一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法，待测结直肠癌组织经过快速冰冻、切片相邻2片、固定于载玻片上，再经过共聚焦拉曼光谱仪进行单点测试和成像测试，获得原始拉曼光谱位移的数据，同时对应的另一片组织进行固定、免疫组织化学染色来确定该组织错配修复蛋白表达情况，使用支持向量机处理获得拉曼位移数据，根据免疫组织化学染色结果进行分类，建立数据库，根据数据库分类的基础通过拉曼光谱检测结果对新检测的组织进行分类进而判断出对应组织错配修复蛋白的表达情况。本发明中的检测方法中，组织样本处理过程简便，后期无试剂消耗，快速检测、简便、精度高、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗检测技术领域，具体来说，涉及一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势，全球每年患结直肠癌的病例超过1亿人，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，其发病递增速度为世界平均数的两倍，已位于我国恶性肿瘤发病率的第三位，严重危害人类健康。目前，结直肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗、放疗等治疗手段，肿瘤的复发、转移是引起病人死亡、治疗失败的主要原因。结直肠癌的发病原因往往是由基因的内在因素与环境因素共同作用的结果。研究发现很多结直肠癌具有家族聚集的特征，也就是具有遗传因素，比如说林奇综合征，是由错配修复基因胚系突变引起对应的错配修复蛋白表达缺陷，导致细胞复制过程中自我校正、修改的功能障碍，导致错配基因的存在和复制，引起肿瘤的发生、发展。近些年有诸多研究报道，错配修复蛋白表达缺失的结直肠癌容易引起对化疗药物5-fu的耐药，错配修复蛋白的表达情况对结直肠癌的诊治至关重要，因此国内外很多指南把错配修复蛋白检测作为结直肠癌的常规检测。目前的检测方法主要通过免疫组织化学染色的方法，利用抗原与抗体特异性结合的特性，经过十几个步骤、经历数天检测过程。因此该方法存在费用较高、过程复杂、耗时长的缺点。

拉曼光谱是一种光子与待测物质的分子或者官能团发生弹性碰撞而产生的散射光谱。该现象在1923年被德国科学家预测，1928年被印度科学家拉曼先生实际观察到，拉曼并因此获得诺贝尔奖。光在照射介质时，会与介质发生作用从而产生反射、吸收、散射、透射、发射等光学效应和现象。拉曼光谱信息即是光与介质作用产生散射的光谱，其特征与光谱信息与介质的相互作用、内部结构等相关。拉曼散射过程中入射光的频率与散射光的频率差值成为拉曼位移，对于同一种物质，其拉曼位移是唯一的，不会随着入射光的频率的改变而改变，所以拉曼位移仅与被检测物质分子本身相关。由于构成被检测物质的分子相同，所以每种分子的拉曼位移是特定的。与红外光谱相比，拉曼光谱具有受水影响小的特点。同时拉曼光谱检测生物组织时，只需要组织冰冻并切片，不需要普通免疫组织化学检测所需要的固定、包埋、脱蜡、抗原抗体反应等复杂过程，因此拉曼光谱检测生物样本具有快捷、经济、方便等特点。

支持向量机(SVM)是机器学习算法中应用最为广泛的一种二分类计算方法，因为该算法具有健壮性强，准确率高的特点，它既可以支持数据的线性分类也可以对非线性分类数据进行分类。它的工作原理是在寻找最大间隔的优化模型。SVM算法成熟、稳定，被很多行业使用。

目前常规检测方法是通过将结直肠癌组织病理固定、石蜡包埋、脱蜡、脱水等多个步骤，利用抗原抗体反应获得检测结果。目前方法存在过程复杂、繁琐、耗时长、费用高等不足。

因此把拉曼光谱检测生物样本快捷、高效、经济、方便的特点应用到结直肠癌错配修复蛋白缺失情况检测，所得数据经过SVM处理后，可以实现快速、经济、方便的得到检测结果。该方法对临床工作及患者具有很好的指导意义，具有可观的经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，制备获得结直肠癌的样片。

