包含表达HLA-E的肝祖细胞的细胞组合物

摘要

本发明涉及分离的肝祖细胞、其细胞系、包含其的细胞群和包含其的组合物，其中所述肝祖细胞为HLA‑E阳性。此外，本发明涉及制备这些肝祖细胞的方法。

说明书

技术领域

本发明所属的技术领域为源自肝脏的分离的肝祖细胞或干细胞及其在医学、肝脏病学、移植、肝衰竭和纤维炎性肝病中的应用。

背景技术

肝脏是执行许多重要功能的关键器官。多种肝功能中的一种的损害对健康就具有显著影响。根据世界卫生组织，急性或慢性肝病的全球发病率使这些病症成为排在第5至第9位的死因。肝细胞移植(LCT)是一项正在进行临床研究的程序，用于以实现肝脏修复/再生为目标的肝病治疗(Najimi等，Stem Cells Translational Medicine,2016)。尽管进行了很多努力以使供体在免疫学上尽可能接近地与受体匹配，但肝细胞移植后出现的有关免疫系统排斥的问题仍然是细胞疗法、组织移植、特别是LCT后的主要问题。间充质干细胞(MSC)是多效性细胞，其能够根据细胞外环境、特别是含有细胞因子的环境而表现出不同的行为(Spees等，Stem Cells research and therapy，2016)。研究表明，MSC是低免疫原性的，可以抑制免疫应答的发展，并使多种免疫细胞群从促炎转向抗炎/调节性表型(Najar等，Inflammation research,2018)。在基线水平，MSC具有最低限度的免疫抑制作用。但细胞在暴露于特定环境信号后仍可采用免疫抑制表型(Kouroupis等，Tissue engineering PartB,2018)。不幸的是，这些初始MSC中只有一小部分在注射后变得具有免疫抑制性，这取决于个体患者的内部信号。由于这些原因，需要开发具有改进的免疫抑制性的新MSC表型。

免疫功能和移植排斥的关键是主要组织相容性抗原，在人类中通常称为HLA复合体。编码I类HLA蛋白的基因聚集在人染色体6p21的端粒末端。这些包括经典的Ia类蛋白HLA-A、HLA-B和HLA-C，它们普遍表达并且具有高度多态性。相比之下，非经典的Ib类蛋白HLA-E、HLA-F和HLA-G相对不变，并且选择性表达。HLA Ib类分子的主要功能是通过与不同的免疫效应细胞(例如T和B淋巴细胞、NK细胞和抗原呈递细胞)上表达的特定抑制性受体相互作用来调节免疫应答。

来自骨、软骨或脂肪组织的MSC已被描述为表达低水平的人白细胞抗原(HLA)Ia类蛋白。它们可以通过表达可溶性因子(包括HLA-Ib蛋白，特别是HLA-E)而表现出免疫调节特性(Morandi等，Stem Cells,2008)。在生理条件下，HLA-E的表达与HLA-G密切相关(Morandi等，Stem Cells.2008；Morandi，Pistoia，Front.Immunol.,2014)。已报导HLA-E在人胎儿肝脏(Houlihan等，J.Immunol.,1992)、成年人肝细胞和库普弗细胞(Araujo等，J.Immunol.Res.,2018)中表达。这种表达在丙型肝炎病毒(HCV)感染后增加，表明HLA-E在肝病中具有潜在的免疫调节作用(Araujo等，2018)。人诱导性多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞组成型地表达HLA-E，其与CD94/NKG2A受体复合体的相互作用导致对NK细胞活化的抑制(Sugita等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，2018)。骨髓移植后，已显示HLA-E与较低的移植物抗宿主病风险和降低的死亡率相关(Pabon等，Transplant Proceedings2014)。用IFNγ对脂肪组织MSC进行体外致敏(priming)会增加HLA-E和其他免疫抑制蛋白的表达，从而使T细胞抑制成为可能(Wobma等，J.Immunol.Regen.Med.,2018)。

WO2008121894描述了一种MSC细胞组合物，其具有富集的HLA-E阳性细胞群和/或HLA-G阳性细胞群，以及它们在治疗退行性疾病和移植免疫调节中的潜在用途。WO2018081514描述了免疫抑制性间充质基质细胞，其通过在体外低氧培养条件下将促炎细胞因子应用于间充质基质细胞而获得。US20120328578公开了一种治疗滑液关节炎症的方法，该方法基于通过用发炎关节的滑液或促炎细胞因子处理细胞来诱导干细胞中的免疫抑制特性。

ADHLSC和HHALPC(也称为HALPC，人类同种异体肝祖细胞，在GMP条件下产生，用于临床研究目的时以更大的规模生产)是在正常成年人肝脏的胶原酶消化和实质部分的原代培养后获得的未分化的祖细胞。HHALPC表现出自我更新能力，并具有表达间充质和肝细胞标志物和显示出高级肝源性分化潜能的特性。这些细胞在靶向人类肝病(包括肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和慢加急性肝衰竭(ACLF))以及其他人类疾病方面备受关注。

Raicevic等(Cytotherapy,2015)公开了一种方法，其中向成体源性人肝间充质基质细胞(ADHLSC)过夜补充炎性细胞因子混合物。没有观察到HLA-E或HLA-G的膜和细胞内表达。Raicevic也没有提及含有大量表达HLA-E的细胞的组合物的存在。

Mehdi Najar等(2018)公开了炎性的已接触抗原的ADHLSC。该文献没有提及HLA-E的诱导，也没有提及HLA-G在炎性的已接触抗原的ADHLSC中的表达。Mehdi Najar完全未提及可能与表达HLA-E的细胞组合物有关的益处。

Hoda El-Kehdy等(2017)也公开了炎性的已接触抗原的ADHLSC，并显示了HLA-ABC、HLA-DR和HLA-G在处于组成型和已接触抗原的状态的(未)分化的ADHLSC中的表达，显示没有显著诱导的HL A-G表达或HLA-DR表达。

这些现有技术文献都没有公开对获得应用于临床的表达HLA-E的肝干细胞或祖细胞群的需要，也没有提到足够的HLA-E表达可能在逃避细胞溶解中起作用。

本领域仍然需要具有免疫调节以及增强的免疫抑制和/或免疫逃避活性的新的或改进的同种异体细胞疗法，例如用于预防或治疗炎症、自身免疫病和移植排斥，尤其是用于治疗与肝病相关的病症。

发明内容

本发明提供了权利要求1所述的包含人成体肝源性祖细胞或干细胞的组合物、权利要求8所述的分离的肝祖细胞或干细胞、以及权利要求21所述的细胞群。更具体地，本发明提供了HLA-E阳性细胞和包含至少60％的这种HLA-E阳性细胞的组合物。在本发明的细胞中观察到的HLA-E表达主要(即使不是支配性地)位于细胞表面上。发现具有增加量的(在其细胞表面上)表达HLA-E的细胞的组合物能够逃避CD8+T细胞介导的细胞溶解，因此特别适合用于治疗。

本发明的细胞、细胞群和包含所述细胞的组合物中的HLA-E表达据显示能够显著增强其免疫抑制和/或免疫逃避特性。这些细胞、细胞群和组合物特别适合用于治疗或预防涉及不需要的免疫应答的病症，例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥，并且应用于治疗肝病。

分离的肝祖细胞、细胞群或包含所述细胞的组合物保持了它们的增殖能力，这连同它们的肝脏特异性一起增加了肝细胞移植的功效和安全性。此外，由于它们的成体来源，这些干细胞避免了与胚胎细胞相关的免疫学、伦理学和致癌问题(Volarevic等，International Journal of Medical sciences,2018)。

这些祖细胞的因HLA-E表达而增强的免疫抑制特性有助于降低细胞疗法和/或组织移植的免疫应答相关风险，这些风险在同种异体细胞移植期间特别高。因此，本发明的HLA-E阳性肝源性祖细胞更有可能成功地作为多种肝脏病症的细胞疗法且对患者具有改进的功效和耐受性。

在本发明的另一个实施方式中，肝祖细胞、细胞群或包含所述细胞的组合物也可为HLA-G阳性或可具有升高的HLA-G表达水平。认为HLA-E和HLA-G的协作可以进一步增强相应的肝祖细胞的免疫抑制作用，使它们更适合用于细胞治疗方法(Morandi,Pistoia,Frontiers in Immunology 2014)。

在本发明的另一个实施方式中，肝源性祖细胞、细胞群或包含所述细胞的组合物还对至少一种间充质标志物呈阳性。间充质标志物包括但不限于波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)和CD140-b。在另一个实施方式中，本发明的肝源性祖细胞分泌HGF。在另一个实施方式中，本发明的肝源性祖细胞对HLA-DR呈阴性。在另一个实施方式中，肝源性祖细胞可选地对至少一种肝脏标志物呈阳性且/或可选地具有至少一种肝脏特异性活性。肝脏标志物包括但不限于白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝脏特异性活性包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。

