技术领域
本文提供了用于降低受试者(例如人)中电压门控钠离子通道α亚基2(SCN2A)的表达的方法、化合物和组合物。另外，本文提供了可用于治疗受试者中与电压门控钠离子通道α亚基1(SCN1A)有关的疾病或病症的方法、化合物和包含SCN2A反义寡核苷酸(ASO)的组合物。这样的方法、化合物和组合物可用于例如治疗、预防、延迟或改善与SCN1A有关的脑病，例如Dravet综合征。
背景技术
电压门控钠离子通道(sodium voltage-gated channel)α亚基1(SCN1A)基因位于人类2号染色体的长臂(q)的24.3位，其编码NaV1.1，NaV1.1是电压门控钠通道的α亚基，表达于大脑中并参与神经信号传导。SCN1A突变可能与癫痫、全身性癫痫伴热性惊厥、家族性热性惊厥、偏头痛、婴儿早期癫痫脑病6型、Dravet综合征(婴儿严重肌阵挛性癫痫)以及其他与SCN1A有关的脑病相关。然而，SCN1A突变引起不良反应的机制在本领域中尚未完全了解，并且尚无令人满意的治疗SCN1A脑病的方法。因此，仍然需要可用于治疗这些SCN1A相关疾患的新方法。
发明内容
本文提供了用于调节电压门控钠离子通道α亚基2(SCN2A)表达的组合物、化合物和方法，以治疗与电压门控钠离子通道α亚基1(SCN1A)相关的疾病，例如SCN1A脑病，包括Dravet综合征(婴儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI))、癫痫、全身性癫痫伴热性惊厥、家族性热性惊厥、偏头痛和婴儿早期癫痫脑病6型。
在一个方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的受试者中的SCN1A脑病的方法，所述方法以足以治疗SCN1A脑病的量和持续时间向所述受试者施用一种化合物，所述化合物包含长度为10-80个核苷的单链寡核苷酸并且具有包含10个连续核碱基部分的核碱基序列，所述核碱基序列与人SCN2A基因的前mRNA转录物或mRNA转录物的靶区域的等长部分至少80％互补。
在一些实施方案中，所述方法降低了人SCN2A基因的表达。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括一个核碱基序列、基本上由其组成或由其组成，所述核碱基序列与编码GenBank登录号为NP_066287.2的氨基酸序列的SCN2A mRNA的一部分互补或包含GenBank登录号为NM_021007.2的核碱基序列。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括一个或多个修饰的糖、一个或多个修饰的核苷间键联和/或一个或多个修饰的核碱基。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括一个或多个修饰的糖。
在一些实施方案中，所述一个或多个修饰的糖各自独立地选自由以下组成的组：双环糖、2'-O-甲氧基乙基(2MOE)修饰糖、2'-O-甲氧基(2-OMe)修饰糖、2'-甲氧基修饰糖、2'-O-烷基修饰糖、约束的乙基(cEt)修饰糖、锁糖和未锁糖。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上具有2MOE修饰糖。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷间键联。
在一些实施方案中，一个或多个修饰的核苷间键联包括修饰的磷酸酯。
在一些实施方案中，每个修饰的磷酸酯独立地选自由以下组成的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、磷酰吗啉和哌嗪磷酸酯。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上具有硫代磷酸酯核苷间键联。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上具有二氨基磷酸酯吗啉代核苷间键联。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括一个或多个修饰的核碱基。
在一些实施方案中，修饰的核碱基选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶(6-azouracil)、6-偶氮胞嘧啶(6-azocytosine)、6-偶氮胸腺嘧啶(6-azothymine)、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤(8-haloadenine)、8-氨基腺嘌呤、8-硫代腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、5-溴尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-氟腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含：
由连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接核苷组成的5’翼区段；以及
由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位于紧邻所述5’翼区段和所述3’翼区段并在这两者之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸由12至40个(例如16至30个)核碱基组成。
在一些实施方案中，所述方法包括抑制SCN2A在受试者神经元细胞中表达。
在一些实施方案中，所述SCN1A脑病选自由以下组成的组：癫痫、全身性癫痫伴热性惊厥、家族性热性惊厥、偏头痛、婴儿早期癫痫脑病6型和Dravet综合征。
在一些实施方案中，所述SCN1A脑病是Dravet综合征。
在一些实施方案中，通过鞘内、髓内或脑室内施用所述化合物。
在一些实施方案中，降低的SCN2A表达提供了治疗效果。
在一些实施方案中，所述方法减轻了SCN1A脑病的一种或多种症状。
在一些实施方案中，SCN1A脑病的一种或多种症状选自由以下组成的组：持续性癫痫、癫痫频繁发作、行为和发育迟缓、运动和平衡问题、骨科病症、语言和言语迟缓问题、生长和营养问题、睡眠困难、慢性感染、感觉统合失调、自主神经系统的破坏和发汗。
在一些特定实施方案中，所述寡核苷酸相对于SCN1A前mRNA或mRNA对SCN2A前mRNA或mRNA具有选择性。
在一些实施方案中，所述方法基本上不降低SCN1A表达。
在一些实施方案中，所述受试者具有SCN1A的功能获得性突变。
在一些实施方案中，所述受试者具有SCN1A的功能缺失性突变。
定义
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2’-脱氧核苷”意指包含如在天然存在的脱氧核糖核苷酸(DNA)中所发现的2’-H(H)呋喃糖基糖部分的核苷。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(尿嘧啶)。
“2’-O-甲氧基乙基”(也称为2’-MOE和2’-O(CH
“2’-MOE核苷”(也称为2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2'-取代的核苷”或“2-修饰的核苷”意指包含2'-取代的或2'-修饰的糖部分的核苷。如本文所用，关于糖部分的“2'-取代的”或“2-修饰的”意指包含除H或OH以外的至少一个2'-取代基的糖部分。
“3’靶位点”是指与特定化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指具有连接至5’位置的甲基的胞嘧啶。
“约”意指在值的±10％以内。例如，如果陈述为“化合物影响约70％的SCN2A抑制”，则暗示在60％至80％的范围内抑制SCN2A水平。
“施用”是指将本文提供的化合物或组合物引入受试者以执行其预期功能的途径。可以使用的施用途径的实例包括但不限于鞘内、髓内、脑室内和胃肠外施用，例如皮下、静脉内或肌内注射或输注。
“伴随施用”或“联合施用”意指以任何方式施用两种或更多种化合物，其中两者的药理作用均在患者中显现。伴随施用不要求在单一药物组合物中、以相同剂型、通过相同施用途径或在相同时间施用这两种化合物。两种化合物的作用不必在相同时间显现。所述作用仅需重叠一段时间但不必同延。共同施用或联合施用包括并行或依次施用。
“改善”是指相关疾病、疾患或病症的至少一个指标、体征或症状的好转或减轻。在某些实施方案中，改善包括病症或疾病的一个或多个指标的进展或严重性的延迟或减慢。指标的进展或严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观测量来确定。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测和/或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为：相比于在靶核酸的反义化合物不存在时的靶核酸水平或靶蛋白水平，靶核酸或由这种靶核酸编码的蛋白质的量或表达减少。
“反义化合物”意指包含寡核苷酸和任选地一个或多个附加特征，例如缀合物基团或末端基团的化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，例如寡核苷酸、核酶、siRNA、shRNA、ssRNA和基于占用的化合物。
“反义抑制”意指：相比于在反义化合物不存在时的靶核酸水平，在与靶核酸互补的反义化合物存在时的靶核酸水平降低。
“反义机制”是涉及化合物与靶核酸杂交的所有那些机制，其中杂交的结果或作用是靶降解或靶占用，伴随着涉及例如转录或剪接的细胞机器的停止。
“反义寡核苷酸”意指具有与靶核酸或其区域或区段互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，反义寡核苷酸可与靶核酸或其区域或区段特异性地杂交。
“共济失调”意指对身体运动的完全控制的丧失。
“双环核苷”或“BNA”意指包含双环糖部分的核苷。“双环糖”或“双环糖部分”意指包含两个环的修饰的糖部分，其中第二环是通过连接第一环中的两个原子的桥而形成的，从而形成双环结构。在某些实施方案中，双环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施方案中，双环糖部分不包含呋喃糖基部分。
“支化基团”意指具有能够与至少3个基团形成共价键的至少3个位置的原子团。在某些实施方案中，支化基团提供多个反应位点，用于通过缀合接头和/或可裂解部分将束缚配体连接至寡核苷酸。
化合物中的“化学修饰”描述化合物中的任何单元通过化学反应的取代或变化。“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷间键联、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“化学上不同的区域”是指以某种方式在化学上不同于同一化合物的另一区域的化合物区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学上不同的区域、每个位置具有多个亚基的反义化合物。
“可裂解键”意指能够被分裂的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。
“可裂解部分”是指在生理条件下例如在细胞、动物或人的内部裂解的键或原子团。
关于寡核苷酸的“互补”意指这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列与另一寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配，此时所述两个核碱基序列在相反方向上对齐。如本文所述，除非另有说明，否则核碱基匹配或互补核碱基限于以下对：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)以及5-甲基胞嘧啶(
在寡核苷酸的背景下，“连续的”是指彼此紧邻的核苷、核碱基、糖部分或核苷间键联。例如，“连续核碱基”意指在序列中彼此紧邻的核碱基。
“痴呆”意指智力功能的持续丧失，其损害记忆、判断和思维。
“设计”或“设计为”是指设计与选择的核酸分子特异性杂交的化合物的过程。
“稀释剂”意指在组合物中缺乏药理活性但在药学上必需或期望的成分。例如，注射型组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷为“不同修饰的”，即使DNA核苷为未修饰的。同样，DNA和RNA为“不同修饰的”，即使这两者均为天然存在的未修饰的核苷。相同但包含不同核碱基的核苷不为不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的腺嘌呤核碱基的核苷和包含2’-OMe修饰的糖和未修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不为不同修饰的。
“剂量”意指在单次施用中或在规定时间内提供的化合物或药剂的规定量。在某些实施方案中，可在两个或更多个推注剂、片剂或注射剂中施用剂量。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，期望的剂量可能需要这样的体积，所述体积通过单次注射不易容纳。在这样的实施方案中，可以使用两次或更多次注射来实现期望的剂量。在某些实施方案中，可以分成两次或更多次注射来施用剂量，以将受试者中的注射部位反应降低到最低限度。在其他实施方案中，通过在延长的时段内或连续地输注来施用化合物或药剂。可将剂量陈述为每小时、每天、每周或每月的药剂的量。
“给药方案”是设计为实现一种或多种期望效果的剂量的组合。
“双链化合物”意指这样的化合物，其包含彼此互补并形成双链体的两种低聚化合物，并且其中两种所述低聚化合物之一包含寡核苷酸。
“有效量”意指足以在需要所述化合物的受试者中实现期望生理结果的化合物的量。有效量可在受试者间变化，取决于待治疗受试者的健康和身体状况、待治疗受试者的分类群、组合物的制剂、受试者的医疗状况的评估以及其他相关因素。
“功效”意指产生期望效果的能力。
“Ensembl ID”是由Ensembl分配给基因序列的由字母和数字组成的标识号，Ensembl是在EMBL-EBI与Wellcome Trust Sanger研究所之间的开发一种软件系统的联合项目，所述软件系统产生并维护选定真核生物基因组的自动注释。Ensembl注释帮助鉴定特定基因组中的基因位置，并可用于将等效基因配置在另一个物种的基因组上。
“癫痫”是一种中枢神经系统疾患，其中大脑中的神经细胞活动受到慢性破坏。在某些情况下，它可引起癫痫发作、异常行为与感觉时期，并且有时引起意识丧失。在某些情况下，它还可引起其他症状，包括肌阵挛、认知缺陷、学习障碍或儿童发育迟缓。在某些情况下，它可导致一些患者死亡。在某些情况下，一些形式的癫痫与进行性神经退行性疾病相关。许多癫痫患者有多于一种症状。
“表达”包括所有这样的功能：基因的编码信息通过这些功能可以转化为在细胞中存在并且运行的结构。这样的结构包括但不限于转录和翻译产物。
“缺口聚物”意指包含具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域的寡核苷酸，所述内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的一个或多个核苷。内部区域可被称为“缺口”而外部区域可被称为“翼”。
“SCN1A”意指人电压门控钠离子通道α亚基1，并且是指SCN1A的任何核酸。例如，在某些实施方案中，SCN1A包括编码SCN1A的DNA序列、从编码SCN1A的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列。靶标可以用大写或小写形式指示。
