一种副干酪乳杆菌B111H及其在代谢综合征中的应用

摘要

本发明提供了一种副干酪乳杆菌B111H及其在代谢综合征中的应用，涉及微生物及其应用技术领域。该副干酪乳杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:22184；保藏时间为：2021年4月14日。本发明副干酪乳杆菌是从人体粪便中分离和筛选得到，具有能够显著抑制肝细胞脂质积累，降低体重和血脂水平，进而改善肝脏脂肪变性的作用，对于缓解高脂血症、肥胖和脂肪肝的发生具有重要的应用意义。该菌株的发现为降脂食品或药品提供了一种新的微生物资源。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一种副干酪乳杆菌（

背景技术

随着人们生活水平的提高、饮食结构改变及生活节奏加快、压力增加，“三高”问题也逐渐严重，仅血脂异常一项，患病率就高达40.4%。血脂异常也不仅是老年人群的专属疾病，患者群逐渐年轻化，成为30至50岁年龄段的中青年人群的“第一杀手”，极大加重了我国血脂异常相关疾病防控的严峻形势。血脂异常是导致心脑血管疾病的重要危险因素，与高血压、糖尿病等多种慢性病危险因素一样，会引发冠心病、心肌梗死、卒中等心脑血管疾病。

目前，他汀类药物被认为是目前最为有效的降脂药物，在临床治疗中有良好的效果，但需要长期服用，并且价格昂贵，伴有不同程度的副作用。

在人类胃肠道系统中共生的肠道微生物这一群体在调控宿主脂代谢稳态方面发挥着极为重要的作用，肠道菌群结构的紊乱能够导致代谢综合征的发生。越来越多的研究开始专注于寻找具有优良降血脂功效的肠道菌群及其活性代谢物，并解析其降脂机理，以期发现安全性高，降脂效果显著的活性菌株。其中，益生菌就是一类对人体有益的活性微生物，大量研究证实益生菌具有血液清道夫的作用，能够降低胆固醇，缓解脂肪肝和动脉粥样硬化等病症。相比于药物治疗代谢综合征，益生菌疗法无疑是个更安全有效的选择，但由于随着年龄、环境和身体状况的变化，体内益生菌的数量及菌群结构会发生改变，适当补充才能确保足够量和多种类的益生菌在肠道里发挥功效，调节糖脂代谢。

目前，可食用的益生菌名录包括35个种或亚种，因此，发现和挖掘具有良好功效的益生菌株将极大扩充可供国民使用的益生菌名单，并且益生菌作为下一代调血脂产品（如食品或/和药物）的市场前景也十分广阔。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌（

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供保藏编号为CGMCC No.22184的副干酪乳杆菌（

所述副干酪乳杆菌（

本发明筛选到一株具有降脂功能的菌株，命名为B111H，通过质谱分析鉴定该菌株为副干酪乳杆菌（

本发明还可以将所述菌株制备为微生物菌剂，所述微生物菌剂含有前述的副干酪乳杆菌B111H的菌体（活菌液或死菌体）或所述副干酪乳杆菌B111H的培养物（如培养上清液）。在具体的方案中，所述微生物菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。进一步地，所述微生物菌剂所含副干酪乳杆菌的总菌落数为0.5×10

本发明第二方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防代谢综合征的中的应用。

本发明第三方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防脂质代谢的药物中的应用。

本发明第四方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防脂质积累的药物中的应用。

本发明第五方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防高血脂的药物中的应用。

本发明第六方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防脂肪肝的药物中的应用。

本发明第七方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体在制备用于改善和/或预防非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

本发明的菌株可直接用于制备降脂类的食品或药品中，也可用于制备免疫调节类、减脂类等保健品中。

本发明第八方面提供副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体作为食品或食品成分的应用。

本发明第九方面提供药物组合物，其包括第一方面所述的副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体。

本发明第十方面提供食品，其包括第一方面所述的副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体。

本发明第十一方面提在患者中治疗代谢综合征的方法，包括以第一方面所述的副干酪乳杆菌或其培养上清液或其死菌体或第九方面所述的药物组合物向所述患者给药。

需要说明的是，本发明所称的代谢综合征包括但不限于肥胖、血脂异常、高血黏、高脂肪肝发生率。

需要说明的是，本发明所称的改善包括但不限于降低体重，降低血脂含量或/和甘油三酯含量或/和血清总胆固醇含量或/和低密度脂蛋白胆固醇水平或/和肝脏甘油三酯或/和肝脏胆固醇含量，缓解肝脏脂肪变性。