在第二方面，本发明提供了权利要求30所述的制备HLA-E阳性肝祖细胞或干细胞的方法。更具体地，该方法包括预处理细胞的步骤，该步骤是指将一种或多种细胞因子加入到肝祖细胞或干细胞的培养物的细胞培养基中。

在一个优选实施方式中，本发明的组合物适用于权利要求24至29所述的应用。更特别地，提供本发明的组合物用于治疗特别受益于其免疫抑制特性的许多疾病。

在另一方面，本说明书还描述了一种治疗和/或预防特别受益于本文公开的细胞、细胞群和/或组合物的免疫抑制特性的病症和疾病的方法，所述病症和疾病包括具有不需要的免疫应答的病症、纤维化病症和肝病。不需要的免疫应答包括例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥。

更特别地，本发明提供了一种方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用本发明的祖细胞或干细胞、其细胞系、细胞群和/或组合物。这种施用通常是以治疗有效量进行，即通常是提供所需的局部或全身效应和性能的量。

在又一方面，本公开还描述了本发明的祖细胞或干细胞、其细胞系、细胞群和/或组合物用于治疗和/或用于制造药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防具有不需要的免疫应答的病症、用于治疗和/或预防纤维化病症、以及用于治疗和/或预防肝病。此类疾病可包括影响肝组织的病症、影响肝细胞活力和/或功能的疾病以及由纤维炎症反应引起的慢性肝衰竭。此外，由于免疫调节和免疫抑制特性，提供了本发明的祖细胞或干细胞、其细胞系、细胞群和/或组合物的用途，以用于治疗和/或用于制造药物，所述药物用于治疗需避免不期望的免疫应答的疾病。

附图说明

图1、图2和图3显示了本发明各种实施方式的肝祖细胞的HLA-E表达。

图1的FACS分析数据显示了与未处理的对照条件相比的从一个供体(VLK019)分离出的肝祖细胞在不同培养条件下的HLA-E蛋白表达：IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、和IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)。绿色直方图“ISO”是同种型对照(基线，未检测到荧光，未检测到HLA-E表达)。

图2的FACS分析数据显示了与未处理的对照条件相比的从三个不同供体分离出的肝祖细胞在不同培养条件下的HLA-E蛋白表达：IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、和IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)。绿色直方图是同种型对照(基线，未检测到荧光，未检测到HLA-E表达)。

图3的FACS分析数据显示了与未处理的对照条件相比的在不同培养条件下检测到的HLA-E表达的平均荧光强度(n＝3)：IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、和IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)。确认了与未处理的细胞相比，经预处理的细胞中HLA-E表达水平升高。

图4和图5显示了本发明各种实施方式的HLA-E阳性肝祖细胞的基因表达谱。

图4的RT-PCR数据显示了三种不同培养条件下HLA-E和HLA-G的基因表达与未处理的对照条件(基线)相比的倍数增加：IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、和IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)。

图5的RT-PCR数据显示了本发明实施方式的经预处理的肝祖细胞中IDO1、HGF、PTGS2、IL-6和IL-10的基因表达与未处理的对照(基线)相比的倍数增加。当用选自IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-10或其组合的促炎细胞因子预处理细胞时，确认了IDO1、PTGS2、IL-6和/或IL-10的基因表达水平增加。

图6显示了本发明实施方式的呈HLA-E阳性的分离的肝祖细胞所分泌的HLA-G蛋白的定量。

图6的分泌分析数据显示了从不同培养条件回收的上清液中可检测的可溶性HLA-G水平：未处理(对照条件)、用IL-1β/TNFα/IFNγ组合处理、仅用IL-10处理、或用IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)处理。用携带人HLA-G序列的质粒转染的人黑色素瘤Bowes细胞(HMBC)用作阳性对照(“转染的HMBC”)。这些数据确认了本发明实施方式的HLA-E表达呈阳性的经预处理的分离的肝祖细胞的HLA-G分泌升高。

图7显示了在包含本发明各种实施方式中的HLA-E阳性肝祖细胞的细胞群中免疫调节因子PGE2的分泌。

图7的分泌分析数据显示了来自不同条件的上清液中可检测的PGE2水平，包括未处理的肝祖细胞(对照条件)和用IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、或IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)预处理过的肝祖细胞。与未处理的条件相比，在本发明实施方式的经预处理的细胞中观察到增强的分泌水平。

图8显示了在包含本发明各种实施方式中的HLA-E阳性肝祖细胞的细胞群中升高的IDO1酶活性水平。

图8的在酶测定中获得的数据显示了来自不同实验条件的上清液中可检测的IDO活性水平。不同条件包括未处理的肝祖细胞(对照条件)和用IL-1β/TNFα/IFNγ组合、仅IL-10、或IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10组合(“全部一起”)预处理过的肝祖细胞。在本发明实施方式的经预处理的细胞中观察到增强的IDO活性。

图9A、9B和9C显示了处理前后肝祖细胞群中的HLA-E表达。

图10A、10B、10C和10D显示了本发明的细胞组合物和细胞对CD8 T细胞介导的细胞溶解的影响。

具体实施方式

本发明涉及呈HLA-E阳性的分离的肝源性祖细胞或干细胞、制备此类细胞的方法、包含此类细胞的组合物以及它们用于治疗或预防涉及不需要的免疫应答的病症(例如炎症、自身免疫病和移植排斥)以及用于治疗肝病的用途。

除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，都具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。通过进一步的指引，提供术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所用，以下术语具有以下含义：

除非上下文另有明确规定，否则本文所用的“一个”、“一种”和“所述”指的是单数和复数所指对象。例如，“一个隔室”是指一个或多于一个的隔室。

如本文所用，“约”是指诸如参数、量和持续时间等可测量值，意在涵盖指定值上下的+/-20％或更小、优选+/-10％或更小、更优选+/-5％或更小、甚至更优选+/-1％或更小、进一步更优选+/-0.1％或更小的变化，且这些变化适合于在所公开的发明中实施。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。

如本文所用，“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包括性或开放式术语，其表明存在其后所述的内容(例如组分)，并且不排除或排斥还存在本领域已知的或其中公开的其他未列举的组分、特征、元件、构件、步骤。

利用端点列举的数值范围包括该范围内所含的所有数字和分数以及列举的端点。

除非另有定义，否则此处和整个说明书中的表述“重量％”、“重量百分比”、“％重量”或“重量％”是指相应组分基于制剂总重量的相对重量。

如本文所用，术语“分离的细胞”通常是指不与该细胞在体内所联结的一种或多种细胞或一种或多种细胞成分联结的细胞。例如，分离的细胞可以已从其天然环境中移出，或可以由已从其天然环境中移出的细胞繁殖(例如，离体繁殖)得到。

如本文所用，术语“体外”表示在动物或人体外部或外界。本文使用的术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人体中取出并在身体外(例如在培养容器中)维持或繁殖的组织或细胞。

术语“肝祖细胞”是指通过培养分离自肝脏的细胞而产生的未特化且具有增殖能力的细胞，其或其后代能够产生至少一种相对更特化的细胞类型。肝祖细胞产生的后代能够沿着一个或多个谱系分化以产生越来越多的特化细胞(但优选肝细胞或肝活性细胞)，其中此类后代本身可以是祖细胞，甚至可以产生终末分化的肝细胞(例如完全特化的细胞，特别是呈现出类似于原代人肝细胞的形态学和功能特征的细胞)。术语“干细胞”是指能够自我更新的祖细胞，即能够不分化地增殖，由此干细胞的后代或其至少一部分基本上保留了母干细胞的未特化或相对较少特化的表型、分化潜能和增殖能力。该术语涵盖了能够基本上无限制地自我更新的干细胞，即后代或其部分的进一步增殖的能力与母细胞相比基本上没有降低，以及表现出有限自我更新的干细胞，即后代或其部分的进一步增殖的能力与母细胞相比明显降低。

基于产生多种细胞类型的能力，祖细胞或干细胞通常可以被描述为全能、多能、专能或单能。单个“全能”细胞被定义为能够生长(即发育)成整个生物体。“多能”细胞不能生长成整个生物体，但能够产生源自所有三个胚层(即中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型，并且可能能够产生生物体的所有细胞类型。“专能”细胞能够产生来自生物体的两种以上不同的器官或组织中的每一个的至少一种细胞类型，其中所述细胞类型可以源自相同或不同的胚层，但不能产生生物体的所有细胞类型。“单能”细胞能够分化为仅一种细胞谱系的细胞。

术语“间充质干细胞”应理解为主要来源于或分离自间充质细胞或基质细胞的专能基质细胞。所述间充质干细胞能够分化多种细胞类型，包括但不限于肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞和脂肪细胞。

术语“肝细胞”涵盖了上皮和实质肝细胞，包括但不限于具有不同的大小或倍性(例如，二倍体、四倍体、八倍体)的肝细胞。

如本文所用，术语“HLA-E阳性”是指表达可检测水平的HLA-E蛋白的肝祖细胞或干细胞。HLA-E表达可以在细胞内、在细胞表面和/或作为可溶性蛋白。当细胞被称为对特定标志物呈阳性时，这意味着技术人员将认定在进行适当测量时与适合的对照相比存在或确认该标志物的明确信号(例如，抗体可检测的或可通过逆转录聚合酶链反应或流式细胞术检测的)。在检测方法允许对标志物进行定量评估的情况下，阳性细胞平均可产生与对照相比显著不同的信号，例如但不限于，比对照细胞产生的此类信号高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或甚至更高。

