猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗及其制备方法

摘要

一种猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗，其包括以猪瘟病毒E2蛋白和猪流行性腹泻病毒S1蛋白为基础的融合蛋白E2‑S1，编码该E2‑S1蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。以纯化的E2‑S1蛋白为免疫抗原制备的E2‑S1亚单位联合疫苗，能够同时保护免疫猪群抵抗CSFV和PEDV感染，为CSFV和PEDV的净化提供有效的技术保障，同时该疫苗具有一针多免及减少猪群免疫应激反应的作用，有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于兽用疫苗和兽用生物制品领域，主要涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种同时防控猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的新型亚单位联合疫苗，同时涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种以发热拉稀、肠道发炎为主要症状的急性接触性传染疾病，具有高度传染性和致死性。目前流行地区或国家仍然采用接种弱毒疫苗的方法作为预防猪瘟的主要手段，猪瘟弱毒疫苗免疫的猪群无法与自然感染的猪瘟野毒从免疫学上区分开来，该疫苗无法用于猪场的猪瘟净化，无法用于我国猪瘟根除计划，新型标记疫苗研究迫切需要。猪瘟病毒(CSFV)的囊膜糖蛋白E2，被认为是最具开发成CSFV亚单位疫苗的结构蛋白，该蛋白参与病毒的感染过程，CSFV表面的单抗决定表位决定簇主要是位于E2(690aa-866aa)的A、B、C、D四个结构域中，这四个抗原区，能够诱导机体产生保护性中和抗体，保护机体对抗CSFV的野毒感染，所以E2糖蛋白是CSFV亚单位疫苗开发的首选蛋白。

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻(PEDV)引起的以高接触、仔猪高死亡率的重要传染性疾病，该病的主要特征是感染侵袭新生仔猪消化系统，死亡率可达70％以上，自2013年首次爆发以后，对整个全球的养猪业造成巨大经济损失。目前，猪流行性腹泻(PEDV)的Spike蛋白(纤突蛋白)作为PEDV亚单位疫苗的靶标抗原已经被广泛研究。研究已经证实，Spike蛋白为糖基化蛋白，分为S1和S2结构域，其中S1区域分布丰富的中和抗体表位是PEDV亚单位疫苗开发的理想目标蛋白。

目前，对于上述两个疾病的防控主要是以疫苗的免疫接种为主，防控猪瘟国内主要是以传统的C株活疫苗，防控猪流行性腹泻主要是以传统的减毒活疫苗和灭活疫苗。传统的C株CSFV活疫苗，尽管效果稳定，但已不能满足中国的猪瘟根除净化计划的需求。目前国内商品化的PEDV活疫苗和灭活苗，主要以CV777等毒株进行制备，临床反映仍存在免疫保护效果不好以及散毒、毒株重组突变的风险。

基因工程亚单位疫苗具有安全、有效、便于操作的优点，被认为是最具有应用前景的疫苗类型，开发针出对CSFV和PEDV的亚单位疫苗能更好用于CSFV和PEDV的免疫防控和净化，具有重大意义。国内，对母猪分别进行CSFV和PEDV的多次免疫，提高种猪群CSFV和PEDV抗体水平以及仔猪的CSFV和PEDV的母源抗体，已经成为抵抗猪群感染CSFV和PEDV的主要免疫防控措施之一。目前市面上，已经有单独E2的杆状病毒表达的亚单位疫苗(新疆天康、武汉科前)用于防控CSFV，使用酵母和杆状病毒表达的E2亚单位疫苗研究工作已经开展很多，研究也较为深入。其次针对于PEDV的S1蛋白(Spike蛋白的S1部分)作为亚单位疫苗研究在国内外已经有所进展。但目前国内仍无针对PEDV的商品化亚单位疫苗，也无针对同时防控CSFV和PEDV的亚单位形式联合疫苗。

发明内容

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗及其制备方法。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是，一种猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗，其包括猪瘟病毒E2蛋白和猪流行性腹泻病毒S1蛋白的融合蛋白，该融合蛋白为E2-S1蛋白，编码该E2-S1蛋白的E2-S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述提及的E2-S1基因是分别以猪瘟病毒E2蛋白基因序列、猪流行性腹泻病毒S1蛋白基因序列作为N端序列和C端序列，中间添加GGGGSGGGGS序列linker，进行重叠延伸PCR扩增得到。PCR扩增时，猪瘟病毒E2蛋白基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，猪流行性腹泻病毒S1蛋白基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