步骤2，对于上述样片的结直肠癌冰冻组织进行单点测试和成像测试，获得原始拉曼光谱位移的数据。

步骤3，对步骤2获得原始拉曼光谱位移数据进行处理，获得处理后的拉曼光谱数据；其中，所述处理包括去衬底预处理、归一化处理。

步骤4，对于同一蜡块的组织进行免疫组织化学染色，每个组织均检测4个常见的错配修复蛋白的免疫组织化学染色。

步骤5，对步骤3中处理后获得的拉曼光谱数据采用支持向量机进行数据分析，将相同类型的结直肠癌组织的拉曼光谱位移数据汇聚，完成分类、检测。

本发明的进一步改进在于，步骤1的具体包括:步骤1.1，将离体结直肠癌组织进行冰冻；步骤1.2，将冰冻后的结直肠癌组织进行切片，放于载玻片上待检测。

本发明的进一步改进在于，步骤1.1中所述结直肠癌组织进行冰冻方法包括：取刚刚离体组织在-20℃快速冷冻；步骤1.2具体包括将冰冻刚刚离体组织在切片机切成薄厚约5um左右的切片，将切片贴敷于石英或者玻璃载玻片上。

本发明的进一步改进在于，步骤2中的所述进行单点测试和成像测试具体包括：使用共聚焦拉曼光谱仪进行单点测试和成像测试。

本发明的进一步改进在于，步骤2中，进行单点测试和成像测试时包括：对组织进行600cm-1-2000cm-1波段进行单点测试；若出现蛋白质组峰及核酸组峰则跳转执行步骤3，否则跳转执行步骤1。

本发明进一步改进在于，步骤5中分类是根据大量免疫组化学产生的错配修复蛋白的结果，建立分类的标准。

本发明进一步改进在于，步骤5具体步骤包括：采用支持向量机对步骤3处理后的拉曼光谱数据进行分析，将相同类型的组织的光谱以相同颜色的数据节点汇聚在一起，获得结直肠癌组织中不同类型组织对应的判别散点分布图，完成分类、检测，建立对应数据库。

步骤具体包括：建立相应数据库后，以数据库为基础，同样采取步骤1、2、3中的方法进行检测，将获得数据与数据库中的数据对比分析，完成分类、检测，出具对用的检测报告。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过将离体组织冷冻、切片后通过拉曼光谱检测，过程简单、耗时短、经济。本发明的方法可以提高检测判断的准确率，同时有助于提高出具报告的效率，节省费用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明实施例的一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法的原理示意图。

图2是本实施例中错配修复蛋白全表达和表达缺失PSM2的平均光谱图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做出进一步的描述：

请参阅图1-2，根据本发明实施例的一种基于拉曼光谱的结直肠癌错配修复蛋白表达的检测方法,具体包括如下步骤：

(1)取新鲜离体的结直肠癌组织，大小约2.0cm*2.0cm，在液氮中速冻10-20秒。

(2)取速冻的组织用恒温冷冻切片机切成厚度约5um的切片，取2片。

(3)取其中1片，置于共聚焦拉曼光谱仪下检测，每个组织检测100个位点，获得相应的拉曼位移图谱，对图谱进行去宇宙射线、滤波、校正。

(4)将第1片紧邻的2片组织，按免疫组化的步骤，分别通过免疫组织化学染色获得对应的错配修复蛋白的表达情况。

(5)将对应的图谱按照免疫组织化学染色得到的错配修复蛋白表达缺失情况进行分类，建立对应的拉曼位移光谱数据库。

(6)通过支持向量机对新检测的组织进行分类，实现结直肠癌组织的错配修复蛋白表达缺失快速检测的目的。

检测结果参照图2，其中S1为错配修复蛋白表达无缺失的拉曼光谱位移图谱，S2、S3均为表错配修复蛋白表达缺失的拉曼光谱位移图谱。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。