本文中在涉及升高的表达、分泌或酶活性时使用的术语“升高的”定义了作为预处理结果的表达、分泌或酶活性水平高于未经任何处理(例如预处理)的类似细胞中的表达、分泌或酶活性的基线水平，例如但不限于，比对照细胞产生的此类信号高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或甚至更高。

术语“肝”是指肝脏器官。术语“肝脏的一部分”通常是指来源于肝脏器官任何部分的组织样品，且对所述部分的量或其所源自的肝脏器官区域没有任何限制。优选地，肝脏器官中存在的所有细胞类型也可以存在于所述的肝脏的一部分中。肝脏的一部分的量可以至少部分地遵从实际考虑和需求，以获得对于合理实施本发明的方法而言足够的原代肝细胞。因此，肝脏的一部分可以代表占肝脏器官的百分比(例如，至少1％、10％、20％、50％、70％、90％或更多，通常为w/w)。在其他非限制性实例中，肝脏的一部分可以由重量来定义(例如，至少1g、10g、100g、250g、500g或更多)。例如，肝脏的一部分可以是肝叶，例如右叶或左叶，或是在劈肝手术或肝活检中被切除的包含大量细胞的任何片段或组织样品。

术语“成体肝脏”是指出生后，即出生后的任何时间、优选足月的受试者的肝脏，并且可以是例如出生后至少1天、1周、1个月或超过1个月的年龄，或至少1、5、10年或更长。因此，“成体肝脏”或成熟肝脏可存在于人受试者中，人受试者还将以“婴儿”、“儿童”、“青少年”或“成年人”的常规术语来描述。技术人员将理解，肝脏可以在不同的动物物种的出生后不同的时间间隔内达到实质的发育成熟，并且可以参考每个物种来适当地解读术语“成体肝脏”。

术语“哺乳动物”包括这样分类的任何动物，包括但不限于人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪和灵长类动物，例如猴和猿。

如本文所用，术语“解离”通常是指部分或完全破坏组织或器官的细胞组构，即部分或完全破坏细胞与组织或器官的细胞成分之间的联结。本领域技术人员可以理解，解离组织或器官的目的是从所述组织或器官获得细胞(细胞群)悬浮液。该悬浮液可包含单独的或单个的细胞，以及物理附着形成两个或多个细胞的簇或团块的细胞。解离优选不引起或引起尽可能小的细胞活力降低。

如本文所用，术语“原代细胞”包括存在于从受试者的组织或器官(例如肝脏)获得的细胞悬浮液中的细胞，所述悬浮液通过使用适当的技术使存在于这些外植的组织或器官中的细胞解离而获得。

术语“培养”在本领域中是常见的并且泛指细胞和/或其后代的维持和/或生长。

术语“传代”在本领域中是常见的，是指将培养的细胞与培养基质以及彼此之间分开和解离。为简单起见，在贴壁培养条件下第一次生长细胞后进行的传代在本发明的方法中称为“第一次传代”(或传代1，P1)。细胞可以传代至少一次，优选两次或更多次。传代1之后的每次传代在本文中以增加1的数字表示，例如传代2、3、4、5，或P1、P2、P3、P4、P5等。

如本文所用，术语“汇合”是指培养的细胞的密度，其中细胞彼此接触，覆盖几乎所有可用于生长的表面(即，完全汇合)。

术语“血浆”如常规定义，是指不构成人体或动物体一部分的组合物。

如常规定义，术语“血清”是按如下方式从全血样品中获得的：首先使样品中发生凝固，然后通过适当的技术、通常通过离心将血液样品中如此形成的凝块和细胞成分与液体成分(血清)分离。惰性催化剂(例如玻璃珠或粉)可以促进凝固。有利地，血清可以使用血清分离器皿(SST)来制备，其含有对哺乳动物呈惰性的催化剂。

术语“细胞培养基”或“细胞培养介质”或“培养基”是指包含可用于细胞维持或生长的营养成分的水性液体或凝胶状物质。细胞培养基可以含有血清或不含血清。

如本文所用，术语“生长因子”是指影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移的生物活性物质，并且可以单独地或在受到其他物质调节时影响生物体的发育、形态学和功能变化。生长因子通常可以作为配体与细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合来起作用。本文的生长因子可以特别是包含一个或多个多肽链的蛋白质实体。术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGF-β)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素相关生长因子(IGF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、白细胞介素-6(IL-6)家族(例如制瘤素M)、造血生长因子(HeGF)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族或糖皮质激素类的成员。当所述方法用于人肝细胞时，本方法中使用的生长因子可以是人或重组生长因子。在本方法中优选使用人和重组生长因子，因为预期这些生长因子会对细胞功能产生期望的影响。

如本文所用，术语“预处理”的肝祖细胞或干细胞被定义为在体外暴露于一种或多种信号分子的肝祖细胞或干细胞。优选地，将所述分子添加到所述细胞的细胞培养基中并持续一段预定的时间。

如本文所用，术语“细胞因子”是指由免疫细胞或其他细胞分泌的信号分子，例如生长、分化或趋化因子，其作用于免疫系统的细胞或专能细胞，例如但不限于T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、专能细胞，包括造血细胞、间充质干细胞和祖细胞，或其他细胞类型。代表性细胞因子包括但不限于吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、肝细胞生长因子(HGF)、由白细胞介素(例如但不限于白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10))组成的组、干扰素(例如干扰素-α(IFNα)和干扰素-γ(IFNγ))、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

术语“细胞群”和“细胞群体”一般是指一组细胞。除非另有说明，否则该术语是指基本上由本文定义的细胞组成或包含本文定义的细胞的细胞组。细胞群可基本上由具有共同表型的细胞组成，或可以包含至少一部分具有共同表型的细胞。当细胞在一个或多个可证明的特征方面基本相似或相同时，则称这些细胞具有共同的表型，所述特征包括但不限于：形态学外观、特定细胞成分或产物(例如RNA或蛋白)的表达水平、某种生化途径的活性、增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的响应、或体外培养期间的行为(例如，贴附或单层生长)。因此，这种可证明的特征可以定义细胞群或其一部分。如果大多数细胞具有共同的表型，则细胞群可能是“基本上同质的”。“基本上同质的”细胞群可包含至少60％、例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至至少99％的具有共同表型的细胞，例如具体提及的表型(例如，本发明的肝祖细胞或干细胞的表型，或本发明的肝祖细胞或干细胞的后代)。此外，如果存在于群体中的任何其他细胞不会改变或实质影响该细胞群的整体性质并因此可以将其定义为细胞系，则该细胞群可以基本上由具有共同表型的细胞组成，例如本发明的肝祖细胞或干细胞的表型(即，本发明的肝祖细胞或干细胞的后代)。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成显著刺激并且不会消除所施用的组合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的实例为但不限于丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物。

术语“足够量”是指足以产生所需和可测量的效果的量，例如足以改变蛋白表达谱的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。那些需要治疗的人包括那些已经患有该病症的人以及那些易于患有该病症的人或那些需要预防该病症的人。

如本文所用，术语“同种异体”是指供给的材料来自与受体不同的个体。同种异体干细胞移植是指一个人接受来自遗传上相似但不相同的供体的干细胞的程序。

如本文所用，术语“纤维化”是指在修复或反应过程中在器官或组织中形成过多的纤维结缔组织。

术语“肝纤维化”是指急性或慢性肝损伤后间质或“瘢痕”细胞外基质的积聚。肝硬化是进行性纤维化的终末阶段，其特征是隔膜形成和围绕肝细胞小节的瘢痕环。通常，纤维化需要数年或数十年才能在临床上显现出来，但肝硬化在数月内发展的值得注意的例外情况可以包括小儿肝病(例如胆道闭锁)、药物性肝病和与肝移植后免疫抑制相关的病毒性肝炎。

术语“rMFI”或“相对中值荧光强度”是用针对特定靶标的抗体测量的荧光强度与从对照抗体(同种型对照)获得的强度之比。

术语“遗传工程”、“遗传修饰”或“遗传操纵”是使用生物技术直接操纵生物体的基因。它是一组用于改变细胞的遗传组成的技术，包括在物种内和物种之间转移基因以产生改良的或新的生物体。新的DNA是通过用重组DNA方法分离和复制目标遗传物质或通过人工合成DNA而获得的。通常会创建一个构建体并将其用于将该DNA插入宿主生物体中。

术语“基因组编辑”或“基因组工程”是一种遗传工程，其中在活的生物体的基因组中插入、删除、修饰或替换DNA。与将遗传物质随机插入宿主基因组中的早期遗传工程技术不同，基因组编辑将插入序列靶向至位点特异性位置。