“SCN2A”意指人电压门控钠离子通道α亚基2，并且是指SCN2A的任何核酸。例如，在某些实施方案中，SCN2A包括编码SCN2A的DNA序列、从编码SCN2A的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列。靶标可以用大写或小写形式指示。
“SCN2A特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制SCN2A表达或活性的任何药剂。例如，SCN2A特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子和其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。
“杂交”意指寡核苷酸和/或核酸的退火。虽然不限于具体机制，但杂交的最常见机制涉及氢键合，所述氢键合可为互补核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和核酸靶标。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于寡核苷酸和核酸靶标。
“紧邻”意指在相同种类的紧邻元件之间没有中间元件(例如，在紧邻核碱基之间没有中间核碱基)。
“受试者”意指针对治疗或疗法选择的人或非人类动物。
“抑制表达或活性”是指，相对于未处理或对照样品中的表达或活性，表达或活性的降低或阻断，并且不一定指示表达或活性的彻底消除。
“核苷间键联”意指形成寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联的基团或键。“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的磷酸酯核苷间键联之外的任何核苷间键联。非磷酸酯键联在本文中称为修饰的核苷间键联。
“脑室内施用”意指向脑室系统中施用。
“胃肠外施用”意指通过输注或注射到腹膜中而施用。
“髓内施用”是指向脊髓、延髓或骨的骨髓腔中施用。
“鞘内施用”意指向椎管内或蛛网膜下腔内施用，以使其到达脑脊液(CSF)。
“静脉内施用”意指向静脉内施用。
“加长的寡核苷酸”是相对于本文公开的寡核苷酸例如亲本寡核苷酸具有一个或多个附加核苷的那些寡核苷酸。
“连接核苷”意指通过核苷间键联连接在一起的相邻核苷。
“错配”或“非互补”是指当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸比对时，第一寡核苷酸的核碱基与第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基不互补。例如，包括但不限于通用核碱基、肌苷和次黄嘌呤在内的核碱基能够与至少一个核碱基杂交，但是相对于与其杂交的核碱基仍然是错配的或非互补的。作为另一个实例，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸比对时，不能与第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基杂交的第一寡核苷酸的核碱基是错配或非互补核碱基。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体中的特征。例如，调节SCN2A可以意指增加或降低细胞、组织、器官或生物体中SCN2A的水平。“调节剂”影响细胞、组织、器官或生物体的变化。例如，化合物可以是SCN2A的调节剂，其减少细胞、组织、器官或生物体中SCN2A的量。
“MOE”意指甲氧基乙基。
“单体”是指低聚物的单个单元。单体包括但不限于核苷和核苷酸。
“基序”意指寡核苷酸中未修饰的和/或修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键联的模式。
“肌阵挛”意指反复、刻板、不自主的肌肉抽搐或颤搐的发作，这些发作可影响身体的一部分或整个身体，持续时间不定。
“天然的”或“天然存在的”意指在自然界中发现的。
“非双环修饰的糖”或“非双环修饰的糖部分”意指包含这样的修饰(例如取代基)的糖部分，所述修饰在糖的两个原子之间不形成导致形成第二环的桥。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸和双链核酸。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。如本文所用的“天然存在的核碱基”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和鸟嘌呤(G)。“修饰的核碱基”是经化学修饰的天然存在的核碱基。“通用碱基”或“通用核碱基”是除天然存在的核碱基和修饰的核碱基以外的核碱基，并且能够与任何核碱基配对。
“核碱基序列”意指不依赖于任何糖或核苷间键联的在核酸或寡核苷酸中的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地未被修饰或被修饰。“修饰的核苷”意指包含修饰的核碱基和/或修饰的糖部分的核苷。修饰的核苷包括缺乏核碱基的无碱基核苷。
“低聚化合物”意指包含单个寡核苷酸和任选地一个或多个附加特征，例如缀合物基团或末端基团的化合物。
“寡核苷酸”意指连接核苷的聚合物，每个核苷可被修饰或未被修饰，彼此独立。除非另有说明，否则寡核苷酸由8-80个连接核苷组成。“修饰的寡核苷酸”意指其中至少一个糖、核碱基或核苷间键联被修饰的寡核苷酸。“未修饰的寡核苷酸”意指不包含任何糖、核碱基或核苷间修饰的寡核苷酸。
“亲本寡核苷酸”意指其序列被用作设计更多的序列相似但长度、基序和/或化学性质不同的寡核苷酸的基础的寡核苷酸。新设计的寡核苷酸可以具有与亲本寡核苷酸相同或重叠的序列。
“胃肠外施用”意指通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合用于向受试者(例如，人)施用的任何物质。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液，例如PBS或注射用水。
“药学上可接受的盐”意指化合物(例如低聚化合物或寡核苷酸)的生理学上和药学上可接受的盐，即，保留亲本化合物的期望生物活性且不赋予不希望的毒理学效应的盐。
“药剂”意指当施用于受试者时提供治疗益处的化合物。
“药物组合物”意指适合施用于受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种化合物或其盐和无菌水溶液。
“硫代磷酸酯键联”意指修饰的磷酸酯键联，其中用硫原子替换非桥氧原子之一。硫代磷酸酯核苷间键联为修饰的核苷间键联。
“磷部分”意指包含磷原子的原子团。在某些实施方案中，磷部分包含单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或硫代磷酸酯。
“部分”意指核酸的限定数目的连续(即，连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是低聚化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指以数分钟到无限期的时间段延迟或阻止疾病、疾患或病症的发作、发展或进展。
“前药”意指处于体外形式的化合物，当施用于受试者时，其在体内或其细胞内代谢为另一种形式。在某些实施方案中，代谢的形式是化合物(例如，药物)的活性或更具活性的形式。通常，通过细胞或组织中存在的一种或多种酶(例如，内源酶或病毒酶)或化学物质的作用和/或通过生理条件促进前药在体内转化。
“降低”意指减低至更小的程度、尺寸、量或数目。
“RefSeq号”是分配给序列的字母和数字的独特组合，以指示所述序列是针对特定的靶转录物(例如，靶基因)。可以在基因序列数据库中找到有关靶基因的这样的序列和信息(统称为基因记录)。基因序列数据库包括NCBI参考序列数据库、GenBank、欧洲核苷酸档案库和日本DNA数据库(后三者构成国际核苷酸序列数据库联盟或INSDC)。
“区域”被定义为具有至少一个可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的部分。
“RNAi化合物”意指反义化合物，其至少部分地通过RISC或Ago2而不是通过RNA酶H起作用，以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白质。RNAi化合物包括但不限于双链siRNA、单链RNA(ssRNA)和microRNA，包括microRNA模拟物。
“区段”被定义为核酸内区域的更小部分或子部分。
“癫痫发作”是可能影响大脑的许多不同疾患和病症的症状。“癫痫发作”通常是由脑损伤或疾病或疾患导致的大脑神经元之间的电通信中断引起的。癫痫发作可以呈现为不同的形式，并以不同的方式影响不同的人。癫痫发作期间可能发生的常见身体变化是说话困难、吞咽无力、流口水、眼睛反复眨眼、凝视、肌张力运动缺乏、倒地震颤(slumpingtremor)、颤搐、或抽搐运动、肌肉僵硬或紧张、反复无目的的运动(称为自动症，涉及面部、手臂或腿)、惊厥、小便或大便失控、发汗、肤色改变(苍白或潮红)、瞳孔散大、咬舌、呼吸困难、心悸。在一些实施方案中，癫痫发作是轻度的。在其他实施方案中，癫痫发作是完全致残的或可能导致死亡。通常可以通过脑电图(EEG)上的异常发现来证明异常脑活动。
“副作用”意指除了期望效果以外的可归因于治疗的生理疾病和/或病症。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病和不适。例如，血清中升高的转氨酶水平可指示肝毒性或肝功能异常。例如，升高的胆红素可指示肝毒性或肝功能异常。
关于化合物的“单链”意指所述化合物仅具有一个寡核苷酸。“自身互补”意指至少部分与其自身杂交的寡核苷酸。由一个寡核苷酸组成的化合物是单链化合物，其中所述化合物的寡核苷酸是自身互补的。单链化合物也许能够与互补化合物结合以形成双链体。
“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。
“可特异性杂交”是指在寡核苷酸和靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导期望的作用，同时对非靶核酸表现出最小或没有作用的寡核苷酸。在某些实施方案中，特异性杂交在生理条件下发生。
“特异性抑制”靶核酸意指降低或阻断靶核酸的表达，同时对非靶核酸的减少显示较少、最小或没有作用，并且不一定指示靶核酸表达的彻底消除。
“标准细胞测定法”意指在实施例中描述的测定法及其合理的变化形式。
“标准体内实验”意指在实施例中描述的程序及其合理的变化形式。
“受试者”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和黑猩猩。
“糖部分”意指未修饰的糖部分或修饰的糖部分。“未修饰的糖部分”或“未修饰的糖”意指在RNA中发现的2'-OH(H)呋喃糖基(“未修饰的RNA糖部分”)或在DNA中发现的2'-H(H)部分(“未修饰的DNA糖部分”)。未修饰的糖部分在1’、3’和4’位置各自具有一个氢，在3’位置具有氧，并且在5’位置具有两个氢。“修饰的糖部分”或“修饰的糖”意指修饰的呋喃糖基糖部分或糖替代物。“修饰的呋喃糖基糖部分”意指包含代替未修饰的糖基部分的至少一个氢的非氢取代基的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，修饰的呋喃糖基糖部分为2’-取代的糖部分。这样的修饰的呋喃糖基糖部分包括双环糖和非双环糖。
“糖替代物”意指具有除了呋喃糖基部分以外的修饰的糖部分，其可以将核碱基连接至另一个基团，例如寡核苷酸中的核苷间键联、缀合物基团或末端基团。可以将包含糖替代物的修饰的核苷掺入到寡核苷酸内的一个或多个位置，并且这样的寡核苷酸能够与互补的低聚化合物或核酸杂交。
“皮下施用”意指刚好在皮肤下方施用。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”意指化合物与靶核酸的特异性杂交，以便诱导期望的作用。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶标”均意指能够被本文所述的化合物靶向的核酸。
“靶区域”意指一种或多种化合物靶向的靶核酸的一部分。
“靶区段”意指本文所述的化合物靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“末端基团”意指与寡核苷酸的末端共价连接的化学基团或原子团。
“治疗有效量”意指对受试者提供治疗益处的化合物、药剂或组合物的量。
“治疗”是指向受试者施用化合物或药物组合物以实现受试者中疾病、疾患或病症的改变或改善。
附图说明
图1A-1B是显示在P15(对于所有治疗组，n＝3)(图1A)和P35(ASO 1n＝4，ASO 2n＝4，ASO 3n＝1，未治疗的n＝3)(图1B)的对于SCN2A R1882Q突变为杂合的小鼠中SCN2A mRNA水平变化的图。将倍数变化归一化为与年龄匹配的未治疗野生型。所有小鼠均在P1-P2注射。
图2是显示归一化为未治疗的年龄匹配的Scn1a RX杂合小鼠的Scn2a mRNA减少的百分比的图。在P15时测量mRNA。N＝3个脑样品/治疗组。
图3是显示在用Scn2a下调的ASO(5μg)或错义ASO(50μg)注射后对于Scn1a为杂合的小鼠的存活百分比的图。在P1时所有小鼠接受注射，并追踪45天。
图4A是显示在P21时错义或mScn2a ASO治疗的Scn1a RX小鼠的体重的图。对于错义，N＝15，并且对于ASO，N＝18。
图4B是显示在P45时错义或mScn2a ASO治疗的Scn1a RX小鼠的体重的图。对于错义，N＝15，并且对于ASO，N＝18。
图5是显示在注射Scn2a下调的ASO(5μg；n＝9)或错义ASO(50μg；n＝17)后对于Scn1a为杂合的小鼠的癫痫发作次数的图。在P1时所有小鼠接受注射。
具体实施方式
应当理解的是，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且对于要求保护的实施方案是非限制性的。在本文中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
本文所用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。针对本文论述的文献的部分及其整体，将在本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文集以及GenBank和NCBI参考序列记录，特此明确地通过引用并入本文。
应当理解的是，在本文包含的实施例中每个SEQ ID NO中列出的序列独立于对糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰。这样，由SEQ ID NO定义的化合物可独立地包含对糖部分、核苷间键联或核碱基的一种或多种修饰。由ISIS号(ISIS#)描述的化合物指示核碱基序列、化学修饰和基序的组合。
本发明是基于在这样的发现靶向SCN2A基因寡核苷酸用于与SCN1A脑病治疗受试者有用的部分。因此，本发明的特征在于通过施用靶向SCN2A基因的寡核苷酸来预防和治疗受试者中SCN1A脑病的方法。
具体实施方式
某些实施方案提供了通过向受试者施用化合物或组合物来调节受试者的SCN1A脑病(例如，Dravet综合征)或其症状的方法、化合物和组合物，其中所述化合物或组合物包含SCN2A调节剂。SCN2A的调节可导致SCN2A水平或表达降低，从而降低SCN2A表达，从而治疗、预防、改善或延迟SCN1A脑病或其症状。在某些实施方案中，SCN2A调节剂是SCN2A特异性抑制剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子和其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，受试者为人。