上述疫苗还包括免疫佐剂，融合蛋白与免疫佐剂的体积比为1：1。

本发明同时提供一种猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗的制备方法，该方法步骤如下：

A.分别以猪瘟病毒E2蛋白基因序列、猪流行性腹泻病毒S1蛋白基因序列作为N端序列和C端序列，中间添加GGGGSGGGGS序列linker，进行重叠延伸PCR扩增出E2-S1基因，该E2-S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

B.将E2-S1基因克隆至载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建重组表达载体pKS001-E2-S1；

C.将重组表达载体pKS001-E2-S1转化表达细胞，构建稳定细胞株，表达获得重组融合蛋白E2-S1。

上述方法还包括步骤D：将重组融合蛋白E2-S1与免疫佐剂按体积比1：1混合，制得疫苗。

较佳的，上述步骤C中的表达菌株为哺乳动物细胞株CHO-K1Q。

较佳的，上述提及的免疫佐剂为ISA201VG佐剂。

本发明以CSFV的E2蛋白和PEDV的S1蛋白为基础，使用哺乳动物表达细胞CHO表达出E2和S1的融合蛋白E2-S1，免疫及保护实验结果显示，以纯化的E2-S1蛋白为免疫抗原制备的E2-S1亚单位联合疫苗，不但能够同时保护免疫猪群抵抗CSFV和PEDV的感染，同时具有一针多免及减少猪群应激反应的作用，为CSFV和PEDV的净化提供有效的技术保障。

本发明的有益效果如下：

1.借助真核表达系统，以融合表达的形式表达出E2-S1蛋白(一个E2-S1蛋白分子内包含保护性抗原E2和S1)，属于首次发明。

2.动物免疫及攻毒保护实验说明，配制的E2-S1亚单位联合疫苗能同时防控猪瘟和猪流行性腹泻，该联合疫苗目前尚未有人研制，属首次发明。

3.本E2-S1亚单位联合疫苗疫苗能同时防控猪瘟(CSF)和猪流行性腹泻(PED)，具有免疫一针而防控两种疾病，减少猪群应激，减少现阶段下猪场内人员与猪的过度接触而导致的生物安全压力的作用。

附图说明

图1是本发明重组表达载体pKS001-E2-S1的构建示意图。

图2是本发明重组蛋白E2-S1基因片段的PCR扩增电泳图，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2，3，4:重组蛋白E2-S1。

图3是本发明E2-S1基因克隆转化子鉴定电泳图，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2，3，4:pKS001-E2-S1转化子。

图4是本发明的稳定细胞株表达上清中E2-S1蛋白的western blot鉴定图。

其中，M:彩虹180蛋白mark；泳道1，2:CHO-K1Q-E2-S1细胞株(5H8单克隆细胞株)表达上清；泳道3:正常CHO-K1Q细胞的表达上清。

图5是本发明CHO-K1Q-E2-S1细胞株(5H8单克隆细胞株)表达上清纯化后的电泳图。

其中，M:彩虹180蛋白mark；泳道1，2:5H8细胞株表达上清纯化的E2-S1蛋白。

图6是本发明检测E2-S1亚单位疫苗免疫兔子后的E2抗体水平图。

图7是本发明使用C株进行攻毒后兔子发热情况图。

图8是本发明检测E2-S1亚单位疫苗免疫猪后的S1抗体水平图。

图9是本发明E2-S1亚单位疫苗免疫后的仔猪PEDV攻毒存活率图。

具体实施方式

实施例1表达载体构建及蛋白制备

根据CSFVHCLV株(GenBank accession:AF531433.1)的E2蛋白及PEDV的毒株(GenBank accession:JQ517274.1)的S1蛋白基因序列，由南京金斯瑞生物公司进行密码子优化及基因合成。

设计PCR扩增引物，分别以E2、S1作为N端序列和C端序列，中间添加GGGGSGGGGS序列linker，扩增出E2-S1重组基因，通过基因克隆将E2-S1基因克隆至哺乳动物细胞表达载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建出重组表达载体pKS001-E2-S1，具体构建示意图见图1，提取无内毒素的重组表达载体pKS001-E2-S1，借助电穿孔转染设备，将pKS001-E2-S1质粒转染至哺乳动物细胞CHO-K1Q(