在第一方面，本发明提供了人成体肝源性祖细胞或干细胞的组合物，其中至少60％的所述祖细胞或干细胞表达细胞表面标志物HLA-E，或提供呈HLA-E阳性的分离的肝祖细胞或干细胞。

在分离的肝源性祖细胞中诱导HLA-E表达据显示能够显著增强其免疫抑制特性。所述表达HLA-E的细胞受到保护以免于CD8+T细胞介导的细胞溶解作用。不希望受理论束缚，认为HLA-E阳性祖细胞的免疫抑制特性是由HLA-E调节自然杀伤细胞的细胞毒活性的能力引起的。因此，HLA-E阳性祖细胞特别适合用于治疗和/或预防涉及不需要的免疫应答的病症，例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥，包括多种肝脏病症。

据信这些祖细胞能够保留其增殖能力，并且在特定培养基中温育可使这些细胞特异性地分化为肝脏特异性细胞类型。它们的增殖能力和肝脏特异性提高了肝细胞移植的功效和安全性。此外，由于它们的成体来源，这些干细胞避免了与胚胎细胞相关的免疫学、伦理学和致癌问题。

本发明的祖细胞的增强的免疫抑制特性有助于降低细胞疗法和/或组织移植的免疫应答相关风险，这些风险在同种异体细胞移植期间特别高。因此，本发明的HLA-E阳性肝源性祖细胞更有可能成功地作为具有不需要的免疫应答的病症(例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥)以及多种肝病的细胞疗法，并提高了患者的功效和耐受性。

在一个特定实施方式中，本发明提供了呈HLA-E阳性的人肝祖细胞、优选呈HLA-E阳性的人成体肝祖细胞。

出于本发明的目的，术语“HLA-E的表达”或“HLA-E阳性细胞”被定义为高于在野生型、原代未处理细胞中可观察到的基线HLA-E表达的表达。因此，与未处理的祖细胞或干细胞中的基线HLA-E表达相比，所述细胞具有升高的HLA-E表达水平。因此，本发明同样提供了从肝脏分离的祖细胞或干细胞的组合物，其与基线水平相比具有增强的HLA-E表达水平。基线HLA-E表达可与表达的缺失以及在缺失增强HLA-E表达的刺激物时的最低限度的表达相关。升高的表达水平是指例如但不限于测得的表达水平比对照细胞的表达测量值高至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍高或甚至更高。

在一个实施方式中，本发明涉及人成体肝源性祖细胞或干细胞的组合物，其中至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％的所述祖细胞或干细胞表达细胞表面标志物HLA-E。

在另一个或进一步的实施方式中，本发明涉及组合物或肝祖细胞或干细胞，其中表达HLA-E的细胞的通过流式细胞术测量的HLA-E相对中值荧光强度(rMFI)为至少6.5。rMFI是通过将靶标的中值荧光强度除以对照的中值荧光强度而获得的比率。通常认为rMFI是不受变化影响的稳定参数。在本发明的上下文中，使用抗(人)HLA-E抗体。合适的抗体的实例是来自Miltenyi的抗HLA-E抗体克隆REA1031。可用的流式细胞仪是

在另一个实施方式中，表达HLA-E的细胞的通过流式细胞术测量的HLA-E相对中值荧光强度(rMFI)为至少7、更优选至少8、更优选至少9、更优选至少10。在另一个实施方式中，所述rMFI为6.5至15，更优选为6.5至14，更优选为6.5至13，更优选为6.5至13，更优选为6.5至12。

另一种参与诱导免疫耐受的蛋白是HLA-G。与HLA-E一样，HLA-G也可以触发抑制性自然杀伤细胞受体并发挥免疫抑制功能。据报道，HLA-E和HLA-G可以协同工作。因此，在本发明的另一个实施方式中，肝祖细胞还对HLA-G呈阳性。HLA-E和HLA-G的协作进一步增强了相应的肝祖细胞的免疫抑制作用，使它们更适合用于细胞治疗方法。

在一个实施方式中，本发明的细胞群或组合物将显示出更高的HLA-G分泌。

在另一个实施方式中，本发明的细胞、包含所述细胞的群和组合物可以对至少一种间充质标志物呈阳性，间充质标志物包括但不限于波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)和CD140b。在另一个实施方式中，本发明的细胞、包含所述细胞的群和组合物分泌HGF。在另一个实施方式中，本发明的细胞、包含所述细胞的群和组合物对HLA-DR呈阴性。在另一个实施方式中，所述群和组合物还可选地对至少一种肝脏标志物和/或至少一种肝脏特异性活性相关标志物呈阳性。例如，肝脏标志物包括但不限于白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝脏特异性活性包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α-1-抗胰蛋白酶分泌、CYP3A4活性。这些标志物/活性的存在进一步确保了分离的肝祖细胞或干细胞的肝起源、专能性和维持的肝功能。

在一个实施方式中，所述细胞的特征还可以是：

a.对α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b和可选的白蛋白(ALB)呈阳性；

b.对含Sushi结构域的蛋白2(SUSD2)和细胞角蛋白-19(CK-19)呈阴性。

在另一个实施方式中，证实所述细胞表达CD90、CD73、波形蛋白、ASMA、CD140b和CD13，并分泌HGF。

在另一个或其他实施方式中，所述细胞也可以被表征为或测量为对以下呈阳性：

a.选自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4以及可选的白蛋白的至少一种肝脏标志物；和/或

b.选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的至少一种间充质标志物；和/或

c.选自尿素分泌、胆红素结合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的至少一种肝脏特异性活性；和/或

d.选自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的至少一种标志物；和/或

e.选自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2和HMCN1的至少一种标志物。

在另一个实施方式中，所述细胞经进一步测试并确定为对于标志物CD133、CD45、CK19和/或CD31呈阴性。

在本发明的另一个实施方式中，与未处理的肝源性祖细胞或干细胞中检测到的前列腺素E2(PGE2)分泌基线水平相比，所述肝源性祖细胞还具有升高的PGE2分泌水平。

在本发明的另一个实施方式中，与未处理的肝祖细胞或干细胞中检测到的基线酶活性相比，所述肝源性祖细胞还具有升高的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)酶活性水平。

在本发明的又一个实施方式中，与未处理的肝祖细胞或干细胞中检测到的基线表达水平相比，所述肝源性祖细胞还具有升高的一种或多种细胞因子或免疫调节因子的表达水平，所述因子属于由IDO、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、白细胞介素-6(IL-6)和/或IL-10组成的组。

PTGS2参与PGE2的产生，而IDO、PGE2、IL-6、IL-10和HGF是具有免疫调节特性的分泌因子。它们单独或组合的表达、分泌和/或酶活性的升高水平进一步有助于本发明的肝源性祖细胞的免疫抑制和免疫调节特性。因此，上述实施方式的细胞具有更强的免疫调节特性并且更安全地用于细胞疗法，特别是用于涉及同种异体细胞移植的疗法。

在一个实施方式中，所述组合物或细胞群可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约80％以上或约90％以上的祖细胞或干细胞，或者是所述祖细胞或干细胞的基本上同质或同质的群。所述组合物或细胞群的免疫抑制特性通过增加所述群内祖细胞或干细胞的量而进一步增强。

在本发明的一个实施方式中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。选择使得本发明的细胞保持存活并保留它们的免疫调节特性的药学上可接受的载体或稀释剂。所述载体可以是药学上可接受的溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。因此，本发明公开了包含如上所述的分离的肝祖细胞或干细胞、其细胞系或包含它们的细胞群的药物组合物。

优选地，本发明的包含分离的肝祖细胞的组合物可以包含至少10

在另一个实施方式中，本发明的组合物可以作为药物组合物提供，其可用于体内给药(在人或动物模型中)或体外应用的治疗方法中，其形式为包含例如新鲜细胞或适于长期储存的细胞(例如冷冻保存的细胞)等细胞的组合物。

在另一个或进一步的实施方式中，本发明的组合物可以提供为可供细胞进行体外和/或体内生长和分化的细胞悬浮液、海绵或其他三维结构，其包括生物人工肝装置、天然或合成基质、或允许细胞在适当位置(包括表达有助于细胞归巢和植入的趋化因子的炎症区域或组织损伤区域)植入和发挥功能的其他系统。特别地，本发明的组合物可以通过注射(也包括导管施用，静脉内或动脉内)或植入来施用，例如局部注射、全身注射、脾内注射、关节内注射、腹膜内注射、门静脉内注射、肝浆注射(例如肝包膜下)、肠胃外施用或子宫内注射至胚胎或胎儿。

本发明的细胞、组合物和细胞群可以通过各种方法获得。

在一个实施方式中，存在于组合物或细胞群中的本发明的所述干细胞或祖细胞包含编码HLA-E的核酸的外源序列。人类HLA-E的序列已知为NCBI中的基因ID3133。所述外源核酸的引入可以通过本领域通常已知的遗传工程技术来进行。所述外源核酸可以是例如包含载体、诱导型启动子、编码目标蛋白产物的序列等的核酸构建体。多种载体(例如质粒、表达载体、逆转录病毒载体等)在本领域已知用于将序列递送到细胞中。在一个实施方式中，载体是逆转录病毒或慢病毒载体。

