重组猪瘟病毒T细胞表位的猪细小病毒样颗粒亚单位疫苗研究

摘要

猪细小病毒(PPV)，属于细小病毒科、细小病毒属的成员，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。各种不同类型的猪均可感染，引起母猪发生流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF或HogCholera，HC)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病，是危害养猪业的主要传染病之一。猪瘟除了可以引起败血症之外，还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸形、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统受损、继发或并发细菌或其他病毒感染等。而且各种年龄的猪均易感，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，研制和开发具有良好的免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗来接种健康猪群和感染者具有重要的现实意义。　　本研究以CSFV的优势T细胞表位E290(含CSFV特异的辅助性和细胞毒性T细胞表位)为基础，以PPV的核衣壳蛋白VP2基因为支架载体分子，来研制预防猪瘟和猪细小病毒病的病毒样颗粒疫苗的新思路，在国内外尚未见有类似报道。　　首先，对分离的PPV毒株LJL12，在PK15细胞上进行增殖，根据Genbank报告的参考毒株VP2基因的核苷酸序列，利用Oligo和Primer5.0等软件，设计合成一对引物，以LJL12的DNA为模板，应用PCR扩增出长约0.7Kb的VP2基因片段，将该基因片段克隆到pMD-18T载体，并进行了酶切、PCR鉴定和序列测定，并将测序结果与Genbank报告的其他毒株VP2基因进行序列比较，发现与其他毒株的核苷酸同源性均在99％以上，推导的氨基酸同源性均在98％以上，说明LJL12株VP2基因的保守性很高。 将从pMD-18T-VP2中酶切纯化后的VP2基因克隆至真核表达载体pMelBacA的XhoⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上，命名为PM-VP2。酶切和PCR鉴定结果表明，获得了PPVVP2基因与pMelBacA质粒的阳性重组子。　　根据Brown等报道的CSFVT细胞表位E290的基因序列，设计一对引物，使上下游引物之间重叠18个碱基，并对酶促合成方式进行改良，采用普通的Taq酶，扩增获得了大小约为60bp多肽基因片段E290。　　将用酶促合成方法获得的E290的基因，克隆至重组质粒PM-VP2的VP2基因5'端上游，并命名为PM-VP2-E290。对重组子PM-VP2-E290进行酶切和序列测定，测定结果表明，扩增产物的序列与原设计的序列的同源性为100％。　　纯化重组子PM-VP2-E290阳性质粒，并与Bac-N-BlueDNA共转染昆虫细胞sf9，96h后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA分子的PCR鉴定表明，获得了杆状病毒DNA与E290-VP2基因的重组子，命名为P-1代病毒。将经过三次噬斑筛选纯化后的P-1病毒接种于sf9细胞上进行增殖，PCR鉴定后完全纯化的病毒，命名为P-2代病毒。并按同样方法制备高效价的P-3代病毒，以备用于表达。　　将高效价的P-3代重组杆状病毒接种于形成50％单层的sf9细胞，4天后收获病变细胞，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)免疫印迹(Western-blot)和免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)进行分析，确定所表达的蛋白分子量大小约为67KD，且具有天然蛋白的抗原特异性。　　应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到许多病毒样的颗粒，表明目的基因在杆状病毒表达系统中得到了表达，且表达的蛋白能自我装配成假病毒粒子，同时证明在PPVVP2的5'端插入CSFV特异的T细胞表位后，并不影响其装配。　　将带有外源重组基因E290-VP2的阳性重组杆状病毒在昆虫细胞sf9中进行大量表达后，在无佐剂参与的情况下，按确定的免疫程序免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，表达蛋白所形成的假病毒粒子，不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生抗PPV的特异性中和抗体。

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1猪细小病毒病流行及免疫预防研究进展

1.1.1 PPV的发生历史及在我国的流行情况

1.1.2.PPV的病原学特征

1.1.3.PPV的流行病学

1.1.4 PPV的疫苗研究进展

1.2猪瘟的流行及免疫防治研究进展

1.2.1 CSFV的病原学分类及生物学特征

1.2.2猪瘟疫苗研究进展

1.2.3猪瘟病毒抗原表位研究进展

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1质粒与菌株

2.1.2病毒与细胞

2.1.3实验动物

2.1.4抗体及疫苗制剂

2.1.5试剂

2.1.6培养液及培养基

2.1.7实验主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1猪细小病毒的分离及初步鉴定

2.2.2VP2基因的克隆与序列测定

2.2.3猪瘟抗原表位E290基因的扩增

2.2.4重组载体的构建(即pM-VP2)

2.2.5重组转座载体PM-VP2-E290的构建

2.2.6重组转座载体PM-VP2-E290转染昆虫细胞

2.2.7重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达及表达产物的检测

2.2.8表达产物的小鼠实验免疫研究

3结果

3.1分离病毒的血清学检测结果

3.2 VP2基因的克隆与序列测定

3.2.1 PPV VP2基因的PCR扩增结果

3.2.2重组质粒pMD-18T-VP2的酶切鉴定

3.2.3重组质粒pMD-18T-VP2的PCR鉴定

3.2.4 PPV VP2基因的序列测定结果及序列分析

3.3猪瘟抗原表位E290基因的扩增

3.4重组载体pM-VP2的构建

3.5重组转座载体PM-VP2-E290的构建

3.5.1重组质粒PM-VP2-E290的酶切鉴定

3.5.2重组质粒PM-VP2-E290的序列测定

3.6重组转座载体PM-VP2-E290转染昆虫细胞

3.6.1 PM-VP2-E290纯化质粒纯度和含量的测定

3.6.2 PM-VP2-E290纯化质粒与杆状病毒共转染昆虫细胞

3.6.3重组杆状病毒的噬斑纯化与鉴定

3.6.4重组杆状病毒滴度的测定

3.7重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达及表达产物的检测

3.7.1 SDS-PAGE检测表达产物

3.7.2免疫印迹(Western-blot)分析

3.7.3表达产物的Dot-ELISA检测

3.7.4表达产物的免疫电镜观察

3.8表达产物的小鼠实验免疫研究

3.8.1免疫小鼠血清中PPV特异性抗体的动态变化

3.8.2特异性CTL对靶细胞的杀伤活性

4讨论

4.1安全性病毒样颗粒亚单位疫苗的设计

4.2关于病毒样颗粒对小鼠免疫效力的研究

4.2.1体液免疫方面

4.2.2细胞免疫方面

4.3 PPV VP2基因的序列分析

4.4杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性测定

4.5有关实验方法的讨论

4.5.1 CSFV E290多肽基因的扩增

4.5.2小片段核酸的回收与鉴定

4.5.3转染过程

4.5.4不同条件对表达产量的影响

5结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附录

致谢