在一些特定实施方案中，所述寡核苷酸相对于SCN1A前mRNA或mRNA对SCN2A前mRNA或mRNA具有选择性。在某些实施方案中，所述方法基本上不降低SCN1A表达。在某些实施方案中，受试者具有SCN1A的功能获得性突变。在某些实施方案中，受试者具有SCN1A的功能缺失性突变。
本文公开的某些实施方案提供了包含SCN2A调节剂的化合物或组合物。这样的化合物或组合物可用于治疗、预防、改善或延迟SCN1A脑病(例如，Dravet综合征)或其症状的发作。在某些实施方案中，化合物包含SCN2A特异性抑制剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、多肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的核酸。在某些实施方案中，核酸是单链的。在某些实施方案中，核酸是双链的。在某些实施方案中，化合物或组合物包含反义化合物。在任何前述实施方案中，化合物或组合物包含低聚化合物。在某些实施方案中，化合物或组合物包含靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是单链的。在某些实施方案中，化合物包含脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，化合物包含核糖核苷酸并且是双链的。在某些实施方案中，所述寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸是单链的。
在任何前述实施方案中，所述化合物可包含长度为8至80、10至30、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50或20至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，所述核苷间键联是硫代磷酸酯键联和磷酸酯键联。
在某些实施方案中，任何前述寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖包含2'-O-甲氧基乙基。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖是双环糖，例如4’-CH(CH
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施方案中，所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物或组合物包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸包含：a)由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由连接核苷组成的5’翼区段；和c)由连接核苷组成的3’翼区段。所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，至少一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，化合物包含长度为12至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物是反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物是单链的。在某些实施方案中，化合物是双链的。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸是长度为12至30个连接核苷。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，化合物或组合物与第二药剂共同施用。在某些实施方案中，化合物与第二药剂伴随施用。
在某些实施方案中，本文所述的靶向SCN2A的化合物和组合物可以用于抑制SCN2A在细胞中表达的方法。在某些实施方案中，本文所述的靶向SCN2A的化合物和组合物可以用于治疗、预防、延迟或改善与SCN1A相关的疾病或病症的方法，所述疾病或疾患包括但不限于Dravet综合征。
某些适应症
本文提供的某些实施方案涉及抑制SCN2A表达或活性的方法，所述方法可通过施用靶向SCN2A的化合物或组合物用于治疗、预防或改善受试者中与SCN1A相关的疾病。在某些实施方案中，这样的化合物或组合物包含SCN2A特异性抑制剂。在某些实施方案中，化合物包含靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物包含靶向SCN2A的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，抑制细胞中SCN2A表达或活性的方法包括使细胞与包含SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物接触，从而抑制细胞中SCN2A的表达或活性。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。在某些实施方案中，所述细胞在脑组织中。在某些实施方案中，所述细胞在受试者的脑组织中，所述受试者具有与SCN1A病症相关的疾病、疾患、病症、症状或生理标志物或具有如前所述这些风险。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是双链的。
在某些实施方案中，一种治疗、预防与SCN1A相关的一种或多种疾病、疾患、病症、症状或生理标志物、延迟其发作、延缓其进展或改善它们的方法包括向受试者施用包含SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物。在某些实施方案中，一种治疗、预防与受试者中SCN1A相关疾病或疾患有关的疾病、疾患、病症、症状或生理标志物、延迟其发作、延缓其进展或改善它们的方法包括向受试者施用包含SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物，从而治疗、预防所述疾病、延迟其发作、延缓其进展或改善所述疾病。在某些实施方案中，所述受试者被鉴定为具有所述疾病、疾患、病症、症状或生理标志物或具有如前所述这些风险。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。在某些实施方案中，将SCN2A特异性抑制剂经胃肠外施用于受试者。在某些实施方案中，胃肠外施用是脑室内施用。在某些实施方案中，胃肠外施用是鞘内施用。在某些实施方案中，胃肠外施用是皮下施用。在某些实施方案中，受试者为人。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂包含靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是双链的。
在某些实施方案中，一种在受试者中进行的方法，其减轻癫痫发作、减少肌阵挛或肌肉痉挛、缓解行走困难(周围神经病)、痉挛状态，减轻痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆，缓解言语困难，减轻幻视或预防其发作，治疗、减轻进行性神经变性或预防其发作，治疗、减轻控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作，减轻张力减低，改善肌张力，减轻肝脏肿大或预防其发作，减少心脏缺陷或预防其发作，减轻或预防细胞中聚葡聚糖体的积累，改善或预防认知退化，以及减轻共济失调，或上述各项的组合，包括向受试者施用包括SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的癫痫发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减少受试者的肌阵挛或肌肉痉挛。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的行走困难。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的周围神经病。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的痉挛状态。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的言语困难。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的幻视或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的进行性神经变性或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的张力减低或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物改善受试者的肌张力。在某些实施方案中，施用化合物或组合物改善或预防认知退化。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗或减轻受试者的共济失调。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻或预防以下一者或多者：持续性癫痫、癫痫频繁发作、行为和发育迟缓、运动和平衡问题、骨科病症、语言和言语迟缓问题、生长和营养问题、睡眠困难、慢性感染、感觉统合失调、自主神经系统的破坏和发汗。在某些实施方案中，受试者被鉴定为具有与SCN1A相关的疾病、疾患、病症、症状或生理标志物或具有如前所述这些风险。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。在某些实施方案中，将SCN2A特异性抑制剂经胃肠外施用于受试者。在某些实施方案中，胃肠外施用是脑室内施用。在某些实施方案中，胃肠外施用是鞘内施用。在某些实施方案中，施用是髓内施用。在某些实施方案中，胃肠外施用是皮下施用。在某些实施方案中，受试者为人。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是双链的。
在某些实施方案中，施用本文公开的化合物或组合物减少癫痫发作、减少肌阵挛或肌肉痉挛、缓解行走困难，缓解痉挛状态，减轻痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆，缓解言语困难，减轻幻视或预防其发作，治疗、减轻进行性神经变性或预防其发作，治疗、减轻控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作，减轻张力减低，改善肌张力，改善认知退化，以及减轻共济失调，或上述各项的组合。在某些实施方案中，癫痫发作独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，肌阵挛或肌肉痉挛独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，行走困难独立地缓解至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，痉挛状态独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，言语困难独立地缓解至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，幻视独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，进行性神经变性独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，痴呆进展独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，膀胱功能神经损伤独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，张力减低独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，认知退化独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，共济失调独立地减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％或至少50％。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。
某些实施方案提供了用于治疗中的本文所述的化合物和组合物。某些实施方案涉及一种包含SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物，用于治疗、预防与SCN1A相关的一种或多种疾病、疾患、病症、症状或生理标志物、延迟其发作、延缓其进展或改善它们。某些实施方案涉及用于治疗、预防SCN1A疾病或疾患或其症状或生理标志物、延迟其发作，减缓其进展或改善它们的化合物或组合物。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。
在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是双链的。
某些实施方案涉及包含SCN2A特异性抑制剂的化合物或组合物，其用于受试者中用于减轻癫痫发作，减少肌阵挛或肌肉痉挛，缓解行走困难，减轻痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆，缓解言语障碍，减轻幻视或预防其发作，治疗、减轻进行性神经变性或预防其发作，治疗、减轻控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作，减轻张力减低，改善肌张力，改善或预防认知退化，以及减轻共济失调，或上述各项的组合。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的癫痫发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减少受试者的肌阵挛或肌肉痉挛。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的行走困难。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆。在某些实施方案中，施用化合物或组合物缓解受试者的言语困难。在某些实施方案中，施用化合物或组合物减轻受试者的幻视或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的进行性神经变性或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻或预防受试者的张力减低。在某些实施方案中，施用化合物或组合物改善受试者的肌张力。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。在某些实施方案中，施用化合物或组合物改善或预防认知退化。在某些实施方案中，施用化合物或组合物治疗、减轻受试者的共济失调。在某些实施方案中，受试者被鉴定为具有与SCN1A疾病或疾患相关的疾病、疾患、病症、症状或生理标志物或具有如前所述这些风险。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A的表达或活性的药剂。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，SCN2A特异性抑制剂是靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物可以是双链的。
