一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法

摘要

本发明涉及食品安全检测，为了解决前处理复杂繁琐、检测成本高的问题，公开了一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法，包括以下步骤：葡萄酒样品蒸馏；内标溶液的加入；使用气相色谱‑火焰离子化检测器(GC‑FID)进行分析检测；内标法定量计算葡萄酒中乙醛和糠醛的含量。本发明通过蒸馏法除去葡萄酒中糖类和色素类干扰物质，使用气相色谱仪对葡萄酒中乙醛和糠醛进行准确的检测，分析，该试验方法前处理无需衍生化、快捷、简单、检测结果可靠、稳定，该方法为葡萄酒中乙醛和糠醛的检测提供了新的检测方法，弥补了传统检测方法前处理过程过于复杂的问题，和降低了检测设备的需求，大大降低了实验成本。

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，尤其涉及一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法。

背景技术

醛类是葡萄酒中风味物质的重要组成部分，其中乙醛占据重要地位，低浓度的乙醛具有水果的愉快香味，一旦浓度升高则会产生辛辣气味，然而在2009年乙醛被认为是强致癌物质，糠醛别名2-呋喃甲醛是葡萄酒的一种重要呈香物质，是一种具有杏仁油的香气的无色液体，能更加突出葡萄酒空杯留香的特点，可以说醛类物质是葡萄酒香气成分的重要组成部分，形成了葡萄酒协调柔和回味无穷的特点。

目前针对葡萄酒中乙醛含量的检测主要有：韦晓群等采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生气相色谱质谱法(GC/MS-SIM)检测葡萄酒中乙醛，梁瑞娥等采用顶空气相色谱法(GC/FID)测定葡萄酒中微量甲醇、乙醛，王光冲采用2,4二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生结合HPLC测定葡萄酒中的总乙醛及游离乙醛。国内外针对葡萄酒中糠醛含量的检测极少主要文献有：李洋等采用搅拌棒吸附萃取-气相色谱-质谱联用法测定葡萄酒中糠醛，李春光等采用固相微萃取内标法结合气相色谱-质谱测定葡萄酒中糠醛。针对葡萄酒中的乙醛的检测多采用柱前衍生法，即前处理采用2,4二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生后通过气相色谱-质谱法测定或者通过HPLC液相色谱法测定，存在前处理复杂繁琐、仪器设备昂贵、试验成本过高的问题，而固相微萃取技术前处理法存在商用萃取成本过高的问题，针对同时检测葡萄酒中乙醛和糠醛的文献较少。

因此，建立了蒸馏法-气相色谱法联用测定葡萄酒中乙醛和糠醛的方法，该方法简单稳定高效，能够除去葡萄酒中糖和色素等干扰因素对气相色谱仪的干扰并且大幅降低检验检测成本，以期更好解决葡萄酒醛类物质测定前处理复杂、试验成本过高的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：葡萄酒样品蒸馏；

步骤2：内标溶液的加入；

步骤3：使用气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)进行分析检测；

步骤4：内标法定量计算葡萄酒中乙醛和糠醛的含量。

所述步骤1中，所述的葡萄酒样品蒸馏的方法，包括以下步骤：

用容量瓶准确量取100mL液温为20℃的葡萄酒倒入500mL蒸馏瓶中，用50mL超纯水分3次冲洗容量瓶，洗液一并加入蒸馏瓶，加入沸石，连接冷凝管，以取样用的容量瓶作为接收器并冰浴，开启温度低于15℃的冷却水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液，容量瓶中液体接近刻度时，取下容量瓶，盖塞，在20℃水浴中保温30min，在补加水至刻度，混匀，备用；

所述的葡萄酒的酒精浓度为8-15度；

所述的葡萄酒为以葡萄果皮、果肉、果核一起为原料通过发酵而成，未添加外来呈味呈香物质和食用酒精的天然葡萄酒。

所述步骤2中，所述的内标溶液的加入，包括以下步骤：

取葡萄酒馏出液10mL于10mL容量瓶中定容，分别加入浓度为2％的乙酸正戊酯溶液和浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液各0.1mL，混匀后过0.22μm滤膜，待测；

浓度为2％的乙酸正戊酯溶液的制备方法包括以下步骤：吸取乙酸正戊酯标准品2mL，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL；

浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液的制备方法包括以下步骤：吸取4-甲基2-戊醇标准品2mL，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL。