本领域已知的各种技术可用于转染靶细胞，例如电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染和脂质转染等。引入DNA的具体方式对于实施本发明而言不是关键的。可以使用逆转录病毒和合适的包装细胞系的组合，其中衣壳蛋白将具有感染靶细胞的功能。通常，细胞和病毒将在培养基中温育至少约24小时。常用的逆转录病毒载体是“缺陷型的”，即无法产生生产性感染所必需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中的生长。

还可以选择目标蛋白产物以帮助检测和/或选择本文所述的祖细胞或干细胞群。为了检测或选择干细胞，将检测构建体引入疑似是或包含干细胞的细胞或细胞群中。在引入表达构建体后，将细胞维持足以表达可检测标志物的一段时间，通常至少约12小时且不超过约2周，并且可为约1天至约1周。

遗传构建体可以在扩增后从靶细胞中去除。这可以通过使用瞬时载体系统或通过包括位于所需蛋白编码序列侧翼的异源重组位点来实现。优选在表达载体中包含可检测的标志物，例如绿色荧光蛋白、萤光素酶、适用于抗体选择方法的细胞表面蛋白等，使得在构建体缺失后，可以容易地分离缺乏外源序列的细胞。

可以使用在哺乳动物细胞中提供瞬时或长期表达的表达载体。一般而言，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中高效复制的表达载体，使得宿主细胞积累许多个拷贝的表达载体，进而合成高水平的由表达载体编码的所需多肽。包括合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统允许便捷地短期扩增细胞，但不影响细胞的长期基因型。

在一些实施方式中，将所选择的细胞维持在培养物中以进行至少一次传代、通常至少约两次传代、至少约三次传代或更多，且不超过约10次传代、通常不超过约7次传代。在这样的培养之后，将细胞分选用于表达如上所述的可检测的标志物。

在一个实施方式中，通过靶向基因组编辑将所述外源核酸引入所述细胞中。用于靶向基因组编辑的常用方法是使用核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)系统。在一个优选实施方式中，使用CRISPR/Cas9系统将HLA-E引入所述干细胞或祖细胞中。

本发明同样提供了一种通过预处理或刺激来制备HLA-E阳性肝祖细胞或干细胞的方法。特别地，该方法包括细胞预处理步骤，该步骤是指将一种或多种细胞因子添加到肝祖细胞或干细胞的培养物的细胞培养基中。

在一个优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(a)解离成体肝脏或其一部分以形成原代肝细胞群；

(b)生成(a)的原代肝细胞的制剂；

(c)将(b)的制剂中包含的细胞培养到支持物上，该支持物允许细胞在其上贴附和生长并出现细胞群；

(d)至少传代(c)的细胞一次；

(e)在步骤(d)中的一次传代，优选在步骤(d)中的最后一次传代，用一种或多种细胞因子预处理细胞；和

(f)收获(e)的预处理后获得的细胞群。

在另一个实施方式中，在步骤(f)中获得的细胞中可选地测量HLA-E的表达，并且如果需要，对这些细胞进行进一步选择。

基线HLA-E表达可能与表达的缺失以及在培养基中缺失外源细胞因子时的最低限度的表达有关。

关于该方法的步骤(a)，解离步骤包括获得肝脏或其一部分，其包含与完全分化的肝细胞一起的一定量的可用于产生肝祖细胞或干细胞的原代细胞。

肝脏或其部分获自“受试者”、“供体受试者”或“供体”，这些术语可互换地指脊椎动物、优选哺乳动物、更优选人。肝脏的一部分可以是源自肝脏任何部分的组织样品，并且可以包含肝脏中存在的不同细胞类型。本发明的细胞优选分离自哺乳动物肝脏或肝脏的一部分，其中术语哺乳动物是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、实验室、运动或宠物动物，例如犬、马、猫、牛、小鼠、大鼠、兔等。更优选地，肝祖细胞或干细胞分离自人肝脏或其一部分，优选人成体肝脏或其一部分。根据本发明从成年人受试者的肝脏衍生的肝祖细胞或细胞系或其后代可以有利地用于例如研究和治疗患有涉及不需要的免疫应答的病症的患者，尤其是人类患者，所述病症为例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥，包括肝病。与其他干细胞来源(例如易于产生肿瘤生长的胚胎干细胞)相比，源自成体肝脏的干细胞降低了致癌偏差的风险，使其更安全地用于细胞移植。

在本发明的一个替代性实施方式中，成体肝脏或其部分可以来自非人类动物受试者、优选非人类哺乳动物受试者。如本文所述源自非人类动物或非人类哺乳动物受试者的肝脏的祖细胞或干细胞或细胞系或其后代可有利地用于例如研究和治疗相同、相关或其他非人类动物或非人类哺乳动物物种的成员的肝病，或甚至用于治疗患有肝病的人类患者(例如，异种移植、包含非人类动物或非人类哺乳动物细胞的生物人工肝装置)。作为示例而非限制，用于人类疗法的特别合适的非人类哺乳动物细胞可以源自猪。

供体受试者可以是活的或死亡的，这由本领域公认的标准确定，例如“心肺”标准(通常涉及循环和呼吸功能的不可逆停止)或“脑死亡”标准(通常涉及整个大脑、包括脑干的所有功能的不可逆停止)。采集可以包括本领域已知的程序，例如活组织检查、切除或割除。

技术人员将理解，采集供体受试者的肝脏或其部分的至少一些方面可能受到相应的法律和伦理规范的约束。作为示例而非限制，从活的人供体采集肝组织可能需要兼顾供体后续生命的维持。因此，通常可以从活的人供体中取出仅一部分肝脏，例如使用活组织检查或切除术，从而在供体中维持足够水平的生理肝功能。另一方面，从非人类动物采集肝脏或其部分可以但不必兼顾该非人类动物的后续存活。例如，在采集组织后，可以人道地处死非人类动物。这些和类似的考量对于技术人员来说是显而易见的，并且反映了法律和伦理学标准。

肝脏或其部分可以获自具有持续性循环(例如心脏跳动)和持续性呼吸功能(例如呼吸肺或人工通气)的供体、优选人类供体。根据伦理和法律规范，供体可能需要或不需要脑死亡(例如，切除整个肝脏或其部分，这不能兼容人类供体的后续存活，但在脑死亡人类中可以是允许的)。从这些供体中采集肝脏或其部分是有利的，因为组织不会遭受通常由局部缺血(循环停止)引起的显著缺氧(缺乏氧合作用)。

作为另一选择，肝脏或其部分可获自在采集组织时已停止循环(例如，心脏停止跳动)和/或已停止呼吸功能(例如，具有非呼吸肺且没有人工通气)的供体、优选人类供体。虽然来自这些供体的肝脏或其部分可能已经遭受至少一定程度的缺氧，但也可以从这些组织中分离出活的祖细胞或干细胞。肝脏或其部分可在供体的循环(例如，心跳)停止后约24小时内采集，例如在供体的循环(例如，心跳)停止后约20小时内、例如约16小时内、更优选约12小时内、例如约8小时内、甚至更优选约6小时内、例如约5小时内、约4小时内或约3小时内、更优选约2小时内、最优选约1小时内、例如约45、30或15分钟内采集。

可将所采集的组织冷却至约室温，或冷却至低于室温的温度，但通常避免冷冻组织或其部分，尤其是在这种冷冻会导致成核或冰晶生长的情况下。例如，组织可以保持在约1℃和室温之间、约2℃和室温之间、约3℃和室温之间或约4℃和室温之间的任何温度下，并且可以有利地保持在约4℃。如本领域已知的，组织也可以保持“在冰上”。组织可以冷却全部或部分缺血时间，即供体循环停止后的时间。即，组织可以经受热缺血、冷缺血或二者的组合。在处理前，所采集的组织可以保持例如至多48小时，优选少于24小时、例如少于16小时、更优选少于12小时、例如少于10小时、少于6小时、少于3小时、少于2小时或少于1小时。

在进一步处理组织之前，所采集的组织可以有利地(但不必须)保持(例如完全或至少部分地浸没)在合适的培养基中，和/或可以(但不必须)用合适的培养基灌注。技术人员能够选择合适的培养基，该培养基可以支持组织细胞在处理前期间的存活。

根据本领域已知的方法，例如EP1969118、EP3039123、EP3140393或WO2017149059中所述的方法，从肝脏或肝脏的一部分分离出祖细胞或干细胞。

简言之，首先从肝脏或其部分的解离中获得肝脏原代细胞群，以从所述肝脏或其部分形成原代细胞群。随后，在贴壁条件下培养包含在该制剂中的细胞，优选允许细胞贴附和生长到支持物上。接下来，这些细胞至少传代一次，最好在70％汇合时传代。最后，分离出对至少一种肝脏标志物和至少一种间充质标志物呈阳性并且具有至少一种肝脏特异性活性的细胞。