某些实施方案涉及本文所述的化合物或组合物在制造或制备用于治疗的药物中的用途。某些实施方案涉及本文所述的化合物或组合物在制造或制备用于治疗、预防与SCN1A相关的一种或多种疾病、疾患、病症、症状或生理标志物、延迟其发作、延缓其进展或改善它们的药物中的用途。在某些实施方案中，本文所述的化合物或组合物用于制造或制备用于治疗、改善、延迟或预防SCN1A疾病或疾患的药物。在某些实施方案中，SCN1A疾病或疾患是Dravet综合征。在某些实施方案中，SCN1A疾病是癫痫。在某些实施方案中，SCN1A疾病是全身性癫痫伴热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是家族性热性惊厥。在某些实施方案中，SCN1A疾病是婴儿早期癫痫脑病6型。在某些实施方案中，化合物或组合物包含核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A表达或活性的药剂。在某些实施方案中，化合物或组合物包含靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物或组合物包含靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物可以是双链的。
某些实施方案涉及用于药物的制造或制备的化合物或组合物的用途，所述药物用于具有SCN1A疾病或疾患或具有SCN1A疾病或疾患风险的受试者中，用于减轻癫痫发作，减少肌阵挛或肌肉痉挛，缓解行走困难，减轻痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆，缓解言语障碍，减轻幻视或预防其发作，治疗、减轻进行性神经变性或预防其发作，治疗、减轻控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作，减轻张力减低，改善肌张力，改善或预防认知退化，以及减轻共济失调，或上述各项的组合。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于减轻受试者的癫痫发作的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于减轻受试者的肌阵挛或肌肉痉挛的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于缓解受试者的行走困难的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于减轻受试者的痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于缓解受试者的言语困难的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于减轻受试者的幻视或预防其发作的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于治疗、减轻受试者的进行性神经变性或预防其发作的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于治疗、减轻受试者的控制膀胱功能的神经损伤或预防其发作的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于治疗、减轻或预防受试者的张力减低的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备用于改善受试者的肌张力的药物中的用途。某些实施方案涉及化合物或组合物在制造或制备减轻受试者的共济失调的药物中的用途。在某些实施方案中，所述细胞是神经元。在某些实施方案中，化合物或组合物包含核酸、肽、抗体、小分子或其他能够抑制SCN2A表达或活性的药剂。在某些实施方案中，化合物或组合物包含靶向SCN2A的反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物或组合物包含靶向SCN2A的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为8至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物或组合物包含长度为10至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物可以是单链的。在某些实施方案中，包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物可以是双链的。
在任何前述方法或用途中，化合物或组合物可包含靶向SCN2A的反义化合物。在某些实施方案中，化合物包含寡核苷酸，例如由8至80个连接核苷、10至30个连接核苷、12至30个连接核苷或20个连接核苷组成的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联、至少一个修饰的糖和/或至少一个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键，修饰的糖是双环糖或2’-O-甲氧基乙基，并且修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含由连接脱氧核苷组成的缺口区段；由连接核苷组成的5’翼区段；以及由连接核苷组成的3’翼区段，其中所述缺口区段定位于紧邻所述5’翼区段和所述3’翼区段并且在这两者之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，化合物可包含长度为12至80个连接核苷的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，化合物是反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物是单链的。在某些实施方案中，化合物是双链的。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸是长度为12至30个连接核苷。在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在任何前述方法或用途中，化合物或组合物包含长度为12至30个连接核苷的修饰的寡核苷酸或由其组成，其中所述修饰的寡核苷酸包含：
由连接的2’-脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接核苷组成的5’翼区段；以及
由连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在任何前述方法或用途中，化合物或组合物可以经胃肠外施用。例如，在某些实施方案中，化合物或组合物可以通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用。在某些实施方案中，化合物或组合物与第二药剂共同施用。在某些实施方案中，化合物或组合物以及第二药剂伴随施用。在任何前述方法或用途中，化合物或组合物可以经鞘内施用。在任何前述方法或用途中，化合物或组合物可以经髓内施用。在任何前述方法或用途中，化合物或组合物可以经脑室内施用。
某些化合物
在某些实施方案中，本文所述的化合物是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物包含低聚化合物或由其组成。在某些实施方案中，低聚化合物包含修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施方案中，化合物或反义化合物是单链的。这样的单链化合物或反义化合物包含低聚化合物或由其组成。在某些实施方案中，这样的低聚化合物包含寡核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是修饰的。在某些实施方案中，单链反义化合物或低聚化合物的寡核苷酸包含自身互补的核碱基序列。
在某些实施方案中，化合物是双链的。这样的双链化合物包含具有与靶核酸互补的区域的第一修饰的寡核苷酸和具有与所述第一修饰的寡核苷酸互补的区域的第二修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在这样的实施方案中，修饰的寡核苷酸中的胸腺嘧啶核碱基被尿嘧啶核碱基替换。在某些实施方案中，化合物包含缀合物基团。在某些实施方案中，每个修饰的寡核苷酸的长度为12-30个连接核苷。
在某些实施方案中，化合物是双链的。这样的双链化合物包含具有与靶核酸互补的区域的第一低聚化合物和具有与所述第一低聚化合物互补的区域的第二低聚化合物。这样的双链化合物的第一低聚化合物通常包含修饰的寡核苷酸或由其组成。这样的双链化合物的第二低聚化合物的寡核苷酸可以是修饰的或未被修饰。双链化合物的低聚化合物可包括非互补的突出端核苷。
单链和双链化合物的实例包括但不限于寡核苷酸、siRNA、靶向寡核苷酸的microRNA、单链RNAi化合物，例如小发夹RNA(shRNA)、单链siRNA(ssRNA)和microRNA模拟物。
在某些实施方案中，本文描述的化合物具有核碱基序列，当以5'至3'方向书写时，所述核碱基序列包含其靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为10至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为12至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为12至22个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为14至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为14至20个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为15至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为15至20个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为16至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为16至20个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为17至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为17至20个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为18至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为18至21个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为18至20个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为20至30个连接亚基的寡核苷酸。换句话说，这样的寡核苷酸分别为12至30个连接亚基、14至30个连接亚基、14至20个亚基、15至30个亚基、15至20个亚基、16至30个亚基、16至20个亚基、17至30个亚基、17至20个亚基、18至30个亚基、18至20个亚基、18至21个亚基、20至30个亚基或12至22个连接亚基。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为14个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为16个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为17个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为18个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为19个连接亚基的寡核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的化合物包含长度为20个连接亚基的寡核苷酸。在其他实施方案中，本文所述的化合物包含8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50或20至30个连接亚基的寡核苷酸。在某些这样的实施方案中，本文所述的化合物包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个(或由上述任意两个值定义的范围)连接亚基的寡核苷酸。在一些实施方案中，连接亚基是核苷酸、核苷或核碱基。
在某些实施方案中，可以将化合物缩短或截短。例如，可以在5’端(5’截短)或者可替代地在3’端(3’截短)缺失单个亚基。对于靶向SCN2A核酸的缩短或截短的化合物，可在化合物的5'端缺失两个亚基，或者可替代地在3'端缺失两个亚基。可替代地，缺失核苷可分散在整个化合物中。
当加长的化合物中存在单个另外的亚基时，所述另外的亚基可以位于化合物的5'或3'端。当存在两个或更多个另外的亚基时，例如，在具有两个添加到化合物的5'端(5'添加)或者可替代地3'端(3'添加)的亚基的化合物中，添加的亚基可以彼此相邻。可替代地，添加的亚基可分散在整个化合物中。
可能的是，增加或降低诸如寡核苷酸的化合物的长度和/或引入错配碱基而不消除活性(Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992；Gautschi等人，.J.Natl.Cancer Inst.93:463-471，2001年3月；Maher和Dolnick Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)。然而，似乎在寡核苷酸序列、化学结构和基序方面的小的变化可以使临床开发所需的许多特性中的一个或多个产生很大差异(Seth等人，J.Med.Chem.52，10，2009；Egli等人，J.Am.Chem.Soc.，133，16642，2011)。
在某些实施方案中，本文所述的化合物是干扰RNA化合物(RNAi)，其包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。这样的化合物至少部分地通过RISC途径起作用以降解和/或螯合靶核酸(因此，包括microRNA/microRNA模拟化合物)。如本文所用，术语siRNA意味着等同于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，所述核酸分子例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)，等等。另外，如本文所用，术语RNAi意味着等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学。
