸之间任意长度的肽，所述1-25个氨基酸衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26，例如衍生自或对应于人VDAC1N-末端结构域的氨基酸残基1-26的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个氨基酸。

根据某些实施方式，所述肽包含8个氨基酸。根据其它实施方式，所述肽包含12个氨基酸。根据另外的实施方式，所述肽包含16个氨基酸。根据进一步的实施方式，所述肽包含22个氨基酸。

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是包含衍生自人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26的连续序列的1-25个氨基酸的肽。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含更少的氨基酸。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽是SEQ ID NO:1的截短形式。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含一个或多个突变和至少2个氨基酸的截短。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含至少2、至少3、至少4、或至少5个突变，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、或4-5个突变。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述突变位于所述VDAC抑制性肽的C'-末端的最后5个氨基酸中。在一些实施方式中，所述突变位于所述抑制性肽的C-末端处GXXXG基序(SEQ ID NO:3)中。在一些实施方式中，所述截短是所述VDAC抑制性肽的C'-末端处至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5个氨基酸的省略或缺失，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述截短是所述VDAC抑制性肽的C'-末端处1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、或4-5个氨基酸的省略或缺失。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述截短是所述抑制性肽的C-末端处GXXXG基序(SEQ ID NO:3)的完全或部分的省略或缺失。如本文所用，“完全”是100％，例如，GXXXG基序的5个氨基酸全都从所述VDAC抑制性肽中缺失。如本文所用，部分地包含GXXXG基序的1-2、1-3、1-4、2-3、2-4、或3-4个氨基酸从所述VDAC抑制性肽中缺失。

在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：MAVPPTYADLGKSARDVFTKXYXFX(SEQ ID NO:2)，其中X是除甘氨酸以外的任意氨基酸。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；或SEQ ID NO:8。

在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID:9；SEQ ID:10；SEQ ID:11；SEQ ID:12或SEQ ID:13。在一个实施方式中，本发明的肽包含调节VDAC1和mtDNA之间的相互作用的氨基酸序列。如本文所用，术语“调节”包括“提高”和“增加”或“降低”和“减少”。

本发明的另一目的是提供基于VDAC1 N-末端结构域的序列的短肽及其缀合物，所述短肽及其缀合物包含具有进一步提高的稳定性和细胞渗透性质的肽模拟物(peptidomimetic)化合物。这种化合物的非限制性实例包括所选择的肽残基的N-烷基化、所选择的肽残基的侧链修饰、非天然氨基酸、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺和肼用于肽键取代、以及通过肽键或非肽键并入非肽部分，包括但不限于哌啶、哌嗪和吡咯烷。根据本发明的肽模拟物中氨基酸残基之间的修饰的键可以选自：酰胺、脲、氨基甲酸酯、肼或磺酰胺键。除非另有明确说明，否则氨基酸残基之间的键均是酰胺键。

酶促降解的稳定性是设计用作治疗剂的合成肽的重要因素。已知氨基酸的D-立体异构体对这种降解更稳定。

因此，根据某些实施方式，本发明的肽是L-立体异构肽，仅包含L-氨基酸。根据其它实施方式，所述肽是D-L立体异构肽，包含D-氨基酸和L-氨基酸的组合。根据又一实施方式，所述肽是D-立体异构肽，仅包含D-氨基酸。

根据某些实施方式，基于VDAC1 N-末端结构域的肽与通过直接的键或通过连接体共价连接至所述肽的渗透性增强部分缀合，形成肽缀合物。

根据本发明的渗透性增强部分可以连接至活性肽的C-末端游离基团。所述部分可以直接连接至肽或通过连接体或间隔体(spacer)连接。

主动或被动促进化合物对细胞的渗透性或增强化合物对细胞的渗透性的本领域已知的任何部分都可以用于与根据本发明的肽核心缀合。非限制性实例包括：疏水部分，如脂肪酸、类固醇和大体积芳香族或脂肪族化合物；可具有细胞膜受体或载体的部分，如类固醇、维生素和糖类、天然和非天然氨基酸、脂质体、纳米颗粒和转运肽。根据某些实施方式，渗透性增强部分是细胞穿透肽(CPP)。在一个示例性实施方式中，CPP是包含果蝇触角足(Drosophila antennapedia)(ANTP)结构域的氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，ANTP结构域包含SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列。根据这些实施方式，所述肽缀合物包括包含SEQ ID:14的氨基酸序列，在其前面是连续的SEQ IN No:4-13中的任意一个。

根据另外的示例性实施方式，CPP包含由人运铁蛋白受体(Tf)识别的TIR结构域的片段，其具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16中所列的氨基酸序列。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。也可以使用本领域已知的其它CPP作为TAT。

沉默寡核苷酸

根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是VDAC1沉默寡核苷酸分子或包含其的构建体。任何VDAC1沉默寡核苷酸分子都可以用于本发明的方法中，只要所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:17、与其所编码的mRNA分子或与和其互补的序列相同的至少15个连续核酸即可。

在一些实施方式中，所述VDAC1沉默寡核苷酸与SEQ ID NO:17相同至少14个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少15个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少16个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少17个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少18个连续核酸、与SEQ IDNO:17相同至少19个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少20个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少21个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少22个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少23个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少24个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少25个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少26个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少27个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少28个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少29个连续核酸、或与SEQID NO:17相同至少30个连续核酸，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述VDAC1沉默寡核苷酸与SEQ ID NO:17相同14至30个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同15至28个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同16至29个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同22至26个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同17至25个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同16至24个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同24至30个连续核酸、与SEQ IDNO:17相同16至23个连续核酸、或与SEQ ID NO:17相同18至26个连续核酸。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。

根据某些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸包含选自以下的核酸序列：SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ IDNO:24；SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28，或其互补序列。

根据某些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)分子或反义分子。根据一些实施方式，RNAi分子是未修饰的和/或修饰的双链(ds)RNA分子，包括但不限于小时序RNA(short-temporal RNA)(stRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、和微小RNA(miRNA)。

根据某些示例性实施方式，RNAi是siRNA。根据一些示例性实施方式，siRNA包含与SEQ ID NO:17的至少15个核苷酸或与其所编码的mRNA相同的第一寡核苷酸序列以及与所述第一寡核苷酸基本上互补的第二寡核苷酸序列；其中所述第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列彼此退火形成siRNA分子。

根据一些实施方式，siRNA是单链短发夹RNA(shRNA)，其中第一寡核苷酸序列与第二寡核苷酸序列通过连接体分开，该连接体在第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列退火时形成环结构。在一些实施方式中，连接体为约3至约60个核苷酸。

根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:18中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:31中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:19中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:26中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:20中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:27中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:25中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:28中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据另外的实施方式，siRNA核酸中的至少一种被化学修饰。通常，所述修饰是鸟嘌呤或尿嘧啶的2'-O-甲基修饰。根据某些实施方式，RNAi的第一多核苷酸和第二多核苷酸包含若干化学修饰的鸟嘌呤和/或尿嘧啶核苷酸。

根据某些示例性实施方式，修饰的siRNA分子包含具有SEQ ID NO:29中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:30中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据某些示例性实施方式，修饰的siRNA分子包含具有SEQ ID NO:32中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:33中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

根据某些实施方式，所述方法包括向对象给予能够在所述对象的细胞中表达治疗有效量的至少一种VDAC1沉默寡核苷酸的构建体。根据一些实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达包含选自SEQ ID No:18-25的核酸序列的至少一种寡核苷酸的构建体。根据一些实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达包含SEQ ID No:26-28和31中任一个所列的核酸序列的siRNA分子的构建体。根据某些示例性实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达siRNA寡核苷酸的构建体，所述siRNA寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:18中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:31中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。根据某些示例性实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达siRNA寡核苷酸的构建体，所述siRNA寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:29中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:30中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。