解离肝脏或其部分以获得原代细胞群(悬浮液)的合适方法可以是本领域公知的任何方法，包括但不限于酶消化、机械分离、过滤、离心及其组合。

关于所述方法的步骤(b)，本文中通过解离肝脏或其部分获得和定义的原代细胞群通常可以是异质的，即，其可以包含属于一种或多种属于任何肝脏构成细胞类型的细胞类型的细胞，包括祖细胞或干细胞，其可能存在于肝实质和/或肝非实质部分中。示例性的肝脏构成细胞类型包括但不限于肝细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)、库普弗细胞、肝星状细胞(Ito细胞)、卵圆形细胞和肝内皮细胞。上述术语具有本领域公认的含义并且在本文中被广义地解释为包括任何这样分类的细胞类型。

根据解离肝脏的方法和/或基于物理性质(尺寸、形态)、活力、细胞培养条件或细胞表面标志物的表达用任何适合的技术将初始制剂分级或富集以获得肝细胞和/或其他细胞类型的任何方法，原代细胞群可以包含不同比例(总细胞的0.1％、1％、10％或更多)的肝细胞。

本文中通过解离肝脏(或其部分)获得和定义的原代细胞群可以立即用于建立细胞培养物作为新鲜的原代肝细胞，或者优选地，使用常用技术将其储存为原代肝细胞的冻存制剂以将其长期保存。

关于步骤(c)，将步骤(b)中获得的肝原代细胞制剂直接培养到完全合成的支持物(例如塑料或任何聚合物)或预涂有饲养细胞、蛋白提取物或任何其他生物来源材料的合成支持物上，其允许类似的原代细胞的贴附和增殖，并允许出现具有所需标志物的成体肝祖细胞群，这些标志物优选通过免疫组织化学、流式细胞术或其他基于抗体的技术在蛋白水平上鉴定。原代细胞在细胞培养基中培养，以维持它们的贴附和同质细胞群的增殖和出现。如上定义的原代肝细胞的培养步骤导致培养物中肝祖细胞的出现和增殖，并且可以持续到肝祖细胞或干细胞已经充分增殖。例如，可以持续培养直到细胞群达到一定程度的汇合(例如，至少50％、70％或至少90％以上汇合)。

如EP3140393或WO2017149059中所述，在步骤(c)中获得的肝祖细胞或干细胞可以通过允许检测在该阶段(即，步骤(d)中所示的细胞传代之前)已有的相关标志物的技术来进一步表征。在用于鉴定此类标志物并将其测定为阳性或阴性的技术中，优选蛋白质印迹、流式细胞术免疫细胞化学和ELISA，因为这些技术允许在蛋白水平上检测标志物，即使在这一步时可用的肝祖细胞量少的情况下也是如此。

然后可以基于阳性标志物的存在进行肝祖细胞的分离，肝祖细胞可以对至少一种间充质标志物呈阳性。间充质标志物包括但不限于波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)和CD140-b。此外，肝祖细胞可以分泌HGF。此外，肝祖细胞可以可选地对至少一种肝脏标志物呈阳性和/或具有至少一种肝脏特异性活性。例如，肝脏标志物包括但不限于白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝脏特异性活性包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。

关于所述方法的步骤(d)，将原代细胞在细胞培养基中培养，以维持它们的贴附以及同质细胞群的增殖和出现，该细胞群在至少一次传代后逐渐富集肝祖细胞或干细胞。这些肝祖细胞可以快速扩增以产生足够的细胞以获得具有所需特性的后代(如EP3140393或WO2017149059中所述)，细胞倍增可在48-72小时内获得，并维持具有所需特性的肝祖细胞至少2、3、4、5或更多传代。

将分离的肝祖细胞平板接种在允许细胞贴附于其上的基质上，并在维持其进一步增殖的可含有血清或可无血清的培养基中培养，通常为液体培养基。通常，允许细胞贴附于其上的基质可以是任何基本上亲水的基质。目前用于使贴壁细胞生长的标准实践可以包括使用添加或不添加牛血清、人血清或其他动物血清的确定的化学培养基。这些培养基可以补充有机或无机化合物的适当混合物，不但可以提供营养成分和/或生长促进剂，还可以促进特定细胞类型的生长/贴附或消除/脱离。所添加的血清除了提供营养成分和/或生长促进剂外，还可以通过用能够更好地贴附细胞的基质层涂覆经处理的塑料表面来促进细胞贴附。如本领域技术人员所理解的，可以对细胞进行计数以便于随后以所需的密度来平板接种细胞。

在本发明的方法中，平板接种细胞的环境可以至少包含细胞培养基，通常为液体培养基，其支持分离的肝祖细胞的存活和/或生长。可以在将细胞引入之前、同时或之后将液体培养基添加到系统中。

通常，培养基会包含本领域已知的基础培养基制剂。许多基础培养基制剂可用于培养本文的原代细胞，包括但不限于Eagle氏最低必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)、α改良最低必需培养基(alpha-MEM)、基础必需培养基(BME)、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、必需改良的Eagle氏培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth氏MB 752/1或Williams培养基E，以及它们的修改和/或组合。上述基础培养基的组成是本领域公知的，并且针对培养的细胞按需改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的技能范围内。优选的基础培养基制剂可以是市售的一种，例如Williams培养基E、IMDM或DMEM，据报道它们可以维持成体肝细胞的体外培养，并且包括用于它们的适当生长、增殖、所需标志物和/或生物活性的维持或长期储存的生长因子混合物。另一种优选的培养基是可商购的支持肝祖细胞生长的无血清培养基，例如来自Miltenyi的StemMacs

此类基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。作为说明而非限制，这些成分可以包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲液(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐(例如丙酮酸钠)、乙酸盐(例如乙酸钠))等。还明显可见的是，许多培养基可作为含或不含丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。

为了用于培养，可以向基础培养基提供一种或多种其他成分。例如，可以使用额外的补充剂为细胞提供必需的微量元素和物质，以实现最佳生长和扩增。此类补充剂包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些成分可以包含在盐溶液中，例如但不限于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)、厄尔盐溶液。可以添加其他抗氧化剂补充剂，例如β-巯基乙醇。虽然许多基础培养基已经含有氨基酸，但一些氨基酸可能会后续补充，例如L-谷氨酰胺，已知它在溶液中不太稳定。可以向培养基进一步提供抗生素和/或抗真菌化合物，例如通常为青霉素和链霉素的混合物，和/或其他化合物，例如但不限于两性霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、壮观霉素、四环素、泰乐菌素和zeocin。

激素也可有利地用于细胞培养，包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素、L-甲状腺氨酸、上皮生长因子(EGF)和肝细胞生长因子(HGF)。肝细胞也可以受益于与三碘甲腺原氨酸、α-生育酚乙酸酯和胰高血糖素一起培养。

脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。此类脂质和载体可以包括但不限于环糊精、胆固醇、与白蛋白结合的亚油酸、与白蛋白结合的亚油酸和油酸、未结合的亚油酸、与白蛋白结合的亚油酸-油酸-花生四烯酸、未结合和结合至白蛋白的油酸等。白蛋白可类似地用于不含脂肪酸的制剂中。

还考虑用哺乳动物血浆或血清补充细胞培养基。血浆或血清往往含有活力和扩增所必需的细胞因子和成分。还考虑使用合适的血清替代物。用于本文所述的培养基的合适的血清或血浆可包括人血清或血浆，或来自非人类动物、优选非人类哺乳动物、例如非人类灵长类动物(例如狐猴、猴、猿)、胎牛或成年牛、马、猪、羔羊、山羊、犬、兔、小鼠或大鼠的血清或血浆等。在另一个实施方式中，上述血浆和/或血清的任意组合可用于细胞培养基中。

在本发明的另一个实施方式中，分离的肝祖细胞经过一种或多种细胞因子预处理。优选地，将所述细胞因子添加到肝祖细胞或干细胞的培养物的细胞培养基中。所使用的细胞可以是新鲜的、冷冻的或已经进行过预先培养的。

关于步骤(e)，用于预处理的培养基组合物可以具有相同的特征，可以与分离肝祖细胞期间使用的培养基组合物相同或基本相同。作为另一选择，培养基可以是不同的。

本发明的一个实施方式的分离的肝祖细胞的预处理因此涉及通过将相应的细胞因子添加到细胞培养基中而使细胞在体外暴露于一种或多种信号分子(在这种情况下是细胞因子)。适用于预处理的细胞因子可以是促炎细胞因子以及抗炎细胞因子，包括但不限于白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素(例如干扰素-α(INFα))和干扰素-γ(IFNγ))、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

特定标志物(例如HLA-E)的表达可以使用本领域已知的任何合适的免疫学技术(例如流式细胞术、免疫细胞化学或亲和吸附、蛋白质印迹分析、ELISA等)或通过任何合适的测量标志物mRNA的量的技术(例如诺瑟杂交、半定量或定量RT-PCR)等来检测。