在某些实施方案中，双链化合物包含第一链和第二链，所述第一链包含与SCN2A核酸的靶区域互补的核碱基序列。在某些实施方案中，双链化合物包含核糖核苷酸，其中第一链具有代替胸腺嘧啶(T)的尿嘧啶(U)，并且与靶区域互补。在某些实施方案中，双链化合物包含(i)第一链，所述第一链包含与SCN2A核酸的靶区域互补的核碱基序列和(ii)第二链。在某些实施方案中，双链化合物包含一个或多个修饰的核苷酸，其中糖中的2'位含有卤素(例如氟基；2'-F)或含有烷氧基(例如甲氧基；2'-OMe)。在某些实施方案中，双链化合物包含至少一个2'-F糖修饰和至少一个2'-OMe糖修饰。在某些实施方案中，所述至少一个2'-F糖修饰和至少一个2'-OMe糖修饰沿dsRNA化合物链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基以交替方式排列。在某些实施方案中，双链化合物在天然存在的磷酸二酯键联以外的相邻核苷酸之间包含一个或多个键联。这样的键联的例子包括磷酰胺、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键联。双链化合物也可以是如美国专利第6,673,661号中教导的化学修饰的核酸分子。在其他实施方案中，dsRNA含有一条或两条封端链，例如，如2000年4月19日提交的WO 00/63364公开的。在某些实施方案中，双链化合物的第一链是siRNA引导链，而双链化合物的第二链是siRNA过客链。在某些实施方案中，双链化合物的第二链与第一链互补。在某些实施方案中，双链化合物的每条链由16、17、18、19、20、21、22或23个连接核苷组成。
在某些实施方案中，本文所述的单链化合物可包含靶向本文所述的SCN2A的任何寡核苷酸序列。在某些实施方案中，这样的单链化合物是单链RNAi(ssRNAi)化合物。在某些实施方案中，ssRNAi化合物包含与SCN2A核酸的靶区域互补的核碱基序列。在某些实施方案中，ssRNAi化合物包含核糖核苷酸，其中尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。在某些实施方案中，ssRNAi化合物包含与SCN2A核酸的靶区域互补的核碱基序列。在某些实施方案中，ssRNAi化合物包含一个或多个修饰的核苷酸，其中糖中的2'位含有卤素(例如氟基；2'-F)或含有烷氧基(例如甲氧基；2'-OMe)。在某些实施方案中，ssRNAi化合物包含至少一个2'-F糖修饰和至少一个2'-OMe糖修饰。在某些实施方案中，所述至少一个2'-F糖修饰和至少一个2'-OMe糖修饰沿ssRNAi化合物链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核碱基以交替方式排列。在某些实施方案中，ssRNAi化合物在天然存在的磷酸二酯键联以外的相邻核苷酸之间包含一个或多个键联。这样的键联的例子包括磷酰胺、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键联。ssRNAi化合物也可以是如美国专利第6,673,661号中教导的化学修饰的核酸分子。在其他实施方案中，ssRNAi含有封端链，例如，如2000年4月19日提交的WO 00/63364公开的。在某些实施方案中，ssRNAi化合物由16、17、18、19、20、21、22或23个连接核苷组成。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸。某些修饰的寡核苷酸具有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构构型，所述其他立体异构构型可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、α或β(例如对于糖端基异构体)或定义为(D)或(L)(例如对于氨基酸)等。在本文提供的修饰的寡核苷酸中包括所有这样的可能的异构体，包括其外消旋形式和光学纯形式，除非另有说明。同样，还包括所有顺式和反式异构体以及互变异构形式。
某些机制
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，本文所述的化合物是反义化合物。在某些实施方案中，这样的反义化合物包括低聚化合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性。在某些实施方案中，本文所述的化合物选择性地影响一种或多种靶核酸。这样的选择性化合物包含这样的核碱基序列，所述核碱基序列与一种或多种靶核酸杂交从而产生一种或多种期望的反义活性并且不与一种或多种非靶核酸杂交或不以导致显著的不希望的反义活性的方式与一种或多种非靶核酸杂交。
在某些反义活性中，本文所述的化合物与靶核酸的杂交导致裂解靶核酸的蛋白质的募集。例如，本文所述的某些化合物导致RNA酶H介导的靶核酸裂解。RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。这样的RNA:DNA双链体中的DNA不必是未修饰的DNA。在某些实施方案中，本文所述的化合物足够“类似于DNA”，以引出RNA酶H活性。此外，在某些实施方案中，在缺口聚物的缺口中的一个或多个非DNA样核苷是容许的。
在某些反义活性中，将本文所述的化合物或所述化合物的一部分加载至RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，最终导致靶核酸裂解。例如，本文所述的某些化合物导致靶核酸被Argonaute裂解。加载到RISC中的化合物是RNAi化合物。RNAi化合物可以是双链(siRNA)或单链(ssRNA)。
在某些实施方案中，本文所述的化合物与靶核酸的杂交未导致裂解该靶核酸的蛋白质的募集。在某些这样的实施方案中，化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸剪接的改变。在某些实施方案中，化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸与蛋白质或其他核酸之间的结合相互作用的抑制。在某些这样的实施方案中，化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸翻译的改变。
可以直接或间接地观察到反义活性。在某些实施方案中，反义活性的观察或检测涉及观察或检测靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白质的量的变化、核酸或蛋白质的剪接变体比率的变化和/或细胞或动物的表型变化。
靶核酸、靶区域和核苷酸序列
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在某些实施方案中，靶核酸是内源性RNA分子。在某些这样的实施方案中，靶核酸选自：mRNA和前mRNA，包括内含子区、外显子区和非翻译区。在某些实施方案中，靶核酸是前mRNA。在某些这样的实施方案中，靶区域完全在内含子内。在某些实施方案中，靶区域跨越内含子/外显子连接。在某些实施方案中，靶区域是内含子内的至少50％。
编码SCN2A的人基因序列在本领域中有描述(HGNC:10588；Entrez Gene:6326；Ensembl:ENSG00000136531；OMIM:182390；UniProtKB:Q99250)。因此，SCN2A的mRNA转录物可以称为SCN2A mRNA或NAV1.2 mRNA，包括前mRNA。SCN2A mRNA包括例如编码GenBank NP_066287.2的序列(例如，GenBank NM_021007.2,GI:93141209)，以及其他mRNA剪接/转录物变体(例如，GenBank登录号：NM_001040143.1,GI:93141213；NM_001040142.1,GI:93141211；或其他已知变体)。因此，SCN2A的mRNA转录物可以称为SCN2A mRNA或NAV2.1mRNA，包括前mRNA。
编码SCN1A的人基因序列在本领域中有描述(HGNC:10585；Entrez Gene 6323；Ensembl:ENSG00000144285；OMIM:182389；UniProtKB:P35498)。因此，SCN1A的mRNA转录物可以称为SCN1A mRNA或NAV1.1 mRNA，包括前mRNA。
杂交
在一些实施方案中，杂交发生在本文公开的化合物与SCN2A核酸之间。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合)。
杂交可以发生在不同条件下。杂交条件是序列依赖性的，并由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性地杂交的方法是本领域熟知的。在某些实施方案中，本文提供的化合物可与SCN2A核酸特异性地杂交。
互补性
当一个寡核苷酸或其一个或多个区域的核苷碱基序列与另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核苷碱基序列匹配时(此时所述两个核苷碱基序列在相反方向上对齐)，这样的寡核苷酸被说成是与另一个核酸互补。如本文所述，除非另有说明，否则核碱基匹配或互补核碱基限于：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)。互补寡核苷酸和/或核酸不必在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。当这样的寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配时，所述寡核苷酸是完全互补或100％互补的。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施方案中，本文所述的化合物是反义化合物。在某些实施方案中，化合物包括低聚化合物。化合物与SCN2A核酸之间的非互补核碱基是可容许的，前提是所述化合物保持能够特异性地与靶核酸杂交。而且，化合物可在SCN2A核酸的一个或多个区段上杂交，使得中间区段或相邻区段不涉及杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的化合物或其特定部分与SCN2A核酸、靶区域、靶区段或其指定部分有(或至少有)70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。可以使用常规方法确定化合物与靶核酸的互补性百分比。
例如，这样的化合物将表现出90％互补性，其中所述化合物的20个核碱基中的18个与靶区域互补并且因此将特异性地杂交。在此实例中，剩余的非互补核碱基与互补核碱基可以成簇或间隔，并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。这样，长度为18个核碱基、具有侧翼与靶核酸完全互补的两个区域的四个非互补核碱基的化合物将与靶核酸具有77.8％的整体互补性，因此将落入本发明的范围内。化合物与靶核酸区域的互补性百分比可常规地使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性百分比可以通过例如Gap程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来确定，所述Gap程序使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)。
在某些实施方案中，本文所述的化合物或其特定部分与靶核酸或其特定部分完全互补(即100％互补)。例如，化合物可以与SCN2A核酸或其靶区域或靶区段或靶序列完全互补。如本文所用，“完全互补”意指化合物的每个核碱基能够与靶核酸的相应核碱基精确碱基配对。例如，只要存在与化合物完全互补的靶核酸的相应的20个核碱基部分，则20个核碱基的化合物与长400个核碱基的靶序列完全互补。关于第一和/或第二核酸的特定部分，也可以采用完全互补。例如，30个核碱基的化合物的20个核碱基的部分可以与长400个核碱基的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有相应的20个核碱基部分，其中每个核碱基与化合物的20个核碱基部分互补，则该30个核碱基化合物的20个核碱基部分与靶序列完全互补。同时，取决于化合物的剩余的10个核碱基是否也与靶序列互补，整个30个核碱基的化合物可以与靶序列完全互补或可以不完全互补。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含相对于靶核酸的一个或多个错配的核碱基。在某些这样的实施方案中，通过这样的错配降低了针对靶标的反义活性，但是针对非靶标的活性被更大量地降低。因此，在某些这样的实施方案中，化合物的选择性得以提高。在某些实施方案中，将错配特异性地定位在具有缺口聚物基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施方案中，错配位于距离缺口区的5'端的位置1、2、3、4、5、6、7或8。在某些这样的实施方案中，错配位于距离缺口区的3'端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1。在某些这样的实施方案中，错配位于距离翼区的5'端的位置1、2、3或4。在某些这样的实施方案中，错配位于距离翼区的3'端的位置4、3、2或1。在某些实施方案中，将错配特异性地定位在不具有缺口聚物基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施方案中，错配位于距离寡核苷酸的5'端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在某些这样的实施方案中，错配位于距离寡核苷酸的3'端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
非互补核碱基的位置可位于化合物的5'端或3'端。或者，一个或多个非互补核碱基可以在化合物的内部位置。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即，连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，本文所述的长度为(或最多为)11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的化合物包含相对于靶核酸(例如SCN2A核酸)或其指定部分的不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，本文所述的长度为(或最多为)11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的化合物包含相对于靶核酸(例如SCN2A核酸)或其指定部分的不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，本文所述的化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些。如本文所述，“部分”是指靶核酸的区域或区段内的限定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”也可以是指化合物的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少8个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少9个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少10个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少11个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少12个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少13个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少14个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少15个核碱基部分互补。在某些实施方案中，化合物与靶区段的至少16个核碱基部分互补。还考虑了与靶区段的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个(或由这些值的任何两个所限定的范围)核碱基部分互补的化合物。