可以根据本领域已知的任何核酸合成方法，包括酶促合成和固相合成两者生成根据本发明的教导设计的沉默寡核苷酸分子。也可以采用用于这种合成的任何其它手段；核酸剂的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以通过例如：Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001),“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Ausubel,R.M.等人,eds.(1994,1989),“Current Protocols in Molecular Biology,”第I-III卷,JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland；Perbal,B.(1988),"A Practical Guide to MolecularCloning,"John Wiley&Sons,New York；和Gait,M.J.,ed.(1984),“OligonucleotideSynthesis”中详述的已建立的方法；利用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺，之后脱保护，脱盐，并通过例如自动化的基于三苯甲基的方法(trityl-on method)或HPLC纯化来完成。

将理解，本发明的核酸剂也可以利用如本文以下进一步描述的表达载体产生。

在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低mtDNA从线粒体释放至胞质溶胶的速率。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低胞质溶胶中mtDNA/片段(例如，cmtDNA)的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物维持线粒体中mtDNA/片段的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC寡聚的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC mRNA的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC mRNA的稳定性。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白合成的速率。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白的电导。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低1型干扰素信号传导的水平。术语“抑制”和“降低”在本文中可互换使用。

在一些实施方式中，术语“抑制”指代与对照相比降低至少5％、至少15％、至少25％、至少40％、至少50％、至少70％、至少85％、至少95％、至少97、至少99％、或100％，或其之间的任意值或范围。在一些实施方式中，抑制指代与对照相比降低5-15％、10-25％、20-40％、30-50％、45-70％、65-85％、80-95％、90-97、94-99％、或95-100％。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。

药物组合物

本发明提供了药物组合物，其包含通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的一种或多种化合物，诸如而不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，具体是式1、2、3、10和11的特定化合物，或其对映异构体、非对映异构体、混合物或药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自自身免疫疾病和1型干扰素介导的疾病的疾病。

本发明提供了药物组合物，其包含本文公开的VDAC抑制性肽和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自1型干扰素介导的疾病和自身免疫疾病的疾病。

本发明提供了药物组合物，其包含VDAC1沉默寡核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自1型干扰素介导的疾病和自身免疫疾病的疾病。

根据某些实施方式，本发明的VDAC1沉默寡核苷酸分子，具体是siRNA分子被包封在适合于将siRNA递送至对其需要的对象中的作用位点的颗粒中。根据某些实施方式，siRNA被包封在聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)基纳米颗粒中。根据某些实施方式，PLGA基纳米颗粒进一步包含聚乙烯亚胺(PEI)，在本文中也被称为PEI-PLGA纳米颗粒。

本发明进一步提供了药物组合物，其包含未修饰的和修饰的本发明的VDAC1沉默寡核苷酸、包含其的颗粒、和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

根据某些实施方式，所述组合物被配制用于局部、瘤内、静脉内或肺部给予。

术语“药学上可接受的”意为经联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它普遍承认的药典中列出用于动物，更具体地用于人。

术语“载体”指代与治疗化合物一起给予的稀释剂、佐剂、或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。

所述组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、贴剂、凝胶、膏状物、软膏、缓释制剂等形式。

所述药物组合物可以进一步包含药物赋形剂，包括但不限于润湿剂、乳化剂和pH调节剂。抗细菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；并且还设想了用于调节张力的剂，如氯化钠或右旋糖。

对于治疗化合物的静脉内给予，水是优选的载体。也可以采用盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油水溶液。也可以使用缓冲剂。

用于肠胃外给予的药物组合物也可以配制成活性化合物的悬浮液。这种悬浮液可以制备成油性注射悬浮液或水性注射悬浮液。对于油性悬浮液注射，可以使用合适的亲脂性溶剂或媒介物，包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的剂，从而允许制备高浓缩溶液。

对于经粘膜和经皮给予，可以在制剂中使用适合于待对屏障进行渗透的渗透剂。这种渗透剂，包括例如DMSO或聚乙二醇，是本领域已知的。

对于口服给予，可容易地通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体和赋形剂组合来配制所述化合物。这些载体使得本发明的化合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等供对象口服摄入。可以使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并在添加合适的助剂(如果需要的话)后对颗粒混合物进行处理，以获得片剂或糖衣丸芯来制备口服使用的药理学制剂。合适的赋形剂具体是填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

另外，如果期望防止本发明的化合物暴露于胃环境，则可以使用肠溶衣。

可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合胶囊(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软质密封胶囊。推合胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。

在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。

通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)，具体是结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，更具体是式1、2、3、10和11的特定化合物及其药学上可接受的盐可以配制成纳米颗粒。纳米颗粒可以在公知的聚合物，例如聚乳酸-共-乙醇酸中制备。通常，所述化合物可以与所述聚合物共同溶解在合适的有机溶剂中，然后可以将有机相分散在包含稳定剂和/或表面活性剂的水相中。稳定剂可以是例如聚乙烯醇。在有机溶剂从水相中蒸发后，纳米颗粒可以被纯化，例如通过离心和洗涤。

根据一些实施方式，所述药物组合物包含根据本发明的VDAC1基的肽和屏蔽颗粒(保护颗粒，shielding particle)。在某些实施方式中，屏蔽颗粒包含聚乙二醇(PEG)和/或脂质。

根据一些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸分子被包封在聚乙烯亚胺(PEI)-聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒内。

所述组合物可以与常规的粘合剂和载体，如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶一起配制成栓剂。

可以根据本领域，例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(先前被称为Remington’s Pharmaceutical Sciences)，ISBN 978-0-85711-062-6提供的一般指导，通过本领域公知的方法，例如通过常规的混合、溶解、造粒、研磨、磨碎、糖衣丸制造、研碎、乳化、包封、包埋或冻干方法制造本发明的药物组合物。

待给予的组合物的剂量将取决于多种因素，包括被治疗的对象、自身免疫疾病的阶段、给予途径、和处方医师的判断。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种已知治疗自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的活性剂。

治疗用途

本发明提供了用于减慢自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC1抑制性化合物或包含其的药物组合物，从而减慢自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状。

本发明提供了用于减慢NETosis相关自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗NETosis相关自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC1抑制性化合物或包含其的药物组合物，从而减慢NETosis相关自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗NETosis相关自身免疫疾病或与其相关的一种或多种症状。

本发明提供了用于减慢1型干扰素介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗1型干扰素介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC1抑制性化合物或包含其的药物组合物，从而减慢1型干扰素介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗1型干扰素介导的疾病或与其相关的一种或多种症状。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合对本文所公开的疾病进行治疗的对象的步骤。在一些实施方式中，与对照相比，合适的对象具有增加水平的：NET(即，NETosis)、1型干扰素信号传导、胞质溶胶mtDNA、或其任意组合。

用于测定NETosis、1型干扰素信号传导和胞质溶胶mtDNA水平的方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，如下文所示例。

NET的定量和可视化的方案的非限制性实例如下：在例如正常密度的粒细胞中诱导NET，通过在RPMI 1640培养基中将该细胞与钙离子载体A23187(25μM)一起孵育2h，然后使用SYTOX荧光染料在485/520nm下对胞外DNA定量来对NET进行定量。在485/520nm下测量例如t＝0min的PicoGreen的荧光(发射/消光)，以对总DNA定量。NET定量的另一非限制性实例包括荧光显微术。简而言之，将细胞附着在盖玻片室上，在37℃下用钙离子载体刺激90min，在4℃下用4％多聚甲醛固定过夜，并用0.2％Triton X-100透化10min，之后0.5％明胶20min。然后在室温下用抗人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抗体对细胞染色2h，在PBS中洗涤，并用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488二抗在室温下染色2h。封固后，通过共聚焦显微镜对细胞可视化。