如上所述，用细胞因子体外处理分离的祖细胞会诱导HLA-E表达。因此，在本发明的另一个实施方式中，与未经预处理的肝祖细胞或干细胞中的基线HLA-E表达相比，经预处理的细胞具有升高的HLA-E表达水平。因此，本发明同样提供了通过向细胞培养基中加入一种或多种细胞因子来制备与基线水平相比具有增强的HLA-E表达水平的经预处理的从肝脏分离的祖细胞的方法。基线HLA-E表达可能与表达的缺失以及在培养基中缺失外源细胞因子时的最低限度的表达有关。升高的表达水平是指例如但不限于测得的表达水平比对照细胞的表达测量值高至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或甚至更高。

优选地，细胞因子，即IFNγ、TNFα、IL-1β和可选的IL-10及其组合，用于诱导HLA-E表达。因此，在本发明的另一个实施方式中，优选用选自IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-10及其任意组合的细胞因子来预处理成体肝祖细胞或干细胞。发现这些细胞因子高效地诱导肝祖细胞中HLA-E的表达。在一个实施方式中，细胞因子至少是IFNγ和TNFα。在一个优选实施方式中，混合物还包含IL-1β和/或IL-10。这些特定的细胞因子组合在诱导肝祖细胞或干细胞中的HLA-E表达方面表现出提高的效率。

在一个实施方式中，细胞因子以5ng/ml至400ng/ml、优选10ng/ml至360ng/ml、更优选20ng/ml至240ng/ml的总终浓度添加到细胞的细胞培养基中。在本发明的另一个或进一步的实施方式中，细胞培养基中的单个细胞因子浓度为5至100ng/ml、更优选10至80ng/ml、最优选20至60ng/ml。

更特别地，当细胞被预处理1小时至72小时、更优选12小时至60小时、更优选24小时至60小时、最优选24小时至48小时时，用细胞因子预处理肝祖细胞的有效性对HLA-E表达最有效。

认为所述的浓度和处理持续时间范围足以在所述细胞中诱导可接受的HLA-E表达。

关于上述步骤(f)，在本发明的另一个实施方式中，细胞群的可选分离适用于具有与未经预处理的肝祖细胞或干细胞相比升高的HLA-E水平的细胞。

如上所述，本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的HLA-E阳性的分离的肝祖细胞或干细胞、其细胞系或包含此类细胞的细胞群、或其后代(包括分化的后代)，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，其可选地经过遗传修饰。

在另一方面，本发明提供了用于治疗肝病的上述组合物，包括但不限于：

-(同种异体)肝细胞移植，以治疗肝脏代谢缺陷、肝脏退行性疾病或暴发性肝衰竭，

-制备生物人工肝装置，

-由于在动物中移植本发明的分离的祖细胞或干细胞或其群，制备人类肝病的动物模型，

-制备毒理学、药理学的体外和动物模型，

-对本发明的分离的祖细胞或干细胞或其群测试新药物，包括用于人类肝炎病毒的抗病毒药物。

因此，本发明的细胞可用于治疗肝脏相关疾病，包括但不限于肝衰竭、肝炎和先天性代谢障碍。由于它们的免疫调节特性，本发明的组合物特别适合用于治疗与炎症或免疫应答相关的肝病。包括涉及可能的免疫相关风险的肝细胞移植的治疗也受益于包含本发明的肝祖细胞的组合物的突出的免疫调节特性。

本发明还公开了用于以下目的的分离的祖细胞或干细胞、其群或包含后者的组合物：

-治疗具有不需要的免疫应答的病症，例如但不限于炎症、自身免疫病和移植排斥，

-用于免疫疗法中，

-治疗纤维化病症，包括但不限于肝纤维化病症、肺纤维化、肾纤维化、前列腺纤维化、乳腺纤维化、心肌纤维化和其他涉及纤维化特定标志物增加的病症，所述纤维化特定标志物为任何生化、血清学标志物或任何其他可与纤维化病、肝纤维化和/或慢性纤维炎性疾病(包括纤维炎性慢性肝衰竭)的存在相关的临床或超声描记术特征，

-肝祖细胞或干细胞移植，以治疗基于肝脏的先天性代谢缺陷：

此类疾病的非穷举性实例包括苯丙酮尿症和其他氨基酸病、血友病和其他凝血因子缺乏症、家族性高胆固醇血症和其他脂质代谢障碍、尿素循环障碍、糖原增多症、半乳糖血症、果糖血症、酪氨酸血症、蛋白和碳水化合物代谢缺乏症、有机酸尿症、线粒体病、过氧化物酶体和溶酶体疾病、蛋白合成异常、肝细胞转运蛋白缺陷和糖基化缺陷等，

-治疗获得性进行性肝退行性疾病，

-治疗暴发性肝衰竭和急性或慢性肝衰竭，

-用于生物人工肝装置和肝脏辅助装置中，

-人类肝病的动物模型。

本发明的HLA-E阳性肝祖细胞或其细胞群或包含它们的组合物可通过肝内或肝外位置的肝细胞移植(LCT)而用于组织工程和细胞疗法中(包括用于调节对肝或其他器官和组织的在先或随后移植的免疫应答)。使用这种方法，也可以通过将本发明的分离的人肝祖细胞或包含它们的组合物移植到动物中来获得人类肝病的动物模型，其中可以更有效地评价化合物对人肝细胞的影响并区别于在动物模型中的影响。

-制备人类嗜肝病毒感染(HBV、HAV、HCV、HEV、HDV...)的动物模型，

-研究自然史、传播、抗性、治疗效果、抗病毒药物的使用或使用本发明的移植肝祖细胞或干细胞的任何研究，

-使用本发明的肝祖细胞或干细胞制备毒理学、药理学和药物遗传学的体外细胞模型和体内动物模型，

-对本发明的肝祖细胞或干细胞测试新药物，

-基因疗法，通过在本发明的肝祖细胞或干细胞中插入病毒序列，然后可以在体外扩增，

-研究人类肝细胞代谢的动物模型，

-对同种异体细胞的耐受性，

-使用本发明的肝祖细胞或干细胞来避免、预防或治疗肝或肝细胞同种异体移植排斥。

如上所述，由于本发明的肝祖细胞的免疫抑制特性，可以将本发明的组合物施用于目标组织以保护该组织免受炎症、纤维化和随后的破坏。这在细胞替代疗法中尤其有利，其中不需要的免疫反应通常会产生有害后果。本发明的组合物因此可用于细胞替代疗法。可以将祖细胞施用于受试者的目标组织、优选肝组织，以补充功能细胞或替换已经失去功能并且要避免导致纤维化和组织破坏的炎症的细胞。因此，所述祖细胞、其细胞系、其细胞群和包含后者的组合物特别适合用于治疗纤维化病症，包括但不限于肝纤维化病症、肺纤维化、肾纤维化、前列腺纤维化、乳腺纤维化、心肌纤维化和其他涉及纤维化特定标志物增加的病症，所述纤维化特定标志物为任何生化、血清学标志物或任何其他可与纤维化病、特别是纤维炎性慢性肝病(其中肝脏中的纤维炎症反应常常导致慢性肝衰竭)的存在相关的临床或超声描记术特征。所述肝源性祖细胞的免疫抑制特性有助于减少或预防导致肝功能进行性丧失的持续性纤维炎症反应。另一方面，肝祖细胞再生和分化为肝细胞类型的能力有助于肝再生，从而有助于预防慢性肝衰竭。

以导致肝脏质量和/或功能丧失的肝纤维化为典型特征并且可以受益于本发明的具有升高的HLA-G水平的肝祖细胞或干细胞的疾病状态或缺陷包括但不限于Alagille综合征、酒精性肝病(酒精性肝硬化)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症(所有表型)、高脂血症和其他脂质代谢障碍、自身免疫性肝炎、布加综合征、胆道闭锁、进行性家族性胆汁淤积I、II和III型、肝癌、Caroli病、Crigler-Najjar综合征、果糖血症、半乳糖血症、碳水化合物缺陷型糖基化缺陷、其他碳水化合物代谢障碍、雷弗素姆病和其他过氧化物酶体疾病、Niemann Pick病、沃尔曼病和其他溶酶体疾病、酪氨酸血症、三重H和其他氨基酸代谢紊乱、杜宾-约翰逊综合征、脂肪肝疾病(包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、慢性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、吉尔伯特综合征、糖原贮积病I和III、血色素沉着病、A-G型肝炎、卟啉症、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、酪氨酸血症、凝血因子缺乏症、B型血友病、苯丙酮尿症、威尔森氏病、暴发性肝衰竭、肝切除术后肝衰竭、线粒体呼吸链疾病。此外，这些细胞还可用于治疗病毒感染引起的获得性肝病。

因此，提供了本发明的祖细胞或干细胞、其细胞系、细胞群和/或组合物用于治疗和/或用于制造用于治疗肝病的药物的用途。此类疾病可包括影响肝组织的病症、影响肝细胞活力和/或功能的疾病以及由纤维炎症反应引起的慢性肝衰竭。此外，由于免疫调节和免疫抑制特性，提供了本发明的祖细胞或干细胞、其细胞系、细胞群和/或组合物用于治疗和/或用于制造用于治疗需要避免不希望的免疫应答的疾病的药物的用途。施用本发明的细胞可导致受试者的组织重建或再生。所述细胞的施用方式允许它们移植或迁移到目标组织部位并重建或再生功能缺陷区域或保护该区域免受可能由炎症反应引起的进一步损伤。