同一性
本文提供的化合物还可以与特定的核苷酸序列、SEQ ID NO或由具体的Isis号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。在某些实施方案中，本文所述的化合物是反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物是修饰的寡核苷酸。如本文所用，如果化合物具有相同的核碱基配对能力，则其与本文公开的序列相同。例如，含有代替了公开DNA序列中的胸苷的尿嘧啶的RNA被认为与DNA序列相同，因为尿嘧啶和胸苷都与腺嘌呤配对。还考虑了本文所述的化合物的缩短和加长形式以及具有相对于本文提供的化合物的不同碱基的化合物。所述不同的碱基可以彼此相邻或分散在整个化合物中。根据相对于待比较序列具有相同碱基配对的碱基数，计算出化合物的同一性百分比。
在某些实施方案中，本文所述的化合物或其部分与本文公开的一个或多个化合物或SEQ ID NO或其部分具有(或至少具有)70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在某些实施方案中，本文所述的化合物与特定的核苷酸序列、SEQ ID NO、或由具体的Isis号表示的化合物或其部分具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或这样的值之间的任意百分比)的同一性，其中所述化合物包含具有一个或多个错配核碱基的寡核苷酸。在某些这样的实施方案中，错配位于距离寡核苷酸的5'端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在某些这样的实施方案中，错配位于距离寡核苷酸的3'端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
在某些实施方案中，本文所述的化合物是反义化合物。在某些实施方案中，将化合物的一部分与靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基部分与靶核酸的等长部分进行比较。
在某些实施方案中，本文所述的化合物是寡核苷酸。在某些实施方案中，将寡核苷酸的一部分与靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基部分与靶核酸的等长部分进行比较。
某些修饰的化合物
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含由连接核苷组成的寡核苷酸或由其组成。寡核苷酸可以是未修饰的寡核苷酸(RNA或DNA)或可以是修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸相对于未修饰的RNA或DNA包含至少一个修饰(即，包含至少一个修饰的核苷(包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基)和/或至少一个修饰的核苷间键联)。
A.修饰的核苷
修饰的核苷包含修饰的糖部分或修饰的核碱基或修饰的糖部分和修饰的核碱基两者。
1.修饰的糖部分
在某些实施方案中，糖部分是非双环的修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分是双环或三环的糖部分。在某些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。这样的糖替代物可包含一个或多个取代，所述一个或多个取代对应于其他类型的修饰的糖部分的那些取代。
在某些实施方案中，修饰的糖部分是非双环的修饰的糖部分，其包含具有一个或多个无环取代基的呋喃糖基环，所述无环取代基包括但不限于在2'、4'和/或5'位置的取代基。在某些实施方案中，非双环的修饰的糖部分的一个或多个无环取代基是分支的。适合于非双环的修饰的糖部分的2'-取代基的实例包括但不限于：2’-F、2'-OCH
在某些实施方案中，2’-取代的核苷或2’-非双环修饰的核苷包含这样的糖部分，所述糖部分包含选自下列基团的直链2’-取代基：F、NH
在某些实施方案中，2’-取代的核苷或2’-非双环修饰的核苷包含这样的糖部分，所述糖部分包含选自下列基团的直链2’-取代基：F、OCF
在某些实施方案中，2’-取代的核苷或2’-非双环修饰的核苷包含这样的糖部分，所述糖部分包含选自下列基团的直链2’-取代基：F、OCH
包含修饰的糖部分(例如非双环修饰的糖部分)的核苷通过核苷的糖部分上的取代位置来标识。例如，包含2′-取代的或2-修饰的糖部分的核苷被称为2′-取代的核苷或2-修饰的核苷。
某些修饰的糖部分包含桥接糖取代基，所述桥接糖取代基形成第二环，从而产生双环糖部分。在某些这样的实施方案中，双环糖部分包含在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间的桥。这样的4'至2'桥接糖取代基的实例包括但不限于：4'-CH
在某些实施方案中，这样的4’至2’桥独立地包含1至4个连接基团，所述基团独立地选自：-[C(R
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
每个R
另外的双环糖部分是本领域已知的，参见，例如：Freier等人，Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4429-4443，Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740，Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.,20017,129,8362-8379；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wengel等人，U.S.7,053,207,Imanishi等人，U.S.6,268,490,Imanishi等人，U.S.6,770,748,Imanishi等人，U.S.RE44,779；Wengel等人，U.S.6,794,499,Wengel等人，U.S.6,670,461；Wengel等人，U.S.7,034,133,Wengel等人，U.S.8,080,644；Wengel等人，U.S.8,034,909；Wengel等人，U.S.8,153,365；Wengel等人，U.S.7,572,582；和Ramasamy等人，U.S.6,525,191，Torsten等人，WO2004/106356，Wengel等人，WO 91999/014226；Seth等人，WO 2007/134181；Seth等人，U.S.7,547,684；Seth等人，U.S.7,666,854；Seth等人，U.S.8,088,746；Seth等人，U.S.7,750,131；Seth等人，U.S.8,030,467；Seth等人，U.S.8,268,980；Seth等人，U.S.8,546,556；Seth等人，U.S.8,530,640；Migawa等人，U.S.9,012,421；Seth等人，U.S.8,501,805；以及美国专利公布Allerson等人的第US2008/0039618号和Migawa等人的第US2015/0191727号。
在某些实施方案中，通过异构体构型进一步定义双环糖部分和掺入这样的双环糖部分的核苷。例如，LNA核苷(本文描述)可以呈α-L构型或呈β-D构型。
已将α-L-亚甲氧基(4’-CH
在某些实施方案中，修饰的糖部分包含一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5’-取代的糖和4’-2’桥接的糖)。
在某些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。在某些这样的实施方案中，糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子替换。在某些这样的实施方案中，这样的修饰的糖部分还包含如本文所述的桥接取代基和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和在2'-位置(参见，例如，Bhat等人，U.S.7,875,733和Bhat等人，U.S.7,939,677)和/或5'位置的取代。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有除了5个原子以外的环。例如，在某些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃(“THP”)。这样的四氢吡喃可被进一步修饰或取代。包含这样的修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、anitol核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见例如，Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.2002,10,841-854)、氟HNA:
(“F-HNA”，参见例如，Swayze等人，U.S.8,088,904；Swayze等人，U.S.8,440,803；Swayze等人；以及Swayze等人，U.S.9,005,906，F-HNA也可称为F-THP或3'-氟四氢吡喃)和包含另外的修饰的THP化合物的核苷，所述THP化合物具有下式：
其中，对于每个所述修饰的THP核苷，独立地：Bx是核碱基部分；T
在某些实施方案中，提供了修饰的THP核苷，其中q
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在寡核苷酸中的使用(参见，例如，Braasch等人，Biochemistry,2002，41,4503-4510和Summerton等人，U.S.5,698,685；Summerton等人，U.S.5,166,315；Summerton等人，U.S.5,185,444；和Summerton等人，U.S.5,034,506)。如在此所用，术语“吗啉代”意指具有以下结构的糖替代物：
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。这样的糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
在某些实施方案中，糖替代物包含无环部分。包含这样的无环糖替代物的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、无环丁基核酸(参见，例如Kumar等人，Org.Biomol.Chem.,2013,11,5853-5865)、以及在Manoharan等人，WO2011/133876中描述的核苷和寡核苷酸。
可用于修饰的核苷中的许多其他的双环和三环的糖和糖替代物环系统是本领域已知的。
2.修饰的核碱基
核碱基(或碱基)的修饰或取代在结构上与天然存在的或合成的未修饰核碱基可区别，但在功能上可以互换。天然和修饰的核碱基两者都能够参与氢键合。这样的核碱基修饰可以对本文所述的化合物赋予核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含未修饰核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含修饰核碱基的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个不包含核碱基的核苷，称为无碱基核苷。
在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-N-甲基鸟嘌呤、6-N-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(C≡C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤，5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、6-N-苯甲酰腺嘌呤、2-N-异丁酰鸟嘌呤、4-N-苯甲酰胞嘧啶、4-N-苯甲酰尿嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰胞嘧啶、5-甲基4-N-苯甲酰尿嘧啶、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、尺寸扩大的(size-expanded)碱基和氟化碱基。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-clamp)。修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮替换的那些。另外的核碱基包括在Merigan等人，U.S.3,687,808中公开的那些，在下列文献中公开的那些：The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,Kroschwitz,J.I.,Ed.,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research andApplications,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，CRC Press,1993,273-288；以及在Antisense Drug Technology,Crooke S.T.编辑，CRC Press,2008,163-166和442-443，第6章和15章中公开的那些。
教导某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的制备的出版物包括但不限于，Manoharan等人，US2003/0158403,Manoharan等人，US2003/0175906；Dinh等人，U.S.4,845,205；Spielvogel等人，U.S.5,130,302；Rogers等人，U.S.5,134,066；Bischofberger等人，U.S.5,175,273；Urdea等人，U.S.5,367,066；Benner等人，U.S.5,432,272；Matteucci等人，U.S.5,434,257；Gmeiner等人，U.S.5,457,187；Cook等人，U.S.5,459,255；Froehler等人，U.S.5,484,908；Matteucci等人，U.S.5,502,177；Hawkins等人，U.S.5,525,711；Haralambidis等人，U.S.5,552,540；Cook等人，U.S.5,587,469；Froehler等人，U.S.5,594,121；Switzer等人，U.S.5,596,091；Cook等人，U.S.5,614,617；Froehler等人，U.S.5,645,985；Cook等人，U.S.5,681,941；Cook等人，U.S.5,811,534；Cook等人，U.S.5,750,692；Cook等人，U.S.5,948,903；Cook等人，U.S.5,587,470；Cook等人，U.S.5,457,191；Matteucci等人，U.S.5,763,588；Froehler等人，U.S.5,830,653；Cook等人，U.S.5,808,027；Cook等人，6,166,199；和Matteucci等人，U.S.6,005,096。