不希望受任何理论或作用机制的束缚，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的化合物，具体是具有式1的化合物(VIBIT-4)抑制VDAC寡聚、mtDNA释放、1型干扰素信号传导和嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的能力有助于其在治疗自身免疫疾病(例如SLE)中的治疗效果。

如本文所用，短语“mtDNA泄漏”包括完整的mtDNA的泄露、mtDNA片段的泄漏、或其组合。

在一些实施方式中，所述方法涉及减少或抑制mtDNA、其片段、或其组合从线粒体中泄漏。在一些实施方式中，所述方法涉及减少循环mtDNA的量或水平。在一些实施方式中，所述方法涉及抑制或减少线粒体的基质或嵴内空间(intra-cristae space)、线粒体的外围空间或两者、胞质、胞外环境、循环(例如，血液、血清)、或其任意组合中mtDNA/片段的量或水平。在一些实施方式中，自身免疫应答、疾病或障碍包括mtDNA/片段泄漏。

如本文所用，术语“嵴内空间”指代在线粒体内膜的嵴内形成的空间。如本文所用，术语“外围空间”指代在线粒体内膜和外膜之间形成的空间。

用于测定mtDNA泄漏或循环mtDNA的量或水平的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。用于测定循环mtDNA/片段泄漏的量的方法的非限制性实例在下文示例，并且包括但不限于实时定量PCR和特异性引物的使用。

在一些实施方式中，提供了用于降低循环mtDNA/片段的量或水平的组合物，其中循环在胞质、胞外环境、循环(例如，血液、血清)、或其任意组合中。

在一些实施方式中，所述方法涉及通过向具有增加的循环mtDNA/片段量或水平的对象给予治疗有效量的VDAC抑制剂或包含其的组合物来治疗自身免疫疾病或障碍。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的术语“VDAC”指代高度保守的线粒体孔蛋白家族的电压依赖性阴离子通道蛋白。该术语指代所有VDAC同种型，例如指代同种型VDAC1、指代同种型VDAC2、或指代同种型VDAC3。

如本文所用，术语“自身免疫疾病”指代由针对对象的自身组织或组织成分的免疫应答或固有地对对象无害的抗原所引起的障碍。如本文所用，术语自身免疫疾病不包括糖尿病。

症状和严重程度可以变化。自身免疫疾病包括但不限于经常被称为涉及单个器官或单个细胞类型的自身免疫障碍的自身免疫疾病和经常被称为涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病。单个器官或单个细胞类型的自身免疫障碍的非限制性实例包括桥本氏甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血的自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性睾丸炎、古德帕斯彻氏病、自身免疫性血小板减少、交感性眼炎、重症肌无力(MG)、格雷夫斯氏病、原发性胆汁性肝硬变、慢性攻击型肝炎、和膜性肾小球病。涉及全身性自身免疫性障碍的自身免疫疾病的非限制性实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、斯耶格伦氏综合征、莱特尔综合征、多发性肌炎-皮肌炎、全身性硬皮病、结节性多动脉炎、和大疱性类天疱疮。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。

根据本发明的一个实施方式，自身免疫疾病是系统性红斑狼疮(SLE)。根据另外的实施方式，自身免疫疾病是类风湿性关节炎(RA)。根据进一步的实施方式，自身免疫疾病是多发性硬化(MS)，并且待治疗的对象精神健康，即不患有抑郁或任何其它情绪障碍。

如本文所用，术语“NETosis相关的自身免疫疾病”指代涉及在嗜中性粒细胞死亡后释放嗜中性粒细胞胞外陷阱的任何自身免疫疾病或障碍。

可选地或另外地，可以用本发明的组合物治疗或预防的自身免疫疾病包括那些涉及组织损伤的障碍，所述组织损伤是由于对免疫原或内源性起源的抗原的体液和/或细胞介导的应答而发生的。这种疾病常常被称为涉及非过敏性(即，II型、III型和/或IV型)超敏反应的疾病。

当免疫球蛋白与细胞或组织的抗原组分，或与已与细胞紧密偶联的抗原或半抗原反应时，产生II型超敏反应(也称为细胞毒性、细胞溶解补体依赖性或细胞刺激性超敏反应)。通常与II型超敏反应相关的疾病包括但不限于自身免疫性溶血性贫血、胎儿溶血症和古德帕斯彻氏病。

III型超敏反应(也称为毒性复合物、可溶性复合物或免疫复合物超敏反应)由可溶性循环抗原-免疫球蛋白复合物在血管或组织中的沉积，伴随免疫复合物沉积位点的急性炎症反应而引起。原型的III型反应疾病的非限制性实例包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节、多发性硬化、血清病、某些类型的肾小球性肾炎、和大疱性类天疱疮。

IV型超敏反应(常常称为细胞的、细胞介导的、延迟的、或结核菌素型超敏反应)由致敏性T淋巴细胞引起，致敏性T淋巴细胞由与特异性抗原的接触产生。被引用为涉及IV型反应的疾病的非限制性实例是接触性皮炎和同种异体移植物排斥。

要通过本发明的方法治疗的对象是选自以下的人对象：患有所述疾病的患者；患有所述疾病的患者，其中所述患者处于缓解期；患有所述疾病的患者，所述患者已表现出与所述疾病相关的症状；及其任意组合。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合使用本发明的VDAC抑制性化合物治疗的对象的步骤，其中选择包括确定对象与健康对照相比具有增加的VDAC1表达水平。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括用于监测对象的治疗的有效性或进展的步骤，其中监测包括确定治疗的对象与未治疗的对照相比具有降低的VDAC1表达水平。如本文所用，未治疗的对照包括未给予本发明的VDAC抑制性化合物的上文所公开的患病对象或在用本发明的VDAC抑制性化合物治疗之前的患病对象。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合使用本发明的VDAC抑制性化合物治疗的对象的步骤，其中选择包括确定对象与健康对照相比具有增加的NETosis。

在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括监测对象的治疗的有效性或进展的步骤，其中监测包括确定治疗的对象与未治疗的对照相比具有降低的NETosis。如本文所用，未治疗的对照包括未给予本发明的VDAC抑制性化合物的上文所公开的患病对象或在用本发明的VDAC抑制性化合物治疗之前的患病对象。

本领域技术人员将理解，以上列举的多种自身免疫疾病与严重的症状相关，即使在隐晦的自身免疫疾病可能未被改善的情况下，这些严重症状的改善也会提供显著的治疗益处。本发明的方法用于治疗和/或预防与以上列举的自身免疫疾病相关的多种不良症状。

作为一个具体实例，系统性红斑狼疮(SLE)通常与诸如发热、关节疼痛(关节痛)、关节炎和浆膜炎(胸膜炎或心包炎)的症状相关。在SLE的情况下，本发明的方法在实现通常与SLE相关的任何症状的减轻或改善时被认为提供治疗益处，而不管所述治疗是否导致对隐晦的SLE的同时治疗。

在一些实施方式中，在肾功能因SLE(或其它自身免疫疾病)受损的情况下，所述治疗方法导致对象的肾功能改善(例如，减慢其损失)，如通过例如蛋白尿、清蛋白尿等的变化所评估的。

