一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法

摘要

本发明公开了一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法，包括原料筛选、原料培养、原料驯化、细菌提取、细菌复筛。本发明所述的一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法，一是通过在原料培养时，原料表面涂抹培养基，并使用热风机加热，能够在原料颗粒表面形成密封的壳体，不但能够保持细菌始终处于无氧环境，同时还能培养细菌；二是通过在原料颗粒的外侧设置多层培养基，能够将细菌吸引到颗粒表面，使得细菌集中分布在原料颗粒的表面，方便之后逇提取与筛选；三是通过在菌剂混合时，采用滴加混合，能够减小细菌之间的排斥，提高菌剂之间混合的稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及氯酚降解技术领域，特别涉及一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法。

背景技术

氯酚是氯取代苯酚类化合物的总称，基本结构是氯取代苯环上的氢原子，根据氯原子取代的位置及数目，形成结构及性质相似的各种氯酚类物质，大量环境调查和实验研究表明，氯酚可经口或皮肤接触进入体内，长期接触或摄入可引起皮肤瘙痒、出疹、头昏贫血及各种神经系统疾病，过量摄入会引起急性中毒，具有遗传毒性、致突变性及致癌性；

目前，现有的降解氯酚菌群制备时，由于细菌分布不均，且均分部在污泥的内部，因此在细菌提取时，不但容易导致细菌提取不充分，同时还会导致细菌提取难度大，严重影响细菌的处理，为此，我们提出一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种降解氯酚菌群的原位筛选及复合菌剂制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种降解氯酚菌群的原位筛选，包括以下步骤：

原料筛选：选取带有厌氧颗粒的污泥，并在真空中搅拌，之后挤压成直径在5-6mm范围内的原料颗粒；

原料培养：在筛选后的原料颗粒外部均匀涂抹培养基，并使用热风机对原料颗粒加热，待培养基将原料颗粒包裹起来，得到厌氧原料；

原料驯化：对厌氧原料放入到厌氧反应器中进行驯化，驯化后采用稀释倍数法在培养基上进行培养；

细菌提取：对驯化后的细菌进行分离和钝化得到试剂，之后再向试剂中添加氯酚，得到初筛菌液；

细菌复筛：将得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止；

菌剂：将通过上述步骤制得各种厌氧菌混合，并放入氯酚溶液中浸泡，得到菌剂。

优选的，原料筛选时，将污泥与琼脂倒入真空搅拌机中搅拌，搅拌后倒入制粒机制成原料颗粒。

优选的，在原料颗粒表面涂抹培养基时包括以下步骤：

初步涂抹：先涂抹直径在1-2mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以50-58℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热2-3min后，得到第一层密封层；

二次涂抹：在第一层密封层的外部涂抹直径在0.5-1mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以65-75℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热4-6min后，得到第二层密封层；

三次涂抹：在第一层密封层的外部涂抹直径在0.1-0.2mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以76-80℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热4-6min后，得到第三层密封层。

优选的，原料培养中，培养基包括以下组分：酵母浸汁50-56份、蛋白陈12-18份、琼脂40-45份、麦芽糖20-40份、胰蛋白陈5-8份、营养肉汤4-5份。

优选的，细菌复筛过程中，待长出菌株后，将菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化。

优选的，一种复合菌剂的制备方法，包括降解氯酚菌群的原位筛选，该复合菌剂的制备方法包括以下步骤：

初步混合：将不同厌氧菌菌剂放入都不同的试管中，并分别向菌剂中滴加氯酚溶液，并在40-45℃温度下保存5-8min；

滴加混合：选择其中一种菌剂，将其滴加其他菌剂中，并静置，同理再选取一种菌剂滴加都其他菌剂中，最终将所有菌剂混合，得到混合菌剂。

优选的，初步混合时，氯酚溶液与菌剂的比例为1:28，同时滴加前，将氯酚溶液加热到30-38℃。

优选的，滴加混合时，每次滴加之间的间隔为80-100min，同时滴加前，加入与菌剂1：1的清水，当静置后沉淀物增加时，将该试剂倒掉。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

