一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法

摘要

一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法，属于籽用型麻类育种技术领域。所述方法利用钴(Co)‑60γ射线，选择籽粒饱满的种子，设置不同辐照剂量进行处理。在利用隔离装置自然条件下及温室进行种植筛选，成熟后收获M1代种子，根据萌发率、突变表型对后代进行选择，并结合分子标记方法对M1和M2代材料进行辅助选择。本发明方法的建立利于短周期内锁定获得大麻酚含量符合标准的变异株，提高突变体库构建效率，有效加快工业大麻育种进程，同时构建工业大麻突变体库对开展基因功能研究具有重要意义。具有高效、变异率高、缩短构建周期等优势，该方法可有效应用于工业大麻突变群体构建、分子生物学以及育种后代筛选鉴定等系列研究。

说明书

技术领域

本发明属于麻类育种技术领域，具体涉及一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法。

背景技术

工业大麻在我国也称为汉麻，欧盟将四氢大麻酚含量低于0.3％的无毒品利用价值的大麻品种称为工业大麻。工业大麻是一种附加值极高的经济作物，几个世纪以来，一直被纺织、造纸、医药等领域不同程度的应用。特别近年随着产业结构的调整升级，其纤维和杆屑等原料在建筑和新材料、有效成分在医药保健化妆品、籽实在特需食品保健品等各方面的开发应用势头更为突出。

目前我国工业大麻品种约有50余种，其中90％以上采用常规杂交方法。在各种育种方法中，杂交育种是依据基因重组原理，通过配置杂交组合和选择目标性状筛选后代材料，但对亲本范围要求高、育种周期长、效率低、工作量大、杂交后分离广泛。诱变育种主要是根据基因突变原理获得目标变异材料，虽然较杂交育种具有不定向性，但其突变率高，可在较短时间内获得更高的变异几率，可以有效缩短育种进程。目前诱变育种包含物理诱变和化学诱变，应用于作物育种已有悠久的历史，且随着分子生物学技术的发展，诱变技术已经与分子标记技术结合应用于作物新品种选育，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在或变异率，达到选择目标性状或检测变异的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。当前工业大麻育种研究无论从品种性状选择及选育技术均需不断创新，同时也急需围绕关键性状开展功能基因组学等研究，但目前国内工业大麻突变体库的创建研究基本没有开展，而构建突变体库是功能基因组学的基础，可以进一步通过突变体分析鉴定基因功能。

发明内容

本发明的目的是为了解决国内工业大麻突变体库的空白问题，提供一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法，该方法利用钴(Co)-60γ射线，选择籽粒饱满的种子，设置不同辐照剂量进行处理。在利用隔离装置自然条件下及温室进行种植筛选，成熟后收获M1代种子，根据萌发率、成苗率、突变表型对后代进行选择，并结合分子标记方法对M1和M2代材料进行辅助选择。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法，所述方法具体为：

步骤一：种子选择：选取大小均匀、完整饱满、无病虫侵害、发育成熟的工业大麻种子≥1000粒；

步骤二：诱变处理：利用Co-60γ射线对工业大麻种子进行处理，处理剂量为50～200Gy，剂量率为0.1Gy/min，同时设置对照组，诱变后的种子在处理后3天内根据处理浓度进行萌发及分组播种试验；

步骤三：种植及筛选处理：在田间自然条件下套袋或温室内利用育种架隔离种植并直至收获M1代种子；

步骤四、突变体材料筛选：

(1)根据萌发第7天的萌发情况和出苗情况初步筛选适宜诱变处理剂量；

(2)在苗期阶段开始直至种子成熟期，以0Gy为对照，根据材料突变情况统计突变表型情况；

(3)自苗期至盛花期取植株最顶端叶片或花序利用快速检测技术进行THC及THCA含量单株定性半定量检测，拔除THC+THCA≥0.3％的单株材料，剩余材料用于进一步筛选；

(4)盛花期阶段取植株顶端花叶部分进一步利用高效液相色谱技术定性定量分析THC、THCA、CBD、CBDA、CBG、CBN含量，其中THC+THCA≤0.3％为标准进行筛选，符合标准的材料保留，不符合标准的材料剔除；