因此，在一些实施方式中，相对于对照对象，本发明的方法使尿(蛋白尿)中分泌的蛋白的量、尿(清蛋白尿)中分泌的白蛋白的量、和/或患者的血清肌酐水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。在其它实施方式中，相对于对照对象，本发明的方法使肾功能的损失减慢至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。在下文的实施例中描述了用于评估肾功能的非限制性示例性方法。

作为另一实例，类风湿性关节炎(RA)通常导致全身目标关节肿胀、疼痛、活动度丧失和压痛。RA的特征在于慢性发炎的滑膜，其密集地挤满了淋巴细胞。滑膜(其通常是一个细胞层厚)变得细胞密集，并呈现出类似于淋巴组织(包括树突细胞、T-、B-和NK细胞、巨噬细胞和浆细胞簇)的形式。这个过程以及过多的免疫病理机制，包括抗原-免疫球蛋白复合物的形成，最终导致关节的完整性受到破坏，导致关节处或关节附近畸形、永久性功能丧失和/或骨侵蚀。所述方法可以用于治疗或改善RA的任一种、若干或所有这些症状。因此，在RA的情况下，本发明的方法在实现通常与RA相关的任何症状的减轻或改善时被认为提供治疗益处，而不管所述治疗是否导致对隐晦的RA的同时治疗和/或对循环类风湿因子(“RF”)的量的减少。

作为另一具体实例，多发性硬化(“MS”)通过以下使患者残疾：扰乱视力；刺激双重视觉；干扰运动功能，影响行走和手的使用；产生膀胱失禁；痉挛状态；和感觉缺陷(触觉、疼痛和温度敏感性)。在MS的情况下，本发明的方法在实现任一种或多种通常与MS相关的致残效果的进展的改善或减少时被认为提供治疗益处，而不管所述治疗是否导致对隐晦的MS的同时治疗。本发明的方法旨在治疗患有MS的对象，所述对象未患有抑郁或与MS相关的任何其它情绪障碍。

本发明的方法预期减慢自身免疫疾病的进展、改善至少一种症状、和/或提高存活。例如，本发明的方法可以导致自身抗体、产生自身抗体的B细胞、和/或自体反应T细胞的水平降低。与预处理水平相比，这些参数中的任一个的降低可以是例如至少10％、20％、30％、50％、70％或更多。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。

本文关于本发明的化合物所用的术语“治疗有效量”是化合物当向对象给予时将具有预期治疗效果(例如改善与自身免疫疾病相关的症状(一种或多种))的量。完全的治疗效果不一定通过给予一种剂量出现，而可能仅在给予一系列剂量后才出现。因此，治疗有效量可以以一种或多种剂量来给予。对象所需的精确有效量将取决于例如对象的体重、健康和年龄、自身免疫疾病的性质、具体自身免疫疾病症状的程度和严重性、本发明的药物组合物的给予模式，以及任选地，本发明的药物组合物与另外的活性剂(一种或多种)的组合。

本文所用的术语“治疗”指代抑制疾病状态，即，阻止疾病状态或其临床症状的发展，或缓解疾病状态，即，导致疾病状态或其临床症状的暂时或永久消退。该术语可以与以下任一种或多种互换：废除、改善、抑制、减弱、阻断、阻抑、减少、停止、减轻或预防疾病或与疾病相关的任何症状。

本文所用的术语“预防”意为在可能暴露于或易患疾病状态但尚未经历或表现出疾病状态的症状的对象中不引起疾病状态的临床症状发展。

动物模型可以用作评估自身免疫疾病的治疗的资源。对于系统性红斑狼疮(SLE)，通常使用被称为MRL-lpr的小鼠模型。MRL-lpr小鼠是淋巴细胞增生自发突变(Fas

实现疾病治疗所需的VDAC抑制性化合物的剂量通常取决于将要给予的化合物的药代动力学和药效学性质、患者、疾病的性质、和给予途径。这种化合物的合适剂量范围可以为1.0至100mg/kg体重。

根据一些实施方式，本发明的方法涉及使嗜中性粒细胞与以相比预处理水平有效减少线粒体DNA释放和/或干扰素基因表达和/或NET形成至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多的量的本发明的一种或多种化合物或包含其的药物组合物接触。

在审查以下不旨在是限制性的实例后，本发明的另外目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。另外，以上描述的和以下权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方式和方面中的每一个都在以下实施例中找到实验支持。应理解，为清楚起见，在单独实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或适用于本发明的任意其它描述的实施方式的方式来提供。在各种实施方式的背景下描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下无法操作。

实施例

材料和方法

细胞培养和细胞组分测量

使用以下小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)：VDAC1/3

为生成具有敲低基因的MEF，针对小鼠EndoG(SHCLNV-NM_007931)和TFAM(SHCLNV-NM_009360)的MISSION shRNA慢病毒转导颗粒(Sigma-Aldrich)购自Sigma-Aldrich，并且在聚凝胺(8μg/ml)的存在下用编码慢病毒的shRNA原液(stocks)转导MEF。小鼠cGAS(ON-TARGETplus Mb21d1 siRNA:214763)、STING(ON-TARGETplus Tmem173 siRNA:72512)、Tbk1(ON-TARGETplus Tbk1 siRNA:56480)、ExoG(ON-TARGETplus ExoG siRNA:208194)、EndoG(ON-TARGETplus EndoG siRNA:13804)和对照siRNA(ON-TARGETplus非靶向siRNA)购自Dharmacon。根据制造商的说明书，用50nM siRNA和脂转染胺RNAiMAX试剂(Invitrogen)进行MEF的siRNA转染。为过表达VDAC1 WT、VDAC1ΔN26和丙氨酸突变的VDAC1，亚克隆26-aa截短形式的VDAC N-末端或使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)，利用引物：正向SEQ ID NO:34和反向SEQ ID NO:35使WT VDAC1基因突变。根据制造商的说明书，使用脂转染胺3000试剂(Invitrogen)将DNA瞬时转染至VDAC1/3

使用WT和EndoG

RNA测序和生物信息学分析

使用RNeasy Plus RNA提取试剂盒(QIAGEN)从WT和EndoG

RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明书，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用Accupower RT PreMix(BioNeer)由2μg纯化的mRNA合成单链cDNA。反应混合物在42℃下孵育60min，以及在94℃下孵育5min。使用LightCycler 96系统(Roche Life Science)，采用SYBR Green master混合物(Roche)进行实时RT-PCR。使用的引物如下(5’-3’)：EndoG正向(SEQ ID NO:36)和反向(SEQ ID NO:37)；Cxcl10正向(SEQ ID NO:38)和反向(SEQ ID NO:39)；GAPDH正向(SEQ ID NO:40)和反向(SEQ ID NO:41)；Ifi44正向(SEQ ID NO:42)和反向(SEQ ID NO:43)；Ifit1正向(SEQ ID NO:44)和反向(SEQ ID NO:45)；Ifit3正向(SEQ IDNO:46)和反向(SEQ ID NO:47)；IFNα4正向(SEQ ID NO:48)和反向(SEQ ID NO:49)；IFNβ正向(SEQ ID NO:50)和反向(SEQ ID NO:51)；Iigp1正向(SEQ ID NO:52)和反向(SEQ ID NO:53)；ISG15正向(SEQ ID NO:54)和反向(SEQ ID NO:55)；Oasl2正向(SEQ ID NO:56)和反向(SEQ ID NO:57)；Rsad2正向(SEQ ID NO:58)和反向(SEQ ID NO:59)；USP18正向(SEQ IDNO:60)和反向(SEQ ID NO:61)；VDAC1正向(SEQ ID NO:62)和反向(SEQ ID NO:63)。GAPDH用作mRNA表达的内标，并使用LightCycler 96仪器软件(Roche)计算目标基因表达与GAPDH表达的比。基于DNA片段的熔解温度(T