需要说明的是，本发明所称的药物组合物还包括剂型上或药学可接受的载体，例如固态载体或液态载体，具体地，例如膨润土、碳酸钙、沸石、淀粉；或者植物油、矿物油和水等。所述药物组合物可以制备为多种剂型，例如冻干粉剂、片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、悬浮液剂、糖浆剂和乳剂或药剂领域普通技术人员熟知的剂型。

其中，当剂型或药学上可接受的载体为固态药物组合物时（如胶囊剂、片剂和粉剂），可以包含合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、致流动剂和熔化剂等，其中，合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖（如葡萄糖或β-乳糖）、玉米甜味剂、天然和合成树胶，如阿拉伯胶、黄耆胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于：淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

此外，胶囊剂（例如明胶胶囊）可包含活性成分和粉状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的稀释剂可用来制备压制片。片剂和胶囊均可制成即时释放产品或缓释产品。压制片可以包糖衣或包膜以遮蔽任何令人不快的味道及保护片剂不受大气影响，或包肠衣使其在胃肠道中选择性崩解。

其中，当剂型或药学上可接受的载体为液态药物组合物时，包含在水、药学上可接受的脂肪和油、醇包括酯或其它有机溶剂中的溶液或悬浮液、乳剂、糖浆或酏剂、悬浮液、溶液和/或从非泡腾颗粒重建的悬浮液及从泡腾颗粒重建的泡腾制剂等液体药物组合物。这样的液体剂型可包括例如合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔化剂。

其中，口服给药用的液态药物组合物可包含着色剂和调味剂以提高患者的接受度。一般来说，水、合适的油、盐水、含水右旋糖（葡萄糖）和相应的糖溶液和乙二醇（如丙二醇或聚乙二醇）是非经胃肠道溶液的合适载体。例如，在口服用片剂或胶囊剂型中，活性成分可与口服无毒的药学上可接受的惰性载体（如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等）混合。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的副干酪乳杆菌菌株B111H能够显著抑制肝细胞脂质积累，降低体重和血脂水平，进而改善肝脏脂肪变性，对于缓解高脂血症、肥胖和脂肪肝的发生具有重要的应用意义。

（2）本发明的副干酪乳杆菌（

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为具有降脂作用的菌株筛选结果；

图2为本发明提供的副干酪乳杆菌B111H的质谱鉴定图；

图3为本发明提供的副干酪乳杆菌B111H对模拟胃液（A）和肠液（B）的耐受性；

图4示出了本发明的副干酪乳杆菌B111H的发酵上清液对HepG2肝癌细胞内甘油三酯TG含量的影响，n=3；辛伐他汀作为阳性药，*，p<0.05; **，p<0.01; ***，p<0.001；

图5示出了将本发明的副干酪乳杆菌B111H灌胃后，高脂血症小鼠的体重增加量（A）和白色脂肪含量（B），n=8, *，p<0.05; **，p<0.01; ***，p<0.001；

图6示出了将本发明的副干酪乳杆菌B111H灌胃后，高脂血症小鼠血清中甘油三酯（A）和总肝固醇含量（B），n=8, *，p<0.05; **，p<0.01; ***，p<0.001；

图7示出了将本发明中的副干酪乳杆菌B111H灌胃后，高脂血症小鼠肝脏中甘油三酯（A）和胆固醇含量（B），n=8, *，p<0.05; **，p<0.01; ***，p<0.001。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 . 具有降血脂作用的菌株分离

采集海南澄迈世界长寿之乡若干百岁老人的粪便作为分离样本，所采集对象在采集前未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无胃肠病史。

提取来自采集的粪便样品稀释液5 ml，10倍系列稀释至10

需要说明的是，粪便样品的稀释为本领域常规方法，本发明不做限制，在本发明的一个实施例中，使用清水对粪便样品进行稀释。

实施例2 .活菌液、代谢产物及灭活菌体的制备

2.1菌种的培养

取-80℃冻存菌液涂布于MRS固体平板上，在37℃条件下倒置培养24-48h后，取单菌落接种于液体MRS培养基中，37℃培养18-24h，得到一代菌液；取一代菌液按照10%的浓度接种至新鲜MRS液体培养基，37℃培养18-24h后可得到二代菌液；再取二代菌液按10%浓度接种于新鲜的MRS液体培养基中，37℃培养18-24h即得到工作菌液。

活菌液的获得

在本发明的一个具体实施例中，将步骤1获得的工作菌液置于13000 rpm，4℃的条件下离心15 min后，弃去上清，收集沉淀，用生理盐水重悬，获得具有活菌体的活菌液。