一是通过在原料培养时，原料表面涂抹培养基，并使用热风机加热，能够在原料颗粒表面形成密封的壳体，不但能够保持细菌始终处于无氧环境，同时还能培养细菌；

二是通过在原料颗粒的外侧设置多层培养基，能够将细菌吸引到颗粒表面，使得细菌集中分布在原料颗粒的表面，方便之后逇提取与筛选；

三是通过在菌剂混合时，采用滴加混合，能够减小细菌之间的排斥，提高菌剂之间混合的稳定性。

附图说明

图1为本发明一种降解氯酚菌群的原位筛选整体结构流程图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

对比例

一种降解氯酚菌群的原位筛选，包括以下步骤：

原料筛选：选取带有厌氧颗粒的污泥，并在真空中搅拌，之后挤压成直径在5mm范围内的原料颗粒，将污泥与琼脂倒入真空搅拌机中搅拌，搅拌后倒入制粒机制成原料颗粒，得到厌氧原料，培养基包括以下组分：酵母浸汁50份、蛋白陈12份、琼脂40份、麦芽糖20份、胰蛋白陈5份、营养肉汤4份；

原料驯化：对厌氧原料放入到厌氧反应器中进行驯化，驯化后采用稀释倍数法在培养基上进行培养；

细菌提取：对驯化后的细菌进行分离和钝化得到试剂，之后再向试剂中添加氯酚，得到初筛菌液；

细菌复筛：将得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止，细菌复筛过程中，待长出菌株后，将菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化；

菌剂：将通过上述步骤制得各种厌氧菌混合，并放入氯酚溶液中浸泡，得到菌剂。

一种复合菌剂的制备方法，包括降解氯酚菌群的原位筛选，该复合菌剂的制备方法包括以下步骤：

初步混合：将不同厌氧菌菌剂放入都不同的试管中，并分别向菌剂中滴加氯酚溶液，并在40℃温度下保存5min，氯酚溶液与菌剂的比例为1:28，同时滴加前，将氯酚溶液加热到30℃；

滴加混合：选择其中一种菌剂，将其滴加其他菌剂中，并静置，同理再选取一种菌剂滴加都其他菌剂中，最终将所有菌剂混合，得到混合菌剂，每次滴加之间的间隔为80min，同时滴加前，加入与菌剂1：1的清水，当静置后沉淀物增加时，将该试剂倒掉

实施例一

一种降解氯酚菌群的原位筛选，包括以下步骤：

原料筛选：选取带有厌氧颗粒的污泥，并在真空中搅拌，之后挤压成直径在5mm范围内的原料颗粒，将污泥与琼脂倒入真空搅拌机中搅拌，搅拌后倒入制粒机制成原料颗粒：

原料培养：在筛选后的原料颗粒外部均匀涂抹培养基，并使用热风机对原料颗粒加热，待培养基将原料颗粒包裹起来，得到厌氧原料，在原料颗粒表面涂抹培养基时包括以下步骤：

初步涂抹：先涂抹直径在2mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以50℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热2min后，得到第一层密封层；

二次涂抹：在第一层密封层的外部涂抹直径在0.5mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以65℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热4min后，得到第二层密封层，培养基包括以下组分：酵母浸汁50份、蛋白陈12份、琼脂40份、麦芽糖20份、胰蛋白陈5份、营养肉汤4份；

原料驯化：对厌氧原料放入到厌氧反应器中进行驯化，驯化后采用稀释倍数法在培养基上进行培养；

细菌提取：对驯化后的细菌进行分离和钝化得到试剂，之后再向试剂中添加氯酚，得到初筛菌液；

细菌复筛：将得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止，细菌复筛过程中，待长出菌株后，将菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化；

菌剂：将通过上述步骤制得各种厌氧菌混合，并放入氯酚溶液中浸泡，得到菌剂。

一种复合菌剂的制备方法，包括降解氯酚菌群的原位筛选，该复合菌剂的制备方法包括以下步骤：

初步混合：将不同厌氧菌菌剂放入都不同的试管中，并分别向菌剂中滴加氯酚溶液，并在40℃温度下保存5min，氯酚溶液与菌剂的比例为1:28，同时滴加前，将氯酚溶液加热到30℃；