细胞裂解液制备和蛋白质印迹法分析

收获MEF并用冰冷的PBS洗涤两次，并使沉淀在冰上于新鲜补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4,0.15M NaCl,1.0mM EDTA,1％NP-40,0.25％脱氧胆酸钠)中裂解30min。根据制造商的说明书，使用NE-PER核和细胞质试剂盒(Pierce)获得核提取物。通过考马斯加蛋白质测定(Coomassie Plus protein assay)(Thermo Scientific)测定总蛋白质浓度并进行蛋白质印迹法。使用以下抗体：ISG15(#2743,细胞信号传导)；EndoG(ab76122,abcam)；VDAC1(ab14734,abcam)；磷酸化IRF3(#29047,细胞信号传导)；IRF3(#4302,细胞信号传导)；磷酸化-TBK(#5483,细胞信号传导)；p-STAT1(#9167,细胞信号传导)；核纤层蛋白B1(#13435,细胞信号传导)；P62(#5114,细胞信号传导)；LC3A/B(#4108,细胞信号传导)；IFI44(MBS2528890,MyBioSource)；α-微管蛋白(sc-8035,Santa Cruz)。

mtDNA释放的定量

将MEF重悬在170μl含有150mM NaCl、50mM HEPES pH 7.4和25μg/ml毛地黄皂苷(EMD Millipore Corp)的毛地黄皂苷缓冲液中。将匀浆在室温下在旋转器上孵育10min，之后在4℃下以16,000g离心25min。上清液(cmtDNA)的1:20稀释液用于实时RT-PCR。将沉淀重悬于含有5mM EDTA和蛋白酶K(Qiagen)的340μl裂解缓冲液中，并在55℃下孵育过夜。消化后的沉淀用水稀释(1:20至1:100)，并在95℃下加热20min钝化蛋白酶K，并将样品用于实时PCR。使用的引物如下(5’-3’)：D-环1正向(SEQ ID NO:64)和反向(SEQ ID NO:65)；D-环2正向(SEQ ID NO:66)和反向(SEQ ID NO:67)；D-环3正向(SEQ ID NO:68)和反向(SEQ ID NO:69)。对于每个样品，将上清液中的cmtDNA标准化为沉淀中的总线粒体DNA。

从小鼠肝脏的线粒体中分离线粒体内膜基质。肝脏组织用冰冷的PBS洗涤两次，并在含有225mM甘露醇、75mM蔗糖、5mM MOPS、0.5mM EGTA和2mM牛磺酸(pH7.25)的线粒体分离缓冲液中用蛋白酶抑制剂混合物(Roche)切碎。通过用杵A(大间隙)的10次Dounce匀浆器往复(strokes)进行初始往复，然后杵B使用预冷却的Dounce均质机(Abcam)进行25次往复使细胞破裂。搅匀的样品在4℃下以1000g离心10min。将上清液转移至新管中并在4℃下以1,000g离心5min，并在使最终上清液在4℃下以11,500g离心10min后收集线粒体沉淀。在冷室中将线粒体于20mM KH

为了定量fimtDNA释放，将143B细胞重悬于线粒体分离缓冲液中，随后用杵B(小间隙)匀浆30次。搅匀的样品在4℃下以1,000g离心10min。将上清液转移至新管中并在4℃下以1,000g离心5min，并在将最终上清液在4℃下以11,500g离心10min之后收集线粒体沉淀。在冰上将分离的线粒体重悬于含有10mM PIPES pH 6.8、300mM蔗糖、100mM NaCl、3mMMgCl

fimtDNA和cmtDNA的测序

为制备fimtDNA以用于测序，我们使用percoll梯度法从MEF中分离出纯线粒体，而不受其它细胞器的污染。通过在冰上将纯线粒体于CSK缓冲液中孵育5min来制备fmtDNA，并通过将MEF在毛地黄皂苷缓冲液中孵育10min来制备cmtDNA。根据制造商的说明书，纯化的fimtDNA和cmtDNA用于使用ThruPLEX Plasma-seq试剂盒(Takara)来构建NextGen测序文库。使用Illumina MiSeq平台，以2×75bp模式获取测序数据。通过Burrows-WheelerAligner(BWA)软件(0.7.17版)以默认设置先将原始序列读数映射至GRCm38小鼠参考基因组，不包括线粒体基因组参考。另外，保存未映射的读数并通过BWA以默认设置与GRCm38线粒体基因组比对。SAMtools软件(1.6版)提供有关mtDNA覆盖率和所配对的映射读数的插入尺寸的统计信息。通过R stat包中的Kernel密度估计函数计算并绘制插入尺寸分布。

HSV-1感染和HSV-1-RFP生长曲线

使用编码与VP26的N-末端融合的mRFP1的HSV-1(克隆HSV F-GS 2822)。在Vero细胞和WT MEF中对病毒进行滴定。为确定斑块和感染的细胞形态，将EndoG

线粒体和重组VDAC1纯化、通道重构、记录和分析

如前所述，利用铁铝酸四钙石:羟基磷灰石CMC层析法从大鼠肝脏线粒体中纯化VDAC1蛋白(Ben-Hail和Shoshan-Barmatz(2014))。如前所述，将表达全长鼠mVDAC1和N-末端(1-26)截短的mVDAC1(ΔN-VDAC1)的载体克隆到pcDNA4/TO载体(Invitrogen)中(Abu-Hamad等人,2009)。使用Jet-Prim，用编码mVDAC1或ΔN-mVDAC1的pcDNA3.1质粒转染针对人hVDAC1表达而沉默的HEK-293细胞。转染后48h收获细胞，并如上对线粒体VDAC1进行蛋白质纯化(Ben-Hail和Shoshan-Barmatz(2014)。将线粒体纯化的VDAC1或重组WT或ΔN-VDAC1重构为平面脂双层(PLB)并在随后进行单通道和多通道电流记录和数据分析(Ben-Hail和Shoshan-Barmatz(2014))。简而言之，由溶解在正癸烷(30mg/ml)中的大豆磷脂(asolectin)制备PLB。将纯化的VDAC1添加至定义为含有1M NaCl，10mM Hepes，pH为7.4的顺式侧的室中。在使用Bilayer Clamp BC-535B放大器(Warner Instrument,Hamden,CT)的电压钳下，在顺式或反式隔室中添加37nM mtDNA(47bp)之前，和之后15分钟记录电流。关于膜的反式侧(地面)测量的电流在1kHz下进行低通过滤，并使用Digidata1440接口板和pClampex 10.2软件(Axon Instruments,Union City,CA)在线数字化。

mtDNA从用VDAC1重构的脂质体流出

使用购自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster,AL)的微型挤出机，通过挤出法制备脂质体。简而言之，通过溶解大豆磷脂(10mg/ml的氯仿)，然后在温和的氮气流下缓慢蒸发氯仿获得薄的脂质膜。然后，在室温下，在含有100nM的mtDNA(47bp)的缓冲液(10mMTricine,150mM NaCl,pH 7.4)中通过5次涡旋循环(1分钟间隔1分钟休息)使脂质膜水合30-60min。然后，将mtDNA添加至大的多层囊泡的悬浮液中，暴露于使用液氮进行的5次冻融循环，并通过含有聚碳酸酯过滤器(Whatman)的微型挤出机11次，得到装载mtDNA的脂质体。装载mtDNA的脂质体被平均分为两个整分试样，用于制备含有VDAC1和不含VDAC1的脂质体。通过在室温下将脂质体与VDAC1一起孵育20min，然后进行3次冻融循环和温和的超声处理，将纯化的VDAC1(30μg/ml)并入装载mtDNA的脂质体溶液中。通过使用VDAC1-柱洗脱缓冲液代替VDAC1，类似地制备不含VDAC1的脂质体。将样品以100,000g离心15min，并将沉淀重悬于缓冲液(10mM Tricine,150mM NaCl,pH 7.4)中。将脂质体稀释4倍并在40min后以100,000g离心15min，并使用qPCR，采用D-环3区域的mtDNA特异性引物对上清液整分试样进行mtDNA分析。