所述步骤3中使用气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)进行分析检测，包括以下步骤：

气相色谱条件如下：色谱柱：ZKAT-LZP930.2毛细管柱(30m×0.32mm，0.25um，中国，中科安泰公司)；柱温控制程序：初始温度50℃，保持5min后，以5℃/min升温至90℃，再以15℃/min升温至200℃；保持2min进样口温度200℃；检测器温度200℃；载气为高纯氮气(纯度＞99.999％)，流量为1mL/min；

火焰离子化检测仪条件：氢气流量30mL/min；空气流量400mL/min；尾吹气流量25mL/min；分流比5∶1；进样量1.0uL。

所述步骤4中所述的内标法定量计算葡萄酒中乙醛和糠醛的含量，包括以下步骤：

乙醛和糠醛标准储备液通过以下方法制备得到：准确称取10mg乙醛和糠醛标准品，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL分别得到1000ug/mL标准储备溶液；

乙醛和糠醛标准使用液通过以下方法制备得到：分别吸取适量乙醛和糠醛标准储备溶液适量于10mL容量瓶中使用12％无水乙醇溶液定容至10mL，分别加入浓度为2％的乙酸正戊酯溶液和浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液各0.1mL，分别得到一系列浓度为5.0、15.0、25.0、50.0、70.0和100.0ug/mL的乙醛标准使用液和一系列浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0ug/mL糠醛标准使用液；测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线；

乙醛和糠醛分别在5.0-70.0ug/ml和0.5-50.0ug/ml质量浓度范围内，以S/N＝3确定检出限，乙醛和糠醛的检测限均小于5.0ug/mL；

将蒸馏后的葡萄酒样进样所测得的乙醛和糠醛的峰面积，按下式用内标法定量计算出对应的乙醛和糠醛化合物的浓度。

式中：

x-试样中乙醛和糠醛的含量，单位为mg/L；

C1-由标准曲线查得试样进样液中吡嗪的浓度，单位为ug/mL；

C2-由标准曲线查得空白试样进样液中吡嗪的浓度，单位ug/mL；

V1-试样定容体积，单位为mL；

V2-取样量，单位为mL。

本发明通过蒸馏法除去葡萄酒中糖类和色素类干扰物质，使用气相色谱仪对葡萄酒中乙醛和糠醛进行准确的检测，分析，该试验方法前处理无需衍生化、快捷、简单、检测结果可靠、稳定，该方法为葡萄酒中乙醛和糠醛的检测提供了新的检测方法，弥补了以往传统检测方法需要衍生和固相微萃取导致的前处理过程过于复杂的问题，和降低了检测设备的需求，使用气相色谱仪代替以往检测中常用的LC-MC/MC,和，GC-MC/MC,大大降低了实验成本。

附图说明

图1为纯水添加量对乙醛和糠醛回收率的影响柱状图；

图2为标准溶液中两种标准物质和两种内标的色谱图；

图3为葡萄酒样品中两种标准物质和两种内标的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

步骤1：仪器与试剂

乙醛标准品；糠醛标准品；乙酸正戊酯标准品(作内标用)；4-甲基2-戊醇溶液(作内标用)；乙醇(色谱纯)；市售葡萄酒；超纯水，GB/T 6682—2008规定的一级水Milli-Qacademic超纯水系统制备。

高效气相色谱仪配有氢火焰离子化检测器(1260II，美国安捷伦公司)；检测器(氢火焰离子化FID)；全玻璃蒸馏器(500mL)；恒温水浴(温控±0.1℃)。

步骤2：仪器分析条件

色谱柱，ZKAT-LZP930.2毛细管柱(30m×0.32mm，0.25μm，中国，中科安泰公司)；柱温控制程序：初始温度50℃，保持5min后，以5℃/min升温至90℃，再以15℃/min升温至200℃；保持2min进样口温度200℃；检测器温度200℃；载气为高纯氮气(纯度＞99.999％)，流量1mL/min；氢气流量30mL/min；空气流量400mL/min；尾吹气流量25mL/min；分流比5∶1；进样量1.0μL。

步骤3：溶液配制

1)模拟酒样：模拟葡萄酒12％的酒度，取无水乙醇12mL用超纯水定容100mL，使无水乙醇的体积分数为12％；

2)内标溶液：浓度为2％的乙酸正戊酯溶液：作乙醛内标使用，吸取乙酸正戊酯标准品2mL，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL；

浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液：作糠醛内标使用，吸取4-甲基2-戊醇标准品2mL，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL；

3)标准储备溶液：准确称取10mg乙醛和糠醛标准品，使用12％无水乙醇溶液定容至100mL分别得到1000μg/mL标准储备溶液；

4)标准使用溶液：分别吸取适量乙醛和糠醛标准储备溶液适量于10mL容量瓶中使用12％无水乙醇溶液定容至10mL，分别加入浓度为2％的乙酸正戊酯溶液和浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液；两种内标物质各0.1mL，分别得到一系列浓度为5.0、15.0、25.0、50.0、70.0和100.0μg/mL乙醛标准使用液和一系列浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0μg/mL糠醛标准使用液；