在某些实施方案中，靶向SCN2A核酸的化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联是3'至5'磷酸二酯键联。在某些实施方案中，由于期望的特性，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力以及在存在核酸酶的情况下增加的稳定性，通常选择具有一个或多个修饰的(即，非天然存在的)核苷间键联的本文所述的化合物，而不是具有天然存在的核苷间键联的化合物。
在某些实施方案中，靶向SCN2A核酸的化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，化合物的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸。具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具有磷原子的核苷间键联。代表性的含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷的键联的方法是熟知的。
在某些实施方案中，可使用任何核苷间键联将修饰的寡核苷酸的核苷连接在一起。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类核苷间连接基团。代表性的含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸酯，包括磷酸二酯键(“P＝O”)(也称为未修饰的或天然存在的键联)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(“P＝S”)、以及二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；和N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然存在的磷酸酯键联相比，修饰的核苷间键联可用于改变(通常为增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的核苷间键联可制备为外消旋混合物或制备为单独的对映异构体。代表性手性核苷间键联包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷的核苷间键联的方法是本领域技术人员熟知的。
中性核苷间键联包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、甲缩醛(3'-O-CH2-O-5')、甲氧基丙基以及硫代甲缩醛(3'-S-CH2-O-5')。另外的中性核苷间键联包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯以及酰胺的非离子键联(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook,Eds.,ACS Symposium Series 580；第3章和第4章，40-65)。另外的中性核苷间键联包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式沿着寡核苷酸或其区域排列的修饰的核苷间键联或修饰的核苷间键联基序。在某些实施方案中，核苷间键联以带缺口的基序排列。在这样的实施方案中，两个翼区的每一个中的核苷间键联不同于缺口区中的核苷间键联。在某些实施方案中，在所述翼中的核苷间键联是磷酸二酯并且在所述缺口中的核苷间键联是硫代磷酸酯。核苷基序是经独立选择的，因此这样的具有带缺口的核苷间键联基序的寡核苷酸可以具有或可以不具有带缺口的核苷基序，并且如果确实具有带缺口的核苷基序，则翼长和缺口长度可以相同或可以不相同。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有均匀修饰的核苷间键联的区域。在某些这样的实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联均匀连接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯均匀连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸至少包含具有至少一个12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些这样的实施方案中，至少一个这样的嵌段位于寡核苷酸的3’端。在某些这样的实施方案中，至少一个这样的嵌段位于寡核苷酸的3’端的3个核苷内。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个甲基膦酸酯(methylphosponate)键联。在某些实施方案中，具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸包含这样的键联基序，所述键联基序包含除一个或两个甲基膦酸酯键联以外的所有硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，一个甲基膦酸酯键联位于具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施方案中，期望的是将硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联的数目安排为保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望的是将硫代磷酸酯核苷间键联的数目和位置以及磷酸二酯核苷间键联的数目和位置安排为保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，可减少硫代磷酸酯核苷间键联的数目，并且可增加磷酸二酯核苷间键联的数目。在某些实施方案中，可减少硫代磷酸酯核苷间键联的数目，并且可增加磷酸二酯核苷间键联的数目，同时仍然保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望的是减少硫代磷酸酯核苷间键联的数目，同时保留核酸酶抗性。在某些实施方案中，期望的是增加磷酸二酯核苷间键联的数目，同时保留核酸酶抗性。
B.某些基序
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸。寡核苷酸可具有基序，例如，未修饰和/或修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键联的模式。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含包括修饰的糖的一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含包括修饰的核碱基的一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键联。在这样的实施方案中，修饰的寡核苷酸的修饰的、未修饰的和不同修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键联定义了模式或基序。在某些实施方案中，糖部分、核碱基和核苷间键联的模式各自彼此独立。因此，修饰的寡核苷酸可通过其糖基序、核碱基基序和/或核苷间键联基序加以描述(如本文所用，核碱基基序描述了独立于核碱基序列的核碱基修饰)。
1.某些糖基序
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或糖基序沿着寡核苷酸或其区域排列的一种或多种类型的修饰的糖部分和/或未修饰的糖部分。在某些情况下，这样的糖基序包括但不限于本文讨论的任何糖修饰。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有缺口聚物基序的区域或由其组成，所述缺口聚物基序包含两个外部区域或“翼”和中央或内部区域或“缺口”。缺口聚物基序的三个区域(5’-翼、缺口和3’-翼)形成连续的核苷序列，其中每个翼的核苷的至少一些糖部分不同于缺口的核苷的至少一些糖部分。具体来说，每个翼的核苷的至少最接近缺口的糖部分(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)不同于邻近缺口核苷的糖部分，从而限定了翼与缺口之间的边界(即，翼/缺口连接)。在某些实施方案中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施方案中，缺口包括一个或多个核苷，所述核苷具有的糖部分不同于缺口的一个或多个其他核苷的糖部分。在某些实施方案中，两个翼的糖基序彼此相同(对称的缺口聚物)。在某些实施方案中，5'-翼的糖基序不同于3'-翼的糖基序(不对称的缺口聚物)。
在某些实施方案中，缺口聚物的翼包含1-5个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的翼包含2-5个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的翼包含3-5个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的核苷全为修饰的核苷。
在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含7-12个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含7-10个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含8-10个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口包含10个核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的缺口的每个核苷均为未修饰的2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，缺口聚物是脱氧缺口聚物。在这样的实施方案中，每个翼/缺口连接的缺口侧上的核苷是未修饰的2'-脱氧核苷，并且每个翼/缺口连接的翼侧上的核苷是修饰的核苷。在某些这样的实施方案中，缺口的每个核苷均为未修饰的2’-脱氧核苷。在某些这样的实施方案中，每个翼的每个核苷均为修饰的核苷。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有完全修饰的糖基序，其中所述修饰的寡核苷酸的每个核苷均包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中所述区域的每个核苷均包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中完全修饰的区域内的每个核苷均包含相同的修饰的糖部分，所述完全修饰的糖基序在本文中称为均匀修饰的糖基序。在某些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸是均匀修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，均匀修饰的每个核苷包含相同的2'-修饰。
2.某些核碱基基序
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或基序沿着寡核苷酸或其区域排列的修饰的和/或未修饰的核碱基。在某些实施方案中，每个核碱基均被修饰。在某些实施方案中，没有一个核碱基被修饰。在某些实施方案中，每个嘌呤或每个嘧啶均被修饰。在某些实施方案中，每个腺嘌呤均被修饰。在某些实施方案中，每个鸟嘌呤均被修饰。在某些实施方案中，每个胸腺嘧啶均被修饰。在某些实施方案中，每个尿嘧啶均被修饰。在某些实施方案中，每个胞嘧啶均被修饰。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸中的一些或所有胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含修饰的核碱基的嵌段。在某些这样的实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的3’端的3个核苷酸内。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’端。在某些实施方案中，嵌段在寡核苷酸的5’端的3个核苷酸内。
在某些实施方案中，具有缺口聚物基序的寡核苷酸包含包括修饰的核碱基的核苷。在某些这样的实施方案中，包含修饰的核碱基的一个核苷在具有缺口聚物基序的寡核苷酸的中心缺口中。在某些这样的实施方案中，所述核苷的糖部分是2'-脱氧核糖基部分。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶(propynepyrimidine)。
3.某些核苷间键联基序
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或基序沿着寡核苷酸或其区域排列的修饰的和/或未修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，基本上每个核苷间连接基团是磷酸酯核苷间键联(P＝O)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团是硫代磷酸酯(P＝S)。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团独立地选自硫代磷酸酯和磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的糖基序是缺口聚物，并且所述缺口内的核苷间键联均被修饰。在某些这样的实施方案中，所述翼中的一些或全部核苷间键联是未修饰的磷酸酯键联。在某些实施方案中，末端核苷间键联被修饰。
C.某些修饰的寡核苷酸
在某些实施方案中，本文所述的化合物包含修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，将上述修饰(糖、核碱基、核苷间键联)掺入到修饰的寡核苷酸中。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的特征在于它们的修饰、基序和总长度。在某些实施方案中，这样的参数各自彼此独立。因此，除非另有说明，具有缺口聚物糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键联均可被修饰或未被修饰，并且可以或可以不遵循糖修饰的缺口聚物修饰模式。例如，糖缺口聚物的翼区内的核苷间键联可以彼此相同或不同，并且与糖基序的缺口区的核苷间键联可以相同或不同。同样，这样的缺口聚物寡核苷酸可包以含一个或多个独立于糖修饰的缺口聚物模式的修饰的核碱基。此外，在某些情况下，通过总长度或范围或通过两个或更多个区域(例如，具有指定糖修饰的核苷区域)的长度或长度范围来描述寡核苷酸，在这样的情况下，可能对每个范围选择数目，导致寡核苷酸的总长度超出指定范围。在这样的情况下，两个要素都必须满足。例如，在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由15-20个连接核苷组成，并具有由三个区域A、B和C组成的糖基序，其中区域A由具有指定糖基序的2-6个连接核苷组成，区域B由具有指定糖基序的6-10个连接核苷组成，并且区域C由具有指定糖基序的2-6个连接核苷组成。这样的实施方案不包括其中A和C各自由6个连接核苷组成并且B由10个连接核苷组成的修饰寡核苷酸(即使在A、B和C的要求内允许那些核苷数目)，因为这样的寡核苷酸的总长度是22，其超过了修饰的寡核苷酸的总长度的上限(20)。本文中，如果寡核苷酸的描述没有提及一个或多个参数，那么这样的参数不受限制。因此，仅被描述为具有缺口聚物糖基序而没有进一步描述的修饰的寡核苷酸可具有任何长度、核苷间键联基序和核碱基基序。除非另有说明，否则所有修饰独立于核碱基序列。