线粒体溶胀测定和Ca

在线粒体溶胀后分析PTP打开。简而言之，新鲜分离的线粒体(0.5mg/ml)在24℃下与指示浓度的VBIT-4一起孵育2min，用于Ca

VDAC1交联测定

纯化的VDAC1(16μg/ml)与60nM的mtDNA(120bp)在25℃下于20mM Tricine，pH 8.4中孵育15min，然后在30℃下与交联试剂EGS(100μM)一起孵育15min。使用抗VDAC1抗体对样品(0.1-1μg蛋白质)进行SDS-PAGE和免疫印迹法。使用FUSION-FX(Vilber Lourmat,France)对免疫反应性VDAC1二聚体、三聚体和多聚体条带进行定量分析。

mtDNA-肽结合测定

对应于小鼠VDAC1的1至26个氨基酸残基(SEQ ID NO:1)的C-末端生物素化肽和乙酰化(N-末端)和酰胺化(C-末端)的突变体肽(SEQ ID NO:72)由Genscript(Piscataway,NJ,USA)合成和纯化。利用PCR，使用D-环区域的mtDNA特异性引物扩增线粒体DNA。使用的引物如下(5’-3’)：mtDNA 120bp正向(SEQ ID NO:73)和反向(SEQ ID NO:74)。将纯化的mtDNA(120bp)与肽和链霉抗生物素蛋白Dynabeads(Invitrogen)在4℃下颠倒(end-over-end)旋转孵育18h。肽被链霉抗生物素蛋白Dynabeads捕获，并且未结合的肽和游离mtDNA通过用PBS充分洗涤而被去除。在60℃下用蛋白酶K处理样品30min，并用QIAquick核苷酸去除试剂盒(Qiagen)纯化上清液中的mtDNA。利用实时RT-PCR，使用D-环3引物定量纯化的mtDNA。

狼疮动物模型

所有实验均得到NIH/NHLBI的ACUC(动物护理和使用委员会)的批准。用作模型以确定系统性红斑狼疮(SLE)的病因的易患狼疮的雌性MRL/MpJ-Fas

尿液中的白蛋白:肌酐比

使用肌酐和白蛋白ELISA试剂盒(Exocell)测量新鲜尿液中的蛋白尿，并按照制造商的说明书使用小鼠白蛋白来测定蛋白尿:肌酐比。

狼疮血清中mtDNA和抗dsDNA抗体的定量

根据制造商的方案，使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)从500μl血清中分离循环mtDNA。简而言之，将血清样品与蛋白酶K和载体RNA在55℃下于裂解缓冲液中孵育30min，并通过施加真空压力将循环核酸结合至二氧化硅膜。在洗涤后，洗脱的样品用于实时RT-PCR。mtDNA D-环3区域的引物用于定量血清mtDNA。使用ELISA试剂盒(Alpha Diagnostic)以1:200的血清稀释液检测抗dsDNA抗体。

肾小球中的免疫复合物沉积

在用PBS灌注后从MRL/lpr小鼠收获肾脏。冷冻的肾脏切片在冷丙酮中固定20min，洗涤，并在4℃下用PBS中的4％BSA封闭18h。为检测肾小球沉积物，在室温下以1:100稀释度通过Hoechst染色(Life Technologies)，用FITC缀合的抗小鼠C3抗体(GC3-90F-Z,Immunology Consultants Laboratory)和Alexa Fluor 594缀合的抗小鼠IgG抗体(A-11020,Invitrogen)将切片染色1h。在用PBS洗涤后，封固组织，并使用LSM880激光共聚焦显微镜观察载玻片。在以盲法分析每只动物的随机图像后测定荧光强度得分。

GEO数据库分析

SLE(狼疮)患者样品的微阵列结果获自高通量基因表达数据库(GEO；NationalCenter for Biotechnology Information,Bethesda,ME,USA；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。原始数据获自GEO登录号GSE13887。

正常密度粒细胞和低密度粒细胞的分离

利用Ficoll-Paque梯度(GE Healthcare)，通过葡聚糖(Sigma-Aldrich)沉降，之后使用低渗NaCl裂解红细胞，从肝素化静脉血中分离正常密度粒细胞(NDG)。利用阴性选择法从PBMC层分离低密度粒细胞(LDG)。将细胞重悬于RPMI 1640培养基中以进一步表征。

NET的定量和可视化

通过在RPMI 1640培养基中将细胞与钙离子载体A23187(25μM)(Thermo Fisher)一起孵育2h，在NDG中诱导NET，并使用SYTOX荧光染料在485/520nm下对NET进行定量以定量胞外DNA。在485/520nm下测量t＝0min时PicoGreen(Life Technologies)的荧光(发射/消光)，以对总DNA定量。利用酶标仪(Synergy HTX；BIOTEK)定量荧光。也通过荧光显微术定量NET。简而言之，将细胞附着在盖玻片室上，在37℃下用钙离子载体刺激90min，在4℃下用4％多聚甲醛固定过夜，并用0.2％Triton X-100透化10min，之后0.5％明胶20min。在室温下用抗人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(ab21595,Abcam)的抗体对细胞染色2h，在PBS中洗涤，并在室温下用Hoechst 33342(Life Technologies)和Alexa Fluor 488二抗(A31570,LifeTechnologies)染色2h。封固后，用LSM780共聚焦显微镜对细胞可视化。

人类样品和研究批准

肝素化静脉外周血获自美国国立卫生研究院临床中心登记的SLE对象或健康对照。所有个体按照IRB批准的协议(NIH 94-AR-0066)签署知情同意书。SLE对象符合修订后的美国风湿病学会诊断标准(American College of Rheumatology diagnosticcriteria)(Hochberg,1997)。使用SLEDAI-2K标准(Hochberg(1997))确定疾病活动度(activity)。排除近期或活动性(active)感染的个体。

统计分析

利用GraphPad Prism7软件(GraphPad)，采用双尾非配对t检验和采用用于多重比较的图基事后检验的单因素方差分析进行组间统计比较。对于人类样品的统计分析，根据实验条件采用相似的患者数量确定样品大小。通过d'Agostino和Pearson omnibus正态性检验确定样品集的正态性分布。对于具有高斯分布的样品集，进行双尾t检验、配对t检验、或Pearson相关系数分析。对于具有非高斯分布的有限数量的样品集，在适用的情况下进行Mann-Whitney U检验。利用Bonferroni校正，对在多于一项的分析中与同一组进行的多重比较进行调整。所有值均表示为平均值±SEM，而差异在p<0.05时被认为具有统计学意义。

实施例1

核酸内切酶G缺陷增加胞质溶胶mtDNA和I型干扰素信号传导

由MEF中TFAM缺陷引起的适度线粒体应激显示增加I型干扰素信号传导。为确定这种现象是否是TFAM缺陷所特有的，在核酸内切酶G(EndoG)缺陷小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中测定I型干扰素信号传导。EndoG是糖非特异性核编码的线粒体核酸内切酶，其在细胞凋亡期间从线粒体释放并易位至细胞核以切割染色体DNA。其缺陷可以导致老年啮齿动物适度的心脏线粒体功能障碍和心脏肥大，以及无脊椎动物无法降解精子或父本mtDNA。为检验EndoG缺陷型MEF中适度的线粒体应激是否影响I型干扰素应答，对野生型(WT)和EndoG