需要说明的是，活菌液还可以通过本技术领域中的其他方式获得，只要能从培养液中富集菌体即可。例如可以通过离心和/或过滤的方法实现。

代谢产物的获得

菌体代谢产物一般存在菌体的培养液中，因此，可以通过将菌体的培养液进行固液分离，获得上清液的方式来获得代谢产物。当然，细菌培养物上清液的制备也可在厌氧环境下进行。在本发明的一个具体的实施例中，将工作菌液于13000 rpm，4℃离心15 min后留取上清液转移至无菌离心管后即可获得细菌培养物上清液，4℃存放备用，获得代谢产物。

死菌液的获得

死菌体可以通过本领域常规的手段进行制备，例如，加热，辐射等。在本发明的一个实施例中，通过将活菌体在温度为65-85℃条件下，加热1h致死获得死菌体的死菌液。

实施例3.具有降脂作用的菌株筛选与鉴定

3.1 油红O染色实验

本发明使用的人源肝癌HepG2细胞购自于国家生物医学实验细胞资源库，培养方式为本领域常规使用的培养方法，在本发明的一个实施例中，培养方式为：将人源肝癌HepG2细胞在37℃和5% CO

将本发明提供的菌株作用于HepG2细胞构建的脂质积累模型中，观察到本发明提供的菌株对脂类代谢产生影响，具体如下：

取生长状态良好的对数生长期HepG2细胞，以适宜浓度接种于96孔板中，每孔加入100µl DMEM培养基培养24h至细胞完全贴壁。待细胞生长汇合至80%时，弃去原培养基，加入含有油酸的新鲜培养基，油酸用以进行脂质积累模型的构建，终浓度为100 μM，并添加30%（v/v）实施例2制备的L1-L18菌株的代谢产物。过夜培养22h后，弃掉培养基，用PBS洗涤3次后，使用4%多聚甲醛室温固定30min，然后用PBS清洗一遍，弃去PBS后每孔加入按产品说明书配制的油红O染液室温染色20min。染色完毕后，PBS漂洗三次，最后一次弃掉PBS后每孔加入100µl二甲亚砜DMSO，置于摇床上轻轻摇晃5min使油红充分溶解，然后用酶标仪读取358nm处吸光值，该数值用以评估细胞内脂质积累的含量。每个样品设置4个复孔，以仅加入同等体积含量的培养基MRS（30%，v/v）为阴性对照，以50 μM辛伐他汀为阳性对照，结果如图1所示。

根据图1，与MRS培养基对照组相比，辛伐他汀和L9上清液（即代谢产物）处理HepG2细胞后，油红O染色在358 nm下的吸光值明显降低 (0.218、0.238 vs 0.307)；并且L9处理组的数值与辛伐他汀阳性处理组较接近，L5、L6、L10、L11、L14处理组也表现出较显著的降脂效果，但均弱于L9，除此之外，L4、L8、L12、L17表现出促进脂积累的效果，以上这些结果表明分离的18株菌中，L9的代谢产物抑制HepG2细胞的脂质蓄积效果最显著。

副干酪乳杆菌B111H菌株的鉴定：

将所得单菌落涂布在质谱板上，分别加入裂解液和基质干燥后，使用MALDI-TOFMS 1000质谱仪（Autobio）进行鉴定，可获得以上菌种信息，如表1所示，其中L9的鉴定结果详见图2，表明L9的菌株隶属于副干酪乳杆菌种，并将该菌株命名为B111H。

筛选获得的副干酪乳杆菌菌株B111H已于2021年4月14日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。保藏编号为CGMCC No. 22184，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

表1筛选菌株的信息

实施例4 . 副干酪乳杆菌B111H的酸碱耐受性检测

4.1 模拟胃液和肠液的制备

模拟胃液：准确量取20 ml的1 mol/l盐酸溶液，加蒸馏水将盐酸溶液调节pH值为2.5，然后将胃蛋白酶（1 g/100 ml）加入到调节后的盐酸溶液中，经充分溶解后，使用0.22µm滤膜对溶解后的胃蛋白酶过滤待用。

模拟肠液：称取磷酸二氢钾6.8 g，胰酶10 g，加水其充分使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，稀释到1000 ml后待用。