1.重组表达载体pKS001-E2-S1的构建

1.1PCR扩增

以合成的E2、S1基因为模板，以设计的引物E2-N-FP/E2-C-RP和S1-N-FP/S1-C-RP为扩增引物，进行重叠延伸PCR扩增，扩增引物序列见表1，扩增的基因片段长度为3429bp，结果见图2，使用Omega的DNA清洁回收试剂盒回收PCR扩增片段。

表1E2-S1基因的PCR扩增引物

1.2重组质粒的克隆转化

1)复苏培养转化有pKS001质粒的DH5α重组克隆菌，使用LB培养基培养100mL菌液，37℃180rpm条件下，培养12h后使用质粒提取试剂盒提取pKS001。

2)使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对提取的pKS001质粒和回收后的E2-S1基因分别进行酶切，37℃酶切3h，酶切体系见下表2，使用Omega的DNA清洁回收试剂盒，清洁回收酶切后的pKS001载体片段和E2-S1基因片段。

表2pKS001载体的酶切体系

3)使用DNA T4连接酶进行载体和片段的连接，配制E2-S1基因片段与载体pKS001的连接体系具体如表3所示，将配制好的连接体系直接放置22℃孵育30min。

表3E2-S1基因片段与载体pKS001的连接体系

4)取E2-S1基因与pKS001载体的连接产物10μL，轻轻加入放置在冰盒上的100μLTOP10感受态中，轻轻吹打混匀，将该混合物置于冰上30min，42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3-5min。

5)加入500μL不含抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h。

6)将菌液5000rpm离心1min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50-100μL的培养液，重悬菌体，然后全部均匀涂布到含氨苄抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。1.3阳性转化子的PCR鉴定及测序

挑取pKS001-E2-S1转化平板上的克隆菌落作为模板，以E2-N-FP/S1-N-FP为鉴定引物，进行PCR扩增。将以上pKS001-E2-S1重组克隆菌PCR鉴定扩增产物进行核酸电泳，分析条带大小，具体如图3所示，条带大小与预期相符合，初步鉴定pKS001-E2-S1克隆菌被成功克隆。

1.4重组质粒的抽提

1)使用LB培养基，接种pKS001-E2-S1重组克隆菌200ml，培养37℃，180rpm，培养12h后，5000rpm离心5min，收集细菌，使用北京天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)进行质粒的抽提。

2)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3)取200ml过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(已加入RNase A)，涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

4)向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。

5)向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。

6)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)。

7)室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW(已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9)重复操作步骤8。

10)向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。

11)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

12)将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。

1.5对构建质粒进行基因测序

使用NdeI对抽提的重组质粒进行单酶切，使用切胶回收试剂盒，并切胶回收较小的片段作为PCR扩增模板。以pKS001-fp:5'-AGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT-3'(SEQ ID NO.6)和pKS001-rp:5'-GCCGCCAGACATGATAAGATACATTG-3'(SEQ ID NO.7)为测序引物，将回收的基因片段，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序报告结果显示，所构建的E2-S1基因正确无误，克隆成功。

2.重组蛋白E2-S1表达鉴定及稳定细胞株的构建

材料及设备：CHO-K1Q细胞，MSX(24mM)，

2.1细胞复苏及传代

使用预热的CD04培养基(添加4mM的谷胺酰胺)复苏1支CHO-K1Q细胞，细胞复苏至125ml细胞摇瓶，培养体积为25ml，50mm振幅CO

2.2细胞转染

1)选择对数生长期CHO-K1Q细胞，密度达到2～3×10

2)使用新鲜的CD04培养基(添加4mM的谷胺酰胺)重悬CHO-K1Q细胞，调整细胞密度为5×10

3)取50μg DNA的pKS001-E2-S1质粒到4mm电转杯中，然后加入800μL密度为5×10

4)使用4mm电转杯，按照表4的电转仪参数进行电转实验。

表4电转仪参数

5)电转后静置5min，然后将细胞转移至T25细胞培养瓶之中，并添加5ml的CD04培养基(添加4mM的谷胺酰胺)，轻轻吹打混匀，置入恒温箱中培养。

2.3初步MSX加压及筛选

1)静置培养以上转染细胞24h后，将T25细胞培养瓶之中的细胞转移至50ml离心管，180g/min，5min离心收集细胞，弃掉上清，使用CD04培养基(含有25μM，MSX)重选细胞，按照1～2×10