由于mtDNA是cGAS激动剂之一，并且EndoG

实施例2

mtDNA释放需要VDAC

Bak和Bax是OMM蛋白，其可以形成大孔以促进线粒体突出(herniation)，并且细胞凋亡期间的mtDNA释放由Bak/Bax过表达诱导。然而，尚不清楚这两种蛋白是否是活细胞(包括那些具有适度线粒体应激的细胞)中mtDNA释放所必需的。测量WT和Bak/Bax

实施例3

VDAC1的N-末端在mtDNA释放中起作用

当VDAC1处于寡聚状态时，N-末端区域被认为易位离开VDAC1孔，从而所形成的孔显著大于单体的孔(图3F)。与主要是亲脂性的VDAC的β-桶状结构不同，进化上保守的N-末端区域是亲水性的(图5A)。因此，相信N-末端区域在寡聚孔周围形成亲水环(图3F)。推测mtDNA的带负电荷的骨架可能同时与多个VDAC1分子的N-末端区域中的亲水性残基相互作用，并充当使寡聚体稳定的支架(图3F)。为了评估这种可能性，在存在或不存在mtDNA的情况下，将VDAC1与蛋白质-蛋白质交联剂乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(ethyleneglycol bis(succinimidylsuccinate))(EGS)一起孵育。如图3G-图3H所示，mtDNA不增加VDAC1二聚体的形成，但显著增加三聚体和更高阶寡聚体的形成。N-末端区域含有3个带正电荷的氨基酸残基(K12、R15、K20)，其可以与mtDNA的带负电荷的骨架相互作用(图3I)。事实上，26个氨基酸的VDAC1 N-末端肽以剂量依赖性方式拉下(pulled-down)mtDNA片段，而非其中K12、R15、K20变为Ala(A)的VDAC1N-末端突变肽(图3J)。结构预测分析表明，这些突变不显著改变N-末端肽的整体结构(图5B)。然后测定VDAC1/3

实施例4

VDAC在mtDNA释放中具有Ca

VDAC功能与线粒体Ca

为确定PTP打开对于基础mtDNA释放是否重要，用CysA处理WT MEF和线粒体内膜基质两者，而结果表明CysA降低mtDNA释放(图6H-图6I)。因此，假定VDAC可能仅通过增加线粒体Ca

为进一步证实这一发现，使用与VDAC直接相互作用并特异性地抑制VDAC寡聚能力的高效力VDAC寡聚抑制剂VBIT-4。首先，评估VBIT-4对纯化的线粒体中Ca

为确定VDAC是否足以允许mtDNA穿过OMM，将mtDNA片段装载到含有或不含VDAC1的脂质体中。孵育后，然后通过实时RT-PCR测量从脂质体释放的mtDNA。如图2J所示，脂质体中VDAC1的存在显著增加mtDNA释放，但VBIT-4减少释放。因此，尽管VDAC可以通过充当Ca

由于完整的mtDNA在拟核复合物中受线粒体内膜(IMM)的束缚(tethered)并且通常是不可扩散的，因此怀疑游离的内mtDNA片段(fi-mtDNA)在穿过膜之前在正常条件下预先存在。高mtDNA释放的条件，如线粒体功能障碍(例如，EndoG

实施例5

线粒体DNA与VDAC相互作用

下一目标是确定VDAC是否也可以在mtDNA释放中通过直接相互作用而起作用。用于检测直接相互作用的一种方法是将纯化的线粒体VDAC1重构为平面脂双层(PLB)并在电压钳条件下测量DNA对通道电导的作用(图3A)。为此，利用了衍生自mtDNA的D-环区域的片段。暴露于高电压(60mV)但不暴露于低电压(10mV)后，线粒体DNA抑制VDAC1电导。已知这种电压依赖性是重要的，因为证据表明，高电压通过诱导N-末端区域易位离开VDAC孔而使其暴露，从而潜在地允许其与mtDNA相互作用。事实上，通过微量热泳(MST)测量的mtDNA-VDAC1相互作用，在预先未暴露于高电压的情况下进行，显示出没有相互作用，而VBIT-4确实显示出了相互作用。在预先暴露于60mV后，在±10mV和±40mV两者下的VDAC1电导被mtDNA抑制，而不管添加mtDNA的PLB侧是顺式(胞质侧，图3B)还是反式(膜间空间侧，图3C)，其中IC

实施例6

VBIT-4改善狼疮样疾病

利用高通量基因表达数据库(GEO)分析，发明人发现狼疮患者中VDAC1/3的mRNA表达升高，而EndoG和TFAM的mRNA表达降低。狼疮患者中VDAC2、HSP60、Bak和Bax的表达水平没有改变。这些发现与在EndoG和TFAM缺陷中VDAC促进1型IFN应答的观察结果相结合(图2C-图2D)，表明用VBIT-4抑制VDAC寡聚可影响狼疮的临床过程。为测试VBIT-4在狼疮中的作用，用VBIT-4处理MRL/lpr易患狼疮的小鼠5周。VBIT-4处理不导致任何死亡率或体重变化(图8D)。VBIT-4处理阻止了皮肤损伤的发展和伴随白细胞浸润的表皮增厚，并抑制了面部和背部的脱毛(图7A-图7B)。与溶媒处理的MRL/lpr小鼠相比(图7D-图7I)，VBIT-4处理还降低了脾和淋巴结的重量(图7C和图8E)，并显著减少了ISG诱导、肾免疫复合物沉积、血清抗dsDNA、蛋白尿和脱细胞mtDNA。

MRL/lpr小鼠中脱细胞mtDNA的一个潜在来源是嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)，其是加工后的染色质结构的网络，包括基因组和线粒体DNA。它们在被称为NETosis的细胞死亡过程中从嗜中性粒细胞释放，以缠结和杀死微生物，但也与自身免疫如狼疮有关联。由于线粒体ROS在由某些触发物如A23187 Ca

尽管本文已描述了本发明的某些特征，但是多种修改、替换、改变和等同方案现对于本领域普通技术人员都将是可以想到的。因此，应理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这种修改和改变。

序列表

<110> 国家生物技术研究所公司

美国卫生和公众服务部

<120> 用于治疗自身免疫疾病的VDAC抑制剂

<130> NIBN-P-028-PCT

<150> 62/771,211

<151> 2018-11-26

<160> 74

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Gly Tyr Gly Phe Gly Leu

20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (21)..(21)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<220>

<221> X

<222> (23)..(23)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<220>

<221> X

<222> (25)..(25)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<400> 2

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Xaa Tyr Xaa Phe Xaa

20 25

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (2)..(4)

<223> 其中X是任何氨基酸

<400> 3

Gly Xaa Xaa Xaa Gly

1 5

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (21)..(21)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<220>

<221> X

<222> (23)..(23)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<400> 4

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Xaa Tyr Xaa Phe

20

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (21)..(21)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<220>

<221> X

<222> (23)..(23)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<400> 5

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Xaa Tyr Xaa

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (21)..(21)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<400> 6

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Xaa Tyr

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> X

<222> (21)..(21)

<223> 其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸

<400> 7

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Xaa

20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys

20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys

20

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Gly Tyr Gly Phe

20

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Gly Tyr Gly

20

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Gly Tyr

20

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Lys Ser Ala Arg Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Lys Gly