副干酪乳杆菌B111H菌株的酸碱耐受性测试

收集培养后的B111H活菌体于13000 rpm，4℃离心15 min后，弃去液体，留取菌体沉淀，用生理盐水重悬，按照活菌数10

图3中A图显示本发明的副干酪乳杆菌B111H菌株对模拟胃液表现出较好的耐酸性，在pH 2.5环境中1h后，本发明的副干酪乳杆菌B111H的存活率高达91.7%，处理2h后的存活率为84.6%，4h后存活率为77.4%，表明副干酪乳杆菌B111H在强酸环境中能保持较高的存活率，可以经受胃部强酸性环境的考验，有利于充分发挥益生作用。

图3中B图显示本发明的副干酪乳杆菌B111H菌株具有较好的肠液耐受性，在pH6.8的环境中1h后，本发明的副干酪乳杆菌B111H的存活率高达88.2%，4h后的存活率为76.4%，表明副干酪乳杆菌B111H在强酸环境中能保持较高的存活率，可以在肠道中发挥益生作用。

实施例5 . HepG2细胞内甘油三酯TG含量检测

将本发明提供的菌株作用于HepG2细胞构建的脂质积累模型中，观察到本发明提供的菌株对脂类代谢产生影响，具体如下：

取生长状态良好的对数生长期HepG2细胞，以适宜浓度接种于12孔板中，每孔加入1ml DMEM培养基培养24h至细胞完全贴壁。待细胞生长汇合至70-80%时，弃去原培养基，加入含有油酸的新鲜培养基，油酸用以进行脂质积累模型的构建，终浓度为100µM，并添加30%（v/v）如上所述的副干酪乳杆菌B111H细菌培养物上清液代谢物。过夜培养22h后，弃掉培养基，用PBS洗涤3次后，每孔加入预冷的0.1% TritonX-100裂解液裂解细胞，并用细胞刮收集细胞至1.5ml Eppendorf离心管内，超声破碎裂解细胞，随后，用微量TG测定试剂盒按照生产厂商提供的操作流程检测细胞内TG的含量，同时用BCA蛋白浓度试剂盒检测细胞样品的蛋白质浓度，用mmol/g为单位表征细胞细胞内甘油三酯（TG）的含量。以仅加入同等体积含量的副干酪乳杆菌培养基MRS（30%，v/v）为阴性对照，以50µM辛伐他汀为阳性对照。

根据图4可以明显看出，与MRS培养基对照组相比，B111H上清液（即代谢产物）处理细胞后，HepG2细胞内甘油三酯含量明显降低（0.33 mmol/mg vs 0.21 mmol/mg）；数值与辛伐他汀阳性处理组接近，表明本发明中的副干酪乳杆菌B111H具有显著抑制HepG2细胞脂质积累的能力。

实施例6 . 高脂血小鼠模型实验

本发明将菌株B111H施用于小鼠，观察菌株降血脂和缓解脂肪肝的功效，具体操作如下：

动物实验所用小鼠为8周龄雄性C57BL/6小鼠32只，随机分4组，分别为正常组，高脂组，高脂+B111H活菌液组，高脂+B111H死菌体组，每组8只动物。

正常组给予标准小鼠饲料，其余各组给予60%脂肪功能的高脂饲料喂养，其中高脂+B111H活菌组每天给予1x10

4周后，用水合氯醛麻醉，眼眶取血，4℃离心后取上清作为血清样品，用于测量血清甘油三酯TG，总胆固醇TC和低密度脂蛋白胆固醇LDL-c的含量，同时处死动物；收取肝脏组织，-80℃低温保存，用于测定肝脏总胆固醇TC和甘油三酯TG的含量，其中，解剖前小鼠体重减去灌胃前小鼠体重为体重增加；最终检测结果如图5，图6和图7所示。

根据图5可以看出，连续喂养高脂饲料能够导致小鼠体重显著增加（图5中A图），腹后壁脂肪和腹股沟脂肪含量也相应的增加（图5中B图），显示出高脂饮食能够明显的促进肥胖发生；图6显示高脂组动物血清中的甘油三酯TG含量和总胆固醇TC水平增加，表现出明显的高脂血症表型；图7显示高脂组动物中肝脏TG和TC含量也显著增加，说明高脂喂食的小鼠表现出典型的脂肪肝特征。

当灌胃本发明的副干酪乳杆菌B111H活菌液或者灭活菌体后，小鼠体重增加、血清中甘油三酯TG和总胆固醇TC水平以及肝脏中的TG、TC含量明显低于高脂组的小鼠。这些结果表明：向小鼠喂食本发明的副干酪乳杆菌B111H活菌或者灭活菌体能显著抑制由于高脂饮食导致的体重增加，降低动物的血清TG，TC水平和肝脏内的TG和TC含量，显示出较好的减肥效果、良好的降脂活性，有效防止肝脏脂肪积累。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。