步骤4：样品前处理和GC-FID分析检测

1)葡萄酒样品蒸馏

用一干燥、洁净100mL容量瓶，准确量取100mL液温为20℃的葡萄酒倒入500mL蒸馏瓶中，用50mL超纯水分3次冲洗容量瓶，洗液一并入蒸馏瓶，加入几颗沸石，连接冷凝管，以取样用的原容量瓶作为接收器并冰浴，开启温度低于15℃的冷却水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液，容量瓶中液体接近刻度时，取下容量瓶，盖塞，在20℃水浴中保温30min，在补加水至刻度，混匀，备用；

2)内标溶液的加入

取酒样馏出液10mL于10mL容量瓶中定容，分别加入浓度为2％的乙酸正戊酯溶液和浓度为2％的4-甲基2-戊醇溶液内标物质各0.1mL，混匀后过0.22μm滤膜，待测；

3)气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)分析检测；

步骤5：内标法定量计算葡萄酒中乙醛和糠醛的含量

将蒸馏后的葡萄酒样进样所测得的乙醛和糠醛的峰面积，按下式用内标法定量计算出对应的乙醛和糠醛化合物的浓度：

式中：

x-试样中乙醛和糠醛的含量，单位为mg/L

C1-由标准曲线查得试样进样液中吡嗪的浓度，单位为ug/mL；

C2-由标准曲线查得空白试样进样液中吡嗪的浓度，单位为ug/mL；

V1-试样定容体积，单位为mL；

V2-取样量，单位为mL；

结果保留2为有效数字。

进一步，本发明还对该一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法中工艺条件作了系统研究，以下仅对工艺条件改变对葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测效果影响显著的试验方案进行说明，具体见对比例1-6：

对比例1：纯水添加量的优化

在蒸酒过程中纯水添加太少会导致蒸酒时间过短导致标准物质挥发不充分，而纯水添加过多会导致蒸酒时间过长，导致试验时间过长，试验考察在加标样品中纯水添加量(20，30，40，50，60和70mL)，每一种添加量平行测定3次取平均回收率考察乙醛和糠醛加标样品平均回收率的的影响，结果见附图1所示。试验结果表明，纯水添加量50mL时，乙醛和糠醛回收率达到最高而后随着纯水添加量的提高回收率基本保持不变，为确保乙醛和糠醛有较好的回收率和节约试验时间的目的，最终确定最优纯水添加量为50mL。

对比例2：色谱柱的优化

通过大量文献资料的查阅，色谱柱的选择主要有：DB-5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)，DB-WAX毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)，CP WAX 57CB毛细管柱(50.0m×0.25mm×0.25μm)。通过试验表明，色谱柱选择DB-5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)时目标物质虽然可以实现分离但是乙醛物质目标峰型较宽，并且有一定的拖尾，降低检测灵敏度，色谱柱选择DB-WAX毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)，色谱图峰型较好，但是在测定样品时糠醛物质目标峰会和干扰物质部分重合，并且进口色谱柱采购成本过高，试验以降低试验成本和增大分离效果增强检测灵敏度的原则，确定使用ZKAT-LZP930.2毛细管柱(30m×0.32mm，0.25um，中国，中科安泰公司)国产色谱柱，不断优化条件，确定最佳色谱条件：柱温控制程序为，初始温度50℃，保持5min后，以5℃/min升温至90℃，以15℃/min升温至200℃；保持2min进样口温度200℃；检测器温度200℃；载气为高纯氮气(纯度＞99.999％)，流量1mL/min；氢气流量30mL/min；空气流量400mL/min；尾吹气流量25mL/min；分流比5∶1；进样量1.0uL。在最佳色谱条件下，各标准物质都有较好的分离度，并且峰型较好。结果见附图2和附图3，其中附图2为标准溶液中两种标准物质和两种内标的色谱图，附图3为样品中两种标准物质和两种内标的色谱图。

对比例3：精密度测定

将浓度为30ug/ml的标准溶液重复进样测定6次，作为方法精确度及重复性评估，结果如下：

表1葡萄酒中乙醛和糠醛标准溶液的精密度测定结果

由表1可以看出乙醛和糠醛化合物的RSD均小于10％，表明方法精密度良好。

对比例4：检出限、定量限及线性范围：

乙醛和糠醛的线性范围分别是5.0-100.0ug/mL和0.5-50.0ug/mL，相关性系数为0.99933和0.99975，相关系数R2＞0.999，以信噪比3(S/N＝3)确定方法检出限，以3倍检出限作为方法定量限，结果如下：