步骤五、突变体材料鉴定：

(1)取不同处理剂量下M1代获得的单株收获种子，种植后取芽期胚根或幼苗期叶片材料，液氮速冻获得RAPD分子标记样品材料；

(2)对筛选后的M1代植株进行分子鉴定，根据M1代分子鉴定结果，结合突变表型突变情况，从材料中获得并构建M1代突变群体；

(3)对M1代突变群体单株收获种子后，分别种植成株行，构建M2代群体，种植的M1和M2代群体均经THC+THCA含量取材及检测，取材及检测同步骤四中的3和4；

(4)M2代群体在苗期进行THC+THCA含量测定后，按照株行随机选取单株叶片进行RAPD分子标记取材及鉴定，单株取样量不低于群体数量的10％；

(5)M2代材料进行农艺性状表型鉴定分析，结合分子鉴定结果，筛选构建M2代突变体库。

进一步地，步骤四(1)中，所述初步筛选的标准为：萌发率≥50％，死苗率≤30％、保苗率≥70％。

进一步地，步骤四(2)中，所述苗期阶段指的是3～5对真叶时期。

进一步地，步骤五(2)中，首先是根据诱变后表型的变化，初步从M1代筛选获得表型发生变异的材料，同时进行THC+THCA含量测定，从中再获得表型和含量均符合标准的M1代变异材料，最后利用分子标记方法，对表型和含量均符合标准的M1代所有材料进行分子水平检测，获得M1代真正变异材料。

本发明相对于现有技术的有益效果为：该方法的建立利于短周期内锁定获得大麻酚含量符合标准的变异株，提高突变体库构建效率，有效加快工业大麻育种进程，同时构建工业大麻突变体库对开展基因功能研究具有重要意义。具有高效、变异率高、缩短构建周期等优势，该方法可有效应用于工业大麻突变群体构建、分子生物学以及育种后代筛选鉴定等系列研究。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

一种通过诱变及分子标记技术构建汉麻突变体库的方法，所述方法具体为：

步骤一：种子选择：选取大小均匀、完整饱满、无病虫侵害、发育成熟的工业大麻种子≥1000粒；选取的大麻种子数量足够，可保证足够的突变体供选择；

步骤二：诱变处理：利用Co-60γ射线对工业大麻种子进行处理，根据萌发、变异及致死情况共设置5个剂量，分别为50、100、150、200、250Gy，剂量率为0.1Gy/min，同时设置对照组，诱变后的种子在处理后3天内根据处理浓度进行萌发及分组播种试验，可防止诱变效果衰退；以上的处理剂量中，250Gy属于全部致死剂量，该剂量不萌发和出苗，其它剂量设定为便于比较，均匀取点；

步骤三：种植及筛选处理：在田间自然条件下套袋或温室内利用育种架隔离种植并直至收获M1代种子；

步骤四、突变体材料筛选：

1、根据萌发情况(萌发第7天)的萌发率≥50％、出苗情况(死苗率≤30％、保苗率≥70％)初步筛选适宜诱变处理剂量；

2、在苗期(3-5对真叶)阶段开始直至种子成熟期，以0Gy为对照，根据材料突变情况统计突变表型情况(具体内容见表一)；

3、自苗期至盛花期取植株最顶端叶片或花序利用快速检测技术进行THC(四氢大麻酚)及THCA(四氢大麻酚酸)含量单株定性半定量检测，拔除THC+THCA≥0.3％的单株材料，剩余材料用于进一步筛选；

4、盛花期阶段取植株顶端花叶部分进一步利用高效液相色谱技术定性定量分析THC、THCA、CBD(大麻二酚)、CBDA(大麻二酚酸)、CBG(大麻萜酚)、CBN(大麻酚)含量，其中THC(％)+THCA(％)≤0.3％为标准进行筛选，符合标准的材料保留，不符合标准的材料剔除；

步骤五、突变体材料鉴定：

1、取不同处理剂量下M1代获得的单株收获种子，种植后取芽期胚根或幼苗期叶片材料，液氮速冻获得RAPD分子标记样品材料；

2、对筛选后的M1代植株进行分子鉴定，根据M1代分子鉴定结果，结合突变表型突变情况，从材料中获得并构建M1代突变群体(引物见表二)；该步骤首先是根据诱变后表型的变化，具体表型参考表一，初步从M1代筛选获得表型发生变异的材料，同时进行THC+THCA含量测定，从中再获得表型+含量符合标准的M1代变异材料。最后利用分子标记方法，对表型+含量符合标准的M1代所有材料进行分子水平检测，最后获得M1代真正变异材料；

3、对M1代突变群体单株收获种子后，分别种植成株行，构建M2代群体，种植的M1和M2代群体均经THC+THCA含量取材及检测，取材及检测同步骤四中的3和4；

4、M2代群体在苗期进行THC+THCA含量测定后，按照株行随机选取单株叶片进行RAPD分子标记取材及鉴定(引物同表二)，单株取样量不低于群体数量的10％；

5、M2代材料进行农艺性状表型鉴定分析，结合分子鉴定结果，筛选构建M2代突变体库。