20

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Met Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

His Ala Ile Tyr Pro Arg His

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

His Arg Pro Tyr Ile Ala His

1 5

<210> 17

<211> 1993

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

attagcgcag ggacctccgg gccacagctc agagaatcgg aaggcctcct cccccttccc 60

gagcgctgcc actggggccg aggtttccag caagaacccg cgtgtccctg cgcacgcaca 120

cacggtgcac acgtcagtcc ggcgcctccc cgtgccccga ctcacgcagg tcctcccgcg 180

cgcccgcaac acgcccgcag gctcctgtgt ctgctgccgg ggcagcgggg cccggaaggc 240

agaagatggc tgtgccaccc acgtatgccg atcttggcaa atctgccagg gatgtcttca 300

ccaagggcta tggatttggc ttaataaagc ttgatttgaa aacaaaatct gagaatggat 360

tggaatttac aagctcaggc tcagccaaca ctgagaccac caaagtgacg ggcagtctgg 420

aaaccaagta cagatggact gagtacggcc tgacgtttac agagaaatgg aataccgaca 480

atacactagg caccgagatt actgtggaag atcagcttgc acgtggactg aagctgacct 540

tcgattcatc cttctcacct aacactggga aaaaaaatgc taaaatcaag acagggtaca 600

agcgggagca cattaacctg ggctgcgaca tggatttcga cattgctggg ccttccatcc 660

ggggtgctct ggtgctaggt tacgagggct ggctggccgg ctaccagatg aattttgaga 720

ctgcaaaatc ccgagtgacc cagagcaact ttgcagttgg ctacaagact gatgaattcc 780

agcttcacac taatgtgaat gacgggacag agtttggcgg ctccatttac cagaaagtga 840

acaagaagtt ggagaccgct gtcaatcttg cctggacagc aggaaacagt aacacgcgct 900

tcggaatagc agccaagtat cagattgacc ctgacgcctg cttctcggct aaagtgaaca 960

actccagcct gataggttta ggatacactc agactctaaa gccaggtatt aaactgacac 1020

tgtcagctct tctggatggc aagaacgtca atgctggtgg ccacaagctt ggtctaggac 1080

tggaatttca agcataaatg aatactgtac aattgtttaa ttttaaacta ttttgcagca 1140

tagctacctt cagaatttag tgtatctttt aatgttgtat gtctgggatg caagtattgc 1200

taaatatgtt agccctccag gttaaagttg attcagcttt aagatgttac ccttccagag 1260

gtacagaaga aacctatttc caaaaaaggt cctttcagtg gtagactcgg ggagaacttg 1320

gtggcccctt tgagatgcca ggtttctttt ttatctagaa atggctgcaa gtggaagcgg 1380

ataatatgta ggcactttgt aaattcatat tgagtaaatg aatgaaattg tgatttcctg 1440

agaatcgaac cttggttccc taaccctaat tgatgagagg ctcgctgctt gatggtgtgt 1500

acaaactcac ctgaatggga cttttttaga cagatcttca tgacctgttc ccaccccagt 1560

tcatcatcat ctcttttaca ccaaaaggtc tgcagggtgt ggtaactgtt tcttttgtgc 1620

cattttgggg tggagaaggt ggatgtgatg aagccaataa ttcaggactt attccttctt 1680

gtgttgtgtt tttttttggc ccttgcacca gagtatgaaa tagcttccag gagctccagc 1740

tataagcttg gaagtgtctg tgtgattgta atcacatggt gacaacactc agaatctaaa 1800

ttggacttct gttgtattct caccactcaa tttgtttttt agcagtttaa tgggtacatt 1860

ttagagtctt ccattttgtt ggaattagat cctccccttc aaatgctgta attaacaaca 1920

cttaaaaaac ttgaataaaa tattgaaacc tcatccttct tctgttgtct ttattaataa 1980

aatataaata aac 1993

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

acacuaggca ccgagauua 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gggcuaugga uuuggcuua 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

gcuuggucua ggacuggaa 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

aagcugaccu ucgauucau 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

gaaugacggg acagaguuu 19

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

ucggaauagc agccaagua 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

cucuucugga uggcaagaa 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

gaauagcagc caaguaucag 20

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

uaagccaaau ccauagccc 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

uuccaguccu agaccaagc 19

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

ugauacuugg cugcuauuc 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (5)..(5)

<223> um

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (8)..(8)

<223> gm

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (13)..(13)

<223> gm

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (17)..(17)

<223> um

<400> 29

acacuaggca ccgagauua 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (6)..(6)

<223> um

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (16)..(16)

<223> gm

<400> 30

uaaucucggu gccuagugu 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

uaaucucggu gccuagugu 19

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (4)..(4)

<223> um或尿嘧啶

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (14)..(14)

<223> gm

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (17)..(17)

<223> um或尿嘧啶

<400> 32

gaauagcagc caaguaucag tt 22

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (7)..(7)

<223> um

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (13)..(13)

<223> gm

<400> 33

ugauacuugg cugcuauuct t 21

<210> 34

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

gccgatcttg gcgcgtccgc cgcggatgtc ttcaccgcgg gctacggctt tg 52

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

caaagccgta gcccgcggtg aagacatccg cggcggacgc gccaagatcg gc 52

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

accagaatgc ctggaacaac 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

atcagcacct tgaagaagtg t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

ccaagtgctg ccgtcatttt c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

ggctcgcagg gatgatttca a 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

gacttcaaca gcaactccca c 21

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

ctgattacaa aagaagacat gacagac 27

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

aggcaaaacc aaagactcca 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

caaggcaggt ttctgaggag 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

gacctggtca ccatcagcat 20

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

ttcccagcag cacagaaac 19

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

aaattccagg tgaaatggca 20

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

ctttcctcat gatcctggta atgat 25

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

aatccaaaat ccttcctgtc cttc 24

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

ccctatggag atgacggaga 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 51

cccagtgctg gagaaattgt 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 52

ctatgacttc cccgtcctga 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 53

tcagaaattg ccgcttcttt 20

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 54

ctagagctag agcctgcag 19

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 55

agttagtcac ggacaccag 19

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 56

ggatgcctgg gagagaatcg 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 57

tcgcctgctc ttcgaaactg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 58

acacagccaa gacatccttc 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 59

caagtattca cccctgtcct g 21

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

gagaggacca tgaagagga 19

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

taaaccaacc agaccatgag 20

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

actaatgtga atgacgggac a 21

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

gcattgacgt tcttgccat 19

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 64

aatctaccat cctccgtgaa acc 23

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 65

tcagtttagc tacccccaag tttaa 25

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 66

cccttcccca tttggtct 18

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 67

tggtttcacg gaggatgg 18

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 68

tcctccgtga aaccaacaa 19

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 69

agcgagaaga ggggcatt 18

<210> 70

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 70

ccccacaaac cccattacta aaccca 26

<210> 71

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 71

tttcatcatg cggagatgtt ggatgg 26

<210> 72

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 72

Met Ala Val Pro Pro Thr Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ala Asp

1 5 10 15

Val Phe Thr Ala Gly Tyr Gly Phe Gly Leu

20 25

<210> 73

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 73

tcctccgtga aaccaacaac ccgcccacca atgcccctct tctcgctccg ggcccattaa 60

acttgggggt agctaaactg aaactttatc agacatctgg ttcttacttc agggccatca 120

<210> 74

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 74

tgatggccct gaagtaagaa ccagatgtct gataaagttt cagtttagct acccccaagt 60

ttaatgggcc cggagcgaga agaggggcat tggtgggcgg gttgttggtt tcacggagga 120