具有生物活性肽的可注射聚（β-氨基酯）水凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有生物活性肽的可注射聚(β‑氨基酯)水凝胶的制备方法，所述水凝胶的制备不需要引入引发剂，由赖氨酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和具有生物活性的多肽通过一锅法发生迈克尔加成反应合成，通过控制聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液的浓度能够制备不同抗压强度的水凝胶。本发明提供了更加简单有效的制备水凝胶的方法，所述的水凝胶能够促进神经元再生且具有良好的生物相容性，可以用于脊髓损伤等组织工程领域。

说明书

技术领域

本发明属于生物高分子材料技术领域，具体涉及具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶及其制备方法和应用。

技术背景：

聚β氨基酯是一类具有良好生物相容性的人工合成高分子材料，可以通过聚乙二醇二丙烯酸酯与氨基发生迈克尔加成反应制得。目前公开的已有静电吸附和包埋等手段对聚β氨基酯水凝胶进行功能改性，但对水凝胶进行共价改性，使其具有更高的生物正交性仍是一个亟待解决的难题。

发明内容：

本发明的目的是通过简单的方法合成具有生物活性的可注射水凝胶，简化聚(β氨基酯)水凝胶的制备方法，通过生物活性物质的引入，解决其在生物领域的应用难题。

本发明采用以下技术方案：

一种具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶，所述水凝胶由赖氨酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和具有生物活性的多肽通过一锅法发生迈克尔加成反应合成，通过控制聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液的浓度能够制备不同抗压强度的水凝胶。

进一步的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液浓度为0.25M-0.75M。

本发明所提出的具有生物活性肽的可注射聚(β氨基酯)水凝胶的制备方法包括以下步骤：

1)制备具有生物活性的多肽，用高效液相色谱纯化；

2)将赖氨酸、聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液和步骤1)制备的具有生物活性的多肽混合得到混合水溶液；

3)将步骤2)所得的混合水溶液置于玻璃瓶中80℃反应4-36h，pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液浸泡12-36h至中性后紫外灭菌，得到具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶。

进一步的，所述步骤1)中采用固相合成法制备具有生物活性的多肽。

进一步的，所述步骤2)中聚乙二醇二丙烯酸酯平均分子量为600。

进一步的，所述步骤2)中加入的多肽、聚乙二醇二丙烯酸酯与赖氨酸的摩尔比是0.05～10：1.8～2.4：1。

进一步的，所述步骤2)配制的混合水溶液pH理论值应介于pH＝10-11，否则，用氢氧化钠溶液调至pH＝10-11。

所述的具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶在脊髓损伤方面的应用。

本发明所提供的具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶的简单制备方法与其它水凝胶制备方法相比有如下优点：

1)本发明中水凝胶的制备采用一锅法，不用多步操作，制备方法简单，操作方便，条件稳定可靠。

2)本发明制备过程中不需引入引发剂，无有毒物质掺入，制备的水凝胶无细胞毒性。

3)本发明通过迈克尔加成反应制备了0.18MPa，0.27MPa，0.39MPa不同抗压强度的Lys/PEGDA水凝胶，具有可注射性。

通过本方法制备的可注射水凝胶具有可降解性，且有良好的亲水性，具有良好的生物相容性。

具体实施方式

为对本发明进行详细说明，以使本领域的技术人员更好的理解本发明，下面将列举一项实施例，但本发明并不局限于此。下述实施例如无特殊说明，所述条件均为常规条件，所述试剂均可由商业途径获得。

本发明提出的具有生物活性肽的可注射水凝胶，其由聚乙二醇二丙烯酸酯与氨基发生迈克尔加成反应制得，氨基由赖氨酸和生物活性肽提供。反应体系中未加入引发剂，反应条件为80℃反应4-36h。其中，聚乙二醇二丙烯酸酯与赖氨酸的摩尔比优化为2:1。其0.25M的浓度赋予了它可注射性，其高含水量赋予了水凝胶良好的生物相容性。

实施例

具有抗炎且含有层粘连蛋白肽修饰的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶的简单制备方法及应用。通过赖氨酸、聚乙二醇二丙烯酸酯和含有抗炎物质-布洛芬的层粘连蛋白肽发生迈克尔加成反应形成可注射水凝胶，通过控制聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度制备不同抗压强度的水凝胶。该水凝胶不仅具有良好的生物相容性，同时可以增强神经元细胞的迁移和附着力，以及体外神经的生长，通过布洛芬缩合到多肽序列发挥镇痛抗炎作用，促进脊髓损伤的愈合。

所述的具有抗炎且含有层粘连蛋白肽修饰的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶的制备方法包括如下步骤：

步骤1)含有抗炎物质-布洛芬的层粘连蛋白肽通过固相合成法合成，序列为KYIGSRK-Ibuprofen；KYIGSRK-Ibuprofen多肽中的YIGSR是层粘连蛋白-B1链的五肽，该结构域可增强神经元细胞的迁移和附着力，以及体外神经的生长；布洛芬具有良好的镇痛抗炎作用。

合成赖氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-赖氨酸-布洛芬多肽(KYIGSRK-Ibuprofen)，具体包括以下步骤：

11)在固相合成管中，2-氯三苯甲基氯树脂(1.1g/mmol)用二氯甲烷溶胀10min后弃去液体；

12)称取Fmoc-L-Lys-OH(2eq树脂)和N,N-二异丙基乙胺(4eq树脂)溶解在二氯甲烷中放入固相合成管中，反应1h以上；

13)加入多肽封闭液(500μLN,N-二异丙基乙胺，1mL甲醇，8.5mL二氯甲烷)反应15min；

14)先用二氯甲烷洗涤3次，再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，每次1min，20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液反应30min，将Fmoc保护基切除，去除反应液后N,N-二甲基甲酰胺洗三次，称取Fmoc-L-Tyr(Tbu)-OH(2eq树脂)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(2eq树脂)，N,N-二甲基甲酰胺溶解后加入固相管，固相管中再加入N,N-二异丙基乙胺(4eq树脂)在室温下反应2h以上；

15)N,N-二甲基甲酰胺溶解混匀3次，每次持续至少1min，重复20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液去除保护基和Fmoc-L-IIe-OH，Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Ser-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Lys-OH及布洛芬的反应；然后用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水溶液将前面合成好的多肽从树脂上切下来且去除所有保护基。

16)旋转蒸发仪去除有机溶剂后，用少量三氟乙酸溶解多肽后用乙醚沉淀三次(体积比：三氟乙酸:乙醚＝1:10)，烘干后用50％甲醇/水溶液溶解，合成好的多肽用高效液相色谱(HPLC)来纯化。(流动相：甲醇，水；色谱柱：C18柱；流速：10mL/min；柱温：25℃；紫外吸收波长：260nm)

步骤2)将含有抗炎物质-布洛芬的层粘连蛋白肽、赖氨酸、聚乙二醇二丙烯酸酯按0.1:1:2的比例称量、溶解并混匀，其中用三蒸水控制聚乙二醇二丙烯酸酯浓度为0.25M。

步骤3)将上述混合溶液至于玻璃反应瓶中，80℃反应8-36h，pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液浸泡12-36h至中性后紫外灭菌，得到具有生物活性肽的可注射聚(β-氨基酯)水凝胶。

将本发明的水凝胶应用于脊髓损伤，证明其具有良好的治疗效果。

本发明提供了更加简单有效的制备水凝胶的方法，所述的具有生物活性肽的水凝胶亲水性好，具有良好的生物相容性，化学性质稳定，可以用于脊髓损伤、骨组织损伤等组织工程修复领域。