2)待细胞长至每孔的四分之一(1/4)时，使用ELISA方法检测表达量，挑选适量高表达孔的细胞，转移富集到新的96孔板上继续培养。

3)挑选高表达细胞池，进行放大培养(从24孔板至摇瓶逐步放大)。通过比较细胞生长，表达水平，倍增时间，情况筛选得到最优细胞池。

2.4单克隆挑选及增殖

1)使用CD04培养基(含有25μM，MSX)按照4.2.1的方法对筛选的最优表达细胞池进行传代和培养，培养细胞池密度至2～3×10

2)将适量的细胞培养物置于24孔板中，使用CD04培养基，将细胞密度进行倍比稀释至200cells/ml。

3)再使用QuaMono

4)使用96孔板高通量扫描显微镜，对所有的克隆孔进行扫描拍照，筛选单克隆孔并进行标记。

5)置入恒温培养箱静置培养，第0天、1天、2天、3天、7天对单克隆细胞孔，进行扫描观察，拍照记录细胞生长情况。

6)第7天时，按照100μL/孔标准，添加CHO cloning Medium C(2周后，单克隆细胞的汇合度可以达到1/2-1/3)

7)铺板后15天，待细胞长至每孔的四分之一(1/4)时，挑选细胞生长状态良好、生长旺盛的细胞孔，转移到新的96孔板。

8)3天后，使用ELISA方法检测表达上清，根据检测结果，挑选适量高表达的细胞池，进行悬浮培养放大，冻存后作为构建的稳转细胞种子，其中单克隆5H8株、4C6株、8E3株、6G2株具有很高的表达水平，且5H8株的表达量最高。

3.稳定细胞株Fed-batch发酵表达

1)使用125ml的细胞摇瓶，接种构建的CHO-K1Q稳转细胞株5H8，逐渐放大至500ml的摇瓶中进行培养，培养基选择CD04培养基。

2)使用

3)第0天开始取样，绘制细胞生长曲线，第3天开始留样，进行后续统一产量检测，第14天时，待细胞活率低于60％时收获表达产物。

4.表达上清中E2-S1蛋白的Western-boling鉴定

1)细胞株5H8悬浮发酵第4天，收集了1mL上清液，同时以正常培养的CHO-K1Q细胞培养上清CD04培养基液作为对照。

2)取上清样品，各加入20μL的loadingbuffer和60μL的转染上清，煮沸5min，在提前制备12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶内上样，彩虹蛋白mark加入5μL，转染上清样品每孔加入10μL，120v电泳80min。

3)将Millipore PVDF(0.45μm)膜进行用甲醇浸泡1min预处理，后放置到转膜液浸泡2min。按照电压600v，电流300mA，时间90min的条件转膜，进行低温情况下转膜。用含有1％明胶和1.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)作为封闭液，在37℃摇床上封闭150min，转速80rpm，然后在4℃静止封闭过夜。

4)使用封闭液稀释His-tag单克隆抗体至终浓度0.2μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释好的一抗中，在37℃摇床上孵育2h，转速80rpm。

5)使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在侧摆摇床上洗涤PVDF膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。

6)封闭液稀释羊抗鼠IgG H&L(HRP)二抗，至工作浓度为0.05～0.2μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释好的二抗中，37℃摇床上缓慢摇动孵育1h，转速为80rpm。

7)使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在侧摆摇床上洗涤PVDF膜，洗涤3次，转速60rpm，每次洗涤10min。

8)打开Bio-rad化学发光分析系统，配制ECL溶液(Millipore)并将曝光液均匀滴加在PVDF膜上，然后再化学发光系统中曝光观察，使用成像系统(Bio-Rad)收集信号，并使用Image Lab软件4.0.1分析结果。具体的Western-boling结果见图4，结果显示能够纯化获得纯度较高的E2-S1蛋白，与预期的177kda大小完全相符合。