表2葡萄酒中乙醛及糠醛的线性回归方程，相关系数及检出限

由表2可知葡萄酒中乙醛和糠醛的方法检出限分别为4.48ug/ml和0.54ug/ml，定量限分别为13.44ug/ml和1.62ug/ml。

对比例5：加标回收率

试验根据GB/T27404-2008在方法，在测定低限，2倍方法测定低限和10倍方法检测低限进行3个水平试验(n＝5)，每个水平分别计算平均回收率，结果见表3。该方法检测葡萄酒中乙醛及糠醛测定低限加标的相对标准偏差(RSD)为1.47％-4.23％，平均回收率为82.47％-89.66％，2倍方法测定低限的相对标准偏差(RSD)为1.66％-5.33％，平均回收率为89.44％-92.15％，10倍方法检测低限的相对标准偏差(RSD)为1.54％-4.52％，平均回收率为93.14％--95.26％，说明该检验方法对葡萄酒中乙醛和糠醛的检测有良好的精密度和准确性，满足检验分析要求。

表3葡萄酒中乙醛及糠醛相对标准偏差与加标回收率(n＝5)

由表3可知，乙醛和糠醛的加标回收率均在82.47％～95.26％之间，表明该方法和仪器均有较好的准确性，可以满足测试的要求。

对比例6：部分葡萄酒中乙醛和糠醛化合物的含量测定

采用建立的分析方法，对葡萄酒进行分析，部分有代表性的葡萄酒样乙醛和糠醛的含量见表4。

表4部分葡萄酒中乙醛和糠醛的含量(ug/ml)

从表4可知，5种市售葡萄酒中乙醛均有检出，但是含量差异有变化，其中河北干红葡萄酒乙醛和糠醛含量最高，分别为65.24ug/mL，5.78ug/mL，而贵州蓝莓酒乙醛和糠醛含量最低，分别为10.22ug/mL，未检出。

本发明提出的一种葡萄酒中乙醛和糠醛含量的检测方法，采用蒸馏法除去葡萄酒中糖和色素等干扰物质对气相色谱的影响，简化以往衍生化法和固相微萃取法试验步骤和试验成本，并且优化蒸馏法中纯水添加量，确定纯水添加量为50mL，节省了试验时间，同时优化了气相色谱柱和色谱条件，确定色谱条件为：ZKAT-LZP930.2毛细管柱(30m×0.32mm，0.25um，中国，中科安泰公司)，柱温控制程序：初始温度50℃，保持5min后，以5℃/min升温至90℃，再以15℃/min升温至200℃；保持2min进样口温度200℃；检测器温度200℃；载气为高纯氮气(纯度>99.999％)，流量1mL/min；氢气流量30mL/min；空气流量400mL/min；尾吹气流量25mL/min；分流比5∶1；进样量1.0uL。

由上述实施例1和对比例1-6可知，乙醛和糠醛分别在5.0-100.0ug/mL和0.5-50.0ug/mL线性关系良好，相关系数R2分别为0.99933、0.99975，乙醛和糠醛重复性检测值RSD值为1.55％-1.80％，3个水平样品加标平均回收率分别为82.47％-89.66％、89.44％-92.15％、93.14％-95.26％，方法精密度(RSD)分别为1.47％-4.23％、1.66％-5.33％、1.54％-4.52％(n＝5)，乙醛和糠醛的方法最低检出限分别为4.48ug/mL和0.54ug/mL，说明试验方法重现性，精密度和准确性良好，测得5种市售葡萄酒乙醛含量范围为10.22-65.24ug/mL，糠醛含量范围为1.51-5.78ug/mL，该方法简便，准确，减少了前处理步骤，使用更加便宜的检测设备，降低了试验成本，为葡萄酒中乙醛和糠醛的检测提供新方法。

本发明通过蒸馏法除去葡萄酒中糖类和色素类干扰物质，使用气相色谱仪对葡萄酒中乙醛和糠醛进行准确的检测，分析，该试验方法前处理无需衍生化，快捷，简单，检测结果可靠，稳定，该方法为葡萄酒中乙醛和糠醛的检测提供了新的检测方法，弥补了以往传统检测方法需要衍生和固相微萃取导致的前处理过程过于复杂的问题，和降低了检测设备的需求，使用气相色谱仪代替以往检测中常用的LC-MC/MC,和，GC-MC/MC,大大降低了实验成本。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。