滴加混合：选择其中一种菌剂，将其滴加其他菌剂中，并静置，同理再选取一种菌剂滴加都其他菌剂中，最终将所有菌剂混合，得到混合菌剂，每次滴加之间的间隔为80min，同时滴加前，加入与菌剂1：1的清水，当静置后沉淀物增加时，将该试剂倒掉。

实施例二

一种降解氯酚菌群的原位筛选，包括以下步骤：

原料筛选：选取带有厌氧颗粒的污泥，并在真空中搅拌，之后挤压成直径在5mm范围内的原料颗粒，将污泥与琼脂倒入真空搅拌机中搅拌，搅拌后倒入制粒机制成原料颗粒：

原料培养：在筛选后的原料颗粒外部均匀涂抹培养基，并使用热风机对原料颗粒加热，待培养基将原料颗粒包裹起来，得到厌氧原料，在原料颗粒表面涂抹培养基时包括以下步骤：

初步涂抹：先涂抹直径在2mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以50℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热2min后，得到第一层密封层；

二次涂抹：在第一层密封层的外部涂抹直径在0.5mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以65℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热4min后，得到第二层密封层；

三次涂抹：在第一层密封层的外部涂抹直径在0.1mm范围内的琼脂颗粒，再使用热风机以76℃的温度对琼脂颗粒的外部加热，加热4min后，得到第三层密封层，培养基包括以下组分：酵母浸汁50份、蛋白陈12份、琼脂40份、麦芽糖20份、胰蛋白陈5份、营养肉汤4份；

原料驯化：对厌氧原料放入到厌氧反应器中进行驯化，驯化后采用稀释倍数法在培养基上进行培养；

细菌提取：对驯化后的细菌进行分离和钝化得到试剂，之后再向试剂中添加氯酚，得到初筛菌液；

细菌复筛：将得到的菌液接种到固体培养基中涂布培养，待长出菌体后，用灭菌针挑出菌落接种到液体培养基中，待液体培养基中长出菌株后，摇匀菌液，直到从细胞形态鉴定确认为单一菌体为止，细菌复筛过程中，待长出菌株后，将菌液接种到固体培养基进行形态鉴定，或进行显微镜观察和鉴定细胞形态是否相同来判断分离纯化是否成功，如果菌体不纯，继续采用固体-液体培养基交替培养方法进行分离和纯化；

菌剂：将通过上述步骤制得各种厌氧菌混合，并放入氯酚溶液中浸泡，得到菌剂。

一种复合菌剂的制备方法，包括降解氯酚菌群的原位筛选，该复合菌剂的制备方法包括以下步骤：

初步混合：将不同厌氧菌菌剂放入都不同的试管中，并分别向菌剂中滴加氯酚溶液，并在40℃温度下保存5min，氯酚溶液与菌剂的比例为1:28，同时滴加前，将氯酚溶液加热到30℃；

滴加混合：选择其中一种菌剂，将其滴加其他菌剂中，并静置，同理再选取一种菌剂滴加都其他菌剂中，最终将所有菌剂混合，得到混合菌剂，每次滴加之间的间隔为80min，同时滴加前，加入与菌剂1：1的清水，当静置后沉淀物增加时，将该试剂倒掉

通过分别检测对比例、实施例一和实施例二制备的菌剂中细菌含量，对比例中细菌含量为1.8×10

对比例中不进行原料培养，实施例一在原料表面涂抹两层密封层，实施例二在原料表面涂抹三层密封层，并通过上述细菌含量对比可知，不经过原料培养原料中，细菌含量大大减少，这是因为原料外部的细菌与空气接触，出现死亡，且细菌无法集中分布在原料的外部，导致细菌提取困难。

在通过实施例一和实施例二对比可知，通过多层涂抹密封层，能够提供细菌的繁殖速度和细菌含量，这是因为用于培养细菌的培养基在原料的外部，使得原料外部的细菌快速生长，同时位于原料内部的细菌也能向外移动，从而提高原料外部的细菌含量。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。