5.表达上清中E2-S1蛋白的纯化

用4℃低温高速离心机8000rpm离5min，收集细胞株5H8的培养上清，弃掉沉淀中的细胞，再次12000rpm 4℃离心10min后收集上清。将以上收集的上清培养物通过0.45μm的滤膜过滤以后，分别使用5mL的TED-6FF-Ni纯化预装柱上样纯化，流速选择5mL/min上样完毕后，使用Tris缓冲液(pH8.0,50mM Tris-HCl，0.2M Nacl)进行洗涤，每个样品按照3mL/min流速，洗涤10min，待基线拉平以后，使用200mM咪唑溶液(pH8.0,50mM Tris-HCl，0.3MNacl，200mM Imidazole)进行梯度洗脱，待OD280曲线出峰以后，按照1mL/管的标准收集纯化样品。将纯化洗脱样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白E2-S1纯化结果，电泳结果显示能够纯化获得纯度较高的E2-S1蛋白，与预期的177kda大小完全相符合，结合参见图5。

实施例2疫苗制备

将纯化的E2-S1蛋白使用0.22μm滤膜进行除菌过滤，使用无菌PBS缓冲液稀释至600μg/ml的浓度，取等体积的ISA201VG佐剂放置30℃水浴锅中预热15min。使用搅拌子磁力搅拌佐剂相，不断边搅拌边滴加抗原相，最终以1:1比例混合搅拌均匀，即得E2-S1亚单位疫苗(300μg/ml)。将最终制备的E2-S1亚单位疫苗(300μg/ml)进行分装，于4℃冷藏备用。

实施例3疫苗免疫实验

1.E2-S1亚单位疫苗的CSFV免疫保护实验

将购买的8只均重为2kg的新西兰雌性兔子，随机分为2组。一组兔子进行后腿肌肉注射1ml的E2-S1亚单位疫苗，另一组兔子进行后腿肌肉注射1ml的PBS作为免疫对照组。每间隔3周进行一次免疫，免疫2次，每间隔7天进行对兔子进行耳缘静脉采血，离心收集血清。使用美国IDEXX的猪瘟抗体检测试剂盒检测猪瘟E2抗体阻断率，结果对照组兔子的E2抗体为阴性，E2-S1亚单位疫苗免疫组的E2抗体阻断逐渐上升，结合参见图6，说明本E2-S1亚单位疫苗能产较高水平的E2抗体。

第一次免疫后42天，对所有免疫组兔子耳缘静脉注射100RID50的C株CSFV商品化疫苗，攻毒前和攻毒后每天两次对兔的体温进行直肠监测，从攻毒后每12小时测量一次体温，体温升高1℃持续至少18h被视为典型发热，判定为不能抵抗CSFV病毒攻击，统计E2-S1和PBS两个免疫组兔子的发热情况，评估E2-S1免疫保护效果。攻毒结果显示，E2-S1组免疫的4只兔子体温均不出现典型发热，全部保护，而PBS组的4只兔子体温均出现典型发热，说明本发明制备的E2-S1亚单位疫苗能够提供完全的CSFV保护效果，结果参见图7。

2.E2-S1疫苗的PEDV免疫保护实验

选择PEDV抗原抗体均为阴性的怀孕母猪，一头按照1ml剂量E2-S1亚单位疫苗进行肌肉注射，一头同期免疫1ml体积的PBS作为对照，间隔21天免疫一次。免疫后对母猪进行跟踪采血，采血后收集血清使用西班牙Ingenasa试剂盒检测E2-S1亚单位疫苗免疫后S1抗体水平，请结合参见图8，结果显示对照组的S1抗体一直为阴性，而E2-S1组免疫血清中S1抗体水平逐渐上升，说明E2-S1亚单位疫苗具有较好的免疫原性。

待两头母猪产仔后，充分让仔猪吃够初乳，从每头母猪所产仔猪中分别选择5头四日龄的仔猪，再随机分为二组：E2-S1组和PBS组。使用实验室保存分离的PEDV病毒(GenBankaccession:JQ517274.1)，按照500TCID50，1ml/头的攻毒剂量，对所有仔猪进行攻毒。攻毒后10天内，统计两组仔猪的死亡率，评估E2-S1亚单位疫苗的免疫保护效果，结合参见图9，结果显示PBS组的5头仔猪全部死亡，E2-S1组的5头仔猪全部存活，说明本发明制备的E2-S1亚单位疫苗免疫母猪后，可对其所产仔猪产生100％的保护，故E2-S1亚单位疫苗具有很好的PEDV免疫保护效果，具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 湖南兀邦生物科技有限公司