组合物和配制药物组合物的方法
本文所述的化合物可与药学上可接受的活性物质或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。
在某些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种化合物或其盐的药物组合物。在某些实施方案中，化合物是反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些这样的实施方案中，药物组合物包含适合的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种化合物。在某些实施方案中，这样的药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种化合物组成。在某些实施方案中，无菌盐水是药用级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种化合物和无菌水。在某些实施方案中，药物组合物由一种化合物和无菌水组成。在某些实施方案中，无菌盐水是药用级水。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施方案中，药物组合物由一种或多种化合物和无菌PBS组成。在某些实施方案中，无菌PBS是药用级PBS。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。
通过将化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合，可以将本文所述的靶向SCN2A核酸的化合物用于药物组合物中。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是水，例如适合注射的无菌水。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中采用的是包含靶向SCN2A核酸的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是水。在某些实施方案中，化合物包含本文提供的修饰的寡核苷酸或由其组成。
包含本文提供的化合物的药物组合物包含任何药学上可接受的盐、酯、或这样的酯的盐、或任何其他寡核苷酸，当向动物(包括人)施用后，所述寡核苷酸能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残余物。在某些实施方案中，化合物是反义化合物或低聚化合物。在某些实施方案中，化合物包含修饰的寡核苷酸或由其组成。因此，例如，本公开还涉及化合物的药学上可接受的盐、前药、这样的前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。适合的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在化合物的一端或两端掺入另外的核苷，所述核苷被体内的内源性核酸酶裂解，从而形成活性化合物。
在某些实施方案中，化合物或组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
某些实施方案的优势
本文首次提供了调节SCN2A核酸的方法和组合物，其可以治疗、延迟、预防和/或改善SCN1A相关疾病或病症(例如，Dravet综合征)或其生理标志物。在具体的实施方案中，首次提供了SCN2A抑制剂(例如，靶向编码SCN2A的核酸的寡核苷酸)，其用于患有SCN1A相关疾病或病症(例如，Dravet综合征)的受试者中，用于减少癫痫发作，减少肌阵挛或肌肉痉挛，缓解行走困难，减轻痴呆、预防痴呆发作或治疗痴呆，缓解言语障碍，减轻幻视或预防其发作，治疗进行性神经变性或或预防其发作，减轻共济失调，或上述各项的组合。
实施例
非限制性公开和通过引用并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。将本申请中叙述的各参考文献通过引用以其整体并入本文。
实施例1：通过LNA减少SCN2A mRNA
用无菌蒸馏水将LNA溶解至10μg/μl，并在-30℃保存直至使用。在下表1和表2中示出了所使用的LNA的序列。
表1.ASO序列
表2.ASO序列Exiqon命名法
新生幼仔脑室内(ICV)注射
所有研究均按照《实验动物饲养管理和使用指南》(Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)进行，并得到弗洛里研究所动物伦理委员会(Florey InstituteAnimal Ethics Committee)的批准。通过Cyagen产生了携带对于Scn2a R1882Q突变为杂合的幼仔的怀孕ICR小鼠。将小鼠维持在光开/关周期为12小时的控温室中，其可以自由获取食物和液体。
在注射之前，目视检查幼仔(P2)，以确保存在乳状斑。通过将幼仔放入被碎冰包围的小塑料容器中4-5分钟，从而诱导冰冷麻醉，并用脚趾捏反应确定麻醉深度。将LNA(10μg/μl)装载到带有32G针头(Hamilton)的10μl注射器中。将幼仔的皮肤表面用80％的乙醇拭子消毒，在矢状缝合线侧约0.7-1.0mm处和离人字点(lambda)0.7-1.0mm额极(rostral)的位置处将注射部位用标志物标记。将针头以垂直于颅骨表面的角度插入皮肤表面下方2mm。将体积2μl的LNA(20μg)缓慢注入右心室。为了恢复，将小鼠在加热块(32摄氏度)上保持5-10分钟，直到观察到运动时为止。在返回饲养笼之前，将幼仔在草垫中擦拭，以最大程度地降低杀婴的风险。
在P15和P35时收获LNA处理的小鼠的右脑半球，然后用液氮速冻。使用TRIzol试剂(ThermoFisher Scientific)分离总RNA。每个半球使用1ml的TRIzol进行初始均质化，并根据制造商的方案进行RNA分离。然后，按照制造商的说明，用1μl DNA酶(无DNA的DNA酶处理和去除试剂盒；ThermoFisher Scientific)在50μl反应中处理每样品中多达20μg的总RNA。随后使用提供的灭活试剂(无DNA的DNA酶处理和去除试剂盒；ThermoFisher Scientific)去除DNA酶。为了产生cDNA，根据制造商的方案，通过M-MLV逆转录酶，使用低聚(dT)15引物(均来自Promega)逆转录每样品500ng的总RNA。随后，将每样品20ng cDNA用作定量实时PCR(qRT-PCR)中的模板。按照制造商的说明使用GoTaq qPCR MasterMix(Promega)准备qRT-PCR反应，并在ViiA 7系统(ThermoFisher Scientific)的MicroAmp快速光学96孔反应板(ThermoFisher Scientific)中进行反应。在qRT-PCR运行期间，在95℃进行初始预孵育10分钟，然后为40个扩增循环(95℃持续15s，60℃持续60s)。最后，进行了熔点分析(95℃持续15s，60℃持续60s，以0.05℃/s的速率加热到95℃)以确定扩增产物的熔解温度。引物序列(5′-3′)为：TGCTGTGCGGAAATCTGCC(SCN2A正向引物)(SEQ ID NO:7)；CGGATGCTCAAGAGAGACTGG(SCN2A反向引物)(SEQ ID NO:8)；GAGGTGCTGCTGATGTGC(RPL32正向引物)(SEQ ID NO:9)；GGCGTTGGGATTGGTGACT(RPL32反向引物)(SEQ ID NO:10)。使用QuantStudio实时PCR软件版本1.3(ThermoFisher Scientific)分析qRT-PCR数据。为了定量表达分析，将SCN2A的表达归一化为管家基因RPL32的表达(2^ΔCT方法；Pfaffl等人，Nucl.Acids.Res.29(9):e45,2001)。然后将ASO治疗的小鼠中的归一化SCN2A表达归一化为年龄匹配的未治疗对照中的SCN2A表达(2^ΔΔCT)。
注射后13天，所有三种LNA(ASO 1、ASO 2和ASO 3)使Scn2a mRNA水平降低2-3倍(图1A)。在P35时观察到相似的降低水平(图1B)，表明LNA在CSF中是稳定的并且有效下调Scn2a mRNA持续至少1个月。
实施例2：SCN1A杂合小鼠的存活率和癫痫发作的SCN2A ASO评估
背景
SCN1A R1407X小鼠模型(Scn1a RX)密切反映了被称为Dravet综合征的严重癫痫的的早期发作的关键疾病特征。R1407X突变杂合小鼠有过早死亡和自发性癫痫发作。Scn1a基因编码电压门控钠通道Nav1.1，所述通道主要表达于抑制性神经元中。电生理分析表明，表达R1407X的神经元不能维持高频动作电位放电，从而导致大脑中的去抑制作用，进而导致大脑的超兴奋性。因此，可降低大脑中的总体超兴奋性的策略可能对Dravet综合征具有治疗作用。在早期发育过程中大脑兴奋性的关键调节剂是另一种由SCN2A基因编码的电压门控钠通道同工型Nav1.2。
一种降低Nav1.2功能的方法是使用反义寡核苷酸(ASO)靶向SCN2A基因。ASO是被设计为控制感兴趣的基因表达的单链DNA/RNA寡核苷酸。将专门设计用于下调小鼠SCN1A基因的ASO应用于SCN1A RX小鼠模型，并通过存活率、自发性癫痫发作次数和脑电图(EEG)评价疗效。
方法
定量基因表达分析(RT-qPCR)
根据制造商的方案(Thermofisher，美国)，使用Trizol试剂从小鼠脑组织中分离总RNA。通过DNA酶处理(无DNA的试剂，Ambion/Life Technologies，美国)除去污染的基因组DNA。靶向小鼠SCN2A的引物(F:TGCTGTGCGGAAATCTGCC(SEQ ID NO:7)，R:CGGATGCTCAAGAGAGACTGG(SEQ ID NO:8))被设计为跨越内含子以区分基因组DNA和cDNA的扩增。为了RT-qPCR，使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega，美国)从500ng总RNA中合成了低聚dT引发的cDNA。根据生产商的方案，使用GoTaq qPCR预混液(Promega，美国)在ViiA 7实时PCR系统上进行RT-qPCR。通过使用2DDCt方法对参考基因RPL32进行归一化，获得相对基因表达值。
新生幼仔脑室内注射
在出生后(P)1天，通过脑室内(icv)途径向SCN1A RX幼仔施用5μg的小鼠SCN2A反义寡核苷酸(mScn2a ASO)或阴性对照、50μg的错义ASO。将幼仔冷冻麻醉，然后将装载有ASO的注射器针头(32G，Hamilton)插入到人字点和右眼之间的中间位置。注射深度在皮肤表面以下2mm，总共向右心室施用2μl的mScn2a ASO。
癫痫发作监测
将SCN1A RX小鼠分组容纳在饲养笼中，从P21到P28进行24小时视频监测。两名实验者对视频进行了评审，并记录了Racine评分超过4的癫痫发作。通过将每治疗组的癫痫发作总数除以治疗组中的小鼠数目来计算平均组癫痫发作。
脑电图(EEG)
用1-3％的异氟烷麻醉SCN1A RX小鼠(P30-35)。将小鼠置于立体定位仪(Kopf)中，使颅骨表面在人字点和前囱之间保持水平。将四个硬膜外电极放置在大脑表面，并用牙科水泥固定在适当的位置。在记录EEG之前，使小鼠恢复4-7天。监测大脑皮层活动24小时(Pinnacle Technology)。在记录期间，小鼠可以在笼子中自由移动，随意进食和饮水。
结果
通过ASO施用减少Scn2a mRNA
在P1时将mScn2a ASO(5μg)或错义ASO(50μg)注射到Scn1a RX幼仔的右心室中。ASO施用后14天评估Scn2a的mRNA水平。正如预期的那样，错义ASO不影响Scn2a mRNA的表达。从mScn2a ASO处理的小鼠收集的大脑显示出Scn2a mRNA水平降低了78.15±1.87％(图2)。在错义的ASO处理的Scn1a RX小鼠中，在P21时的存活率为76.47％。在mScn2a ASO处理的Scn1a RX小鼠中，直到P21时未观察到死亡(图3)。在P21和P45时，在错义ASO和mScn2aASO处理的Scn1a RX小鼠之间的体重是相似的(图4A-4B)。直到实验终点(P45)时，对于错义ASO和mScn2a ASO，存活率分别为29.41％和94.44％。
ASO改善了Scn1a RX小鼠模型存活的癫痫发作表型。
癫痫频繁发作是Dravet综合征的令人衰弱的特征，因此癫痫发作是治疗功效的关键标志。将Scn1a RX小鼠根据其治疗分组圈养，从P21到P28置于24小时视频监测下(图5)。评审视频并记录Racine评分高于4的癫痫发作。与错义ASO处理的Scn1a RX小鼠相比，通过5μg mScn2a ASO显著减少了自发性癫痫发作。
这项研究的结果表明，mScn2a ASO在Dravet综合征小鼠模型中有显著治疗功效。所述疾病小鼠模型的寿命延长，并且自发性癫痫发作表型显著改善。
实施例3：用SCN2A ASO在体外减少SCN2A翻译
在适当的细胞培养中维持和孵育自然表达SCN2A的人SH-SY5Y细胞。将SH-SY5Y细胞用靶向SCN2A基因的20聚体反义寡核苷酸处理。测量了单独的浓度反应和时程实验中的RNA和蛋白质水平。可通过northern印迹、RT-PCR和/或定量PCR分析来测量RNA水平。通过蛋白质印迹分析测量蛋白质水平。
实施例4：通过施用SCN2A ASO治疗Dravet综合征
选择患有Dravet综合征的人类患者进行ASO治疗。合成了靶向SCN2A mRNA的20聚体反义寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在所有糖部分上的硫代磷酸酯键联和2MOE修饰。将ASO溶解在适合的赋形剂中，所述赋形剂与向人施用相容。将含有溶解的ASO的溶液注射到患者的神经元细胞中，使得ASO溶液与受影响的神经元细胞相互作用。ASO转染神经元细胞并改变靶细胞中SCN2A的翻译，从而导致SCN2A蛋白减少。进行定量测定(例如，蛋白质印迹)来测量SCN2A蛋白的减少。使用免疫组织化学和免疫金染色直接观察神经元细胞中SCN2A的减少。在施用ASO治疗后，患者接受广泛的常规测试，以测量与Dravet综合征相关的症状的减轻。
实施例5：通过施用SCN2A ASO预防Dravet综合征
选择具有SCN1A突变(Dravet综合征的遗传标志物)的人类患者进行ASO治疗。合成了靶向SCN2A mRNA的20聚体反义寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在所有糖部分上的硫代磷酸酯键联和2MOE修饰。将ASO溶解在适合的赋形剂中，所述赋形剂与向人施用相容。将含有溶解的ASO的溶液注射到患者的神经元细胞中，使得ASO溶液与受影响的神经元细胞相互作用。ASO转染神经元细胞并改变靶细胞中SCN2A的翻译，从而导致SCN2A蛋白减少。进行定量测定(例如，蛋白质印迹)来测量SCN2A蛋白的减少。使用免疫组织化学和免疫金染色直接观察神经元细胞中SCN2A的减少。在施用ASO治疗后，患者接受广泛的常规测试，以观察与Dravet综合征发作相关的症状是否发作。
机译： 靶向SCN2A的反义寡核苷酸用于治疗SCN1A脑病
机译： 反义寡核苷酸靶向SCN2A，用于治疗SCN1A脑病
机译： 反义寡核苷酸靶向SCN2A，用于治疗SCN1A脑病