湖南农业大学

<120> 猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒亚单位联合疫苗及其制备方法

<130> 0002

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3408

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 1

atggtgctga gaggccagat cgtgcagggc gtggtgtggc tgctgctggt gaccggcgcc 60

cagggcagac tggcctgcaa ggaggactac agatacgcca tcagcagcac cgacgagatc 120

ggcctgctgg gcgccggcgg cctgaccacc acctggaagg agtacaacca cgacctgcag 180

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cactctgtgg tgggcatcac atgggacaac gatagggtga ccgtgttcag cgacaagatc 1560

tactatttct actttaagaa cgattggtcc cgcgtggcca ccaagtgcta taattctggc 1620

ggctgtgcca tgcagtacgt gtatgagccc acatactata tgctgaatgt gacctctgcc 1680

ggcgaggacg gcatcagcta ccagccttgc acagccaatt gcatcggcta tgccgccaac 1740

gtgttcgcca ccgagcccaa tggccacatc cctgagggct tctcttttaa caattggttt 1800

ctgctgagca acgattccac cctggtgcac ggcaaggtgg tgagcaatca gccactgctg 1860

gtgaactgcc tgctggccat ccccaagatc tacggcctgg gccagttctt ttccttcaac 1920

cagacaatcg acggcgtgtg caatggagca gcagtgcaga gggcaccaga ggccctgcgg 1980

ttcaacatca acgatacctc cgtgatcctg gccgagggct ctatcgtgct gcacaccgcc 2040

ctgggcacaa acttcagctt cgtgtgcagc aatagctccg accctcacct ggccacattc 2100

gccatccctc tgggagcaac ccaggtgcca tactattgtt tcctgaaggt ggatacctac 2160

aacagcacag tgtataagtt tctggccgtg ctgccaccta cagtgcggga gatcgtgatc 2220

accaagtacg gcgacgtgta tgtgaacggc ttcggctacc tgcacctggg cctgctggat 2280

gccgtgacca tcaacttcac cggacacgga accgacgatg acgtgagcgg cttctggaca 2340

atcgcctcca ccaactttgt ggacgcactg atcgaggtgc agggaaccgc catccagaga 2400

atcctgtact gcgatgaccc agtgagccag ctgaagtgtt cccaggtggc cttcgacctg 2460

gatgacggct tttatcccat ctctagcaga aatctgctga gccacgagca gcccatctcc 2520

ttcgtgacac tgccttcttt caatgatcac agctttgtga acatcaccgt gtccgcctct 2580

tttggcggac actctggagc aaacctgatc gcaagcgaca ccacaatcaa tggcttctcc 2640

tctttttgcg tggatacaag acagttcacc atcagcctgt tttacaatgt gacaaactcc 2700

tacggctatg tgagcaagtc ccaggactct aactgtcctt tcaccctgca gagcgtgaat 2760

gattatctgt ctttcagcaa gttttgcgtg tccacatctc tgctggcctc cgcctgtacc 2820

atcgatctgt tcggctaccc agagtttggc tctggcgtga agttcacaag cctgtatttc 2880

cagtttacca agggcgagct gatcaccggc acaccaaagc ccctggaagg cgtgacagac 2940

gtgagcttta tgaccctgga cgtgtgcacc gagtacacaa tctatggctt caagggcgag 3000

ggcatcatca ccctgacaaa cagctccttt ctggccggcg tgtactatac cagcgactcc 3060

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tcttttagcg agcaggccgc ctatgtggat gacgatatcg tgggcgtgat ctctagcctg 3180

tcctctagca cattcaactc cacccgggag ctgcctggct tcttttacca ctccaatgat 3240

ggctctaact gcaccgagcc agtgctggtg tacagcaata tcggcgtgtg caagtccggc 3300

tctatcggct atgtgcccag ccagtccggc caggtgaaga tcgcccctac cgtgacaggc 3360

aatatctcca tcccaaccaa cttttctcac caccaccacc accactaa 3408

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gccgccagac atgataagat acattg 26