本说明书还描述了一种预防和/或治疗肝病的方法，包括将本发明的组合物施用至需要这种治疗的受试者。这种施用通常是以治疗有效量进行，即通常为提供所需的局部或全身效应和性能的量。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的成体肝祖细胞或干细胞、其细胞系或包含其的细胞群的药物组合物。作为示例而非限制，本发明的分离的肝祖细胞或干细胞、其细胞系或包含其的细胞群或其后代可以有利地通过注射(也涵盖导管施用)或植入来施用，例如局部注射、全身注射、脾内注射(另见Gupta等，Seminars in Liver Disease12:321,1992)、门静脉注射、肝浆注射(例如肝包膜下)、肠胃外施用或子宫内注射至胚胎或胎儿。

本发明的肝源性祖细胞或干细胞、其细胞系或包含其的细胞群或其后代(可选地进行了遗传修饰)或包含它们的药物组合物，可通过肝细胞移植(LCT)而进一步用于组织工程和细胞疗法。肝细胞移植和肝干细胞移植(LSCT)是指以导致细胞进入并植入肝脏的任何方式输注成熟肝细胞或肝祖细胞(包括本发明的细胞)的技术，优选通过门静脉输注，但也可通过直接肝内注射或脾内注射。

例如，在分离程序后或在冷冻保存后的解冻后，细胞可以作为任何保存介质(优选含有人白蛋白)中的细胞悬浮液提供。

在一个实施方式中，本发明考虑使用患者自身的肝组织来分离本发明的祖细胞或干细胞。这种细胞对患者来说是自体的，并且可以容易地施用给患者。然而，如果患者包含例如造成特定病理状况的遗传缺陷，则可以通过对获得的细胞进行基因操纵或通过使用从非该患者自身的组织中分离出的祖细胞或干细胞来避免这种缺陷，这在本领域中也称为同种异体干细胞移植。

在考虑向患者施用此类细胞的情况下，可以优选选择经受本发明的方法以获得祖细胞或干细胞的肝组织，从而至少在可实现的限度内最大化患者与所施用的细胞之间的组织相容性。尽管做出了这些努力，患者的免疫系统排斥所施用的细胞的风险仍然很高(例如移植物与宿主排斥)。包含本发明的肝源性祖细胞的组合物进一步降低了同种异体LCT或LSCT的排斥风险，因此在进一步的实施方式中，本发明提供了用于同种异体移植的组合物。

与本发明的祖细胞或干细胞的治疗用途有关的问题是达到最佳效果所需的细胞量。施用剂量可以是可变的，可以包括初始施用和随后的后续施用，并且可以由掌握本公开内容的技术人员确定。通常，所施用的一个或多个剂量将提供治疗有效量的细胞，即实现所需的局部或全身效应和性能的量。此外，技术人员可以容易地确定要施用于受试者的本发明的药物组合物中的可选的添加剂、载剂和/或载体。通常，任何添加剂(除了活性祖细胞或干细胞和/或细胞因子之外)可以以0.001至50％(w/w或w/v)溶液的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，而活性成分通常可以以微克至毫克的数量级存在，例如约0.0001至约5％(w/w或w/v)，优选约0.0001至约1％，最优选约0.0001至约0.05％，或约0.001至约20％，优选约0.01至约10％，最优选约0.05至约5％。

当施用包含HLA-E阳性肝祖细胞或其群的治疗性组合物时，它通常可以配制成单位剂量。在任何情况下，可能需要包括试剂和/或采用已知方法将细胞施用于患者以确保本发明的细胞或其细胞群的活力，例如通过将细胞掺入生物聚合物或合成聚合物中。合适的生物聚合物的实例包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白和蛋白聚糖层粘连蛋白、粘附分子、蛋白聚糖、透明质酸、糖胺聚糖链、壳聚糖、藻酸盐、源自此类蛋白的天然或合成修饰的肽、以及合成的可生物降解且生物相容的聚合物。这些组合物可以在包含或不包含细胞因子、生长因子的情况下生产，并且作为悬浮液或作为嵌入有细胞的三维凝胶施用。

根据需要，可以通过将在实施本发明时使用的细胞掺入所需量的适当溶剂(具有各种量的其他成分)中来制备无菌可注射溶液。此类组合物还可与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖或右旋糖等)混合。取决于施用途径和所需的制剂，组合物可以含有辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和色素等。

通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，这些实施例进一步说明本发明，并且不意图也不应将它们解释为限制本发明的范围。

实施例

(a)肝祖细胞的制备

如EP3140393或WO2017149059所述，从健康尸体或无心跳的供体的肝脏中分离出人成体肝祖细胞。

简言之，将肝细胞制剂重新悬浮在补充有10％FBS、10mg/ml INS、1mM DEX的Williams'E培养基中。原代细胞在

(b)肝祖细胞的预处理

在P5时使用IL-1β(5-100ng/mL，peprotech，ref：200-1B)、IFNγ(5-100ng/mL，prospec，ref：CYT-206)、TNFα(5-100ng/mL,prospec,ref:CYT-223)、IL-10(5-100ng/mL,peprotech,ref:200-10-10UG)和/或其组合对达到80-90％汇合的细胞进行炎症致敏(priming)48小时，其中“全部一起”用于指用IL-1β、IFNγ、TNFα和IL-10的组合处理的细胞。然后，收集上清液并用重组胰蛋白酶(trypLE；LifeTech)和1mM EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化以进行分析。

通过流式细胞术评估未处理和经处理的细胞的HLA-E表达。

将总共5×10

如图1和图2所示，根据本发明的一个实施方式，通过向细胞的细胞培养基中添加一种或多种细胞因子来预处理肝祖细胞，导致了细胞的HLA-E表达水平与未经预处理的细胞中的基线HLA-E表达水平(对照条件)相比升高。

图3所示的结果显示了用特异性mAb染色的细胞的平均荧光强度(MFI)，并确认了经预处理的肝祖细胞群的HLA-E阳性特性，与对照条件(未处理)相比，经预处理的肝祖细胞群显示出升高的MFI水平。结果表示为平均值±SEM。所有数据均用Prism5软件进行分析。

如实施例1中所述制备经预处理的成体肝祖细胞和对照细胞。

使用RT-PCR表征基因表达。根据制造商的说明，使用商业试剂盒合成cDNA。样品在实时PCR机上一式两份运行。基因表达的相对定量通过将信号强度相对于内源对照转录物归一化来建立。归一化后，绘制数据并在用不同的细胞因子组合预处理的肝祖细胞群之间进行比较。

更详细地，使用GenElut

用于当前研究的商业引物和探针如下列出(所有产品均来自Thermo Fisher)：GAPDH-Hs99999905_m1、HLA-G-Hs00365950_g1、HLA-E-Hs03045171_m1、IDO1-Hs00984148_m1、HGF-Hs00300159_m1、PTGS2-Hs00153133_m1、IL-6-Hs00174131_m1、IL-10-Hs00961622_m1。

图4显示，经预处理的肝祖细胞对HLA-E呈阳性。与未经预处理的肝祖细胞中的基线HLA-E表达相比，经预处理的肝祖细胞具有升高的HLA-E表达水平。此外，图4显示经预处理的HLA-E阳性细胞还可以对HLA-G呈阳性。结果表示为平均值±SEM(n＝3)。所有数据均用Prism 5软件进行分析。

与在未经预处理的肝祖细胞或干细胞(对照)中检测到的基线表达水平相比，呈HLA-E阳性或具有升高的HLA-E水平的肝祖细胞还可具有升高的一种或多种细胞因子和/或具有免疫调节特性的因子的基因表达水平。图5显示出，在包含升高量的HLA-E阳性细胞的经预处理的肝祖细胞群中，吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、IL-6和IL-10的基因表达水平升高。对分离自三个不同的供体(n＝3)的肝祖细胞或干细胞进行了测试。结果表示为平均值±SEM。

如实施例1中所述制备经预处理的肝祖细胞。

在从经预处理的肝祖细胞收获的上清液中测量可溶性蛋白的表达。可溶性HLA-G蛋白的定量是如下所述使用商业酶联免疫测定(ELISA)试剂盒进行的。

可溶性HLA-G ELISA使用CLIA试剂盒进行：人HLA-G ELISA试剂盒(CLIA)-LS-F30041。将100μL细胞培养上清液或标准品与捕获抗体在37℃下温育90分钟。温育后，每孔加入100μl生物素化检测抗体并在37℃下保持1小时。洗涤步骤后，将100μL/w HRP偶联物在37℃下温育30分钟。洗涤五次后，将板与化学发光底物在37℃下避光温育5分钟。在温育时间结束时，立即使用微孔板照度计分析板以确定每个孔的相对光单位(RLU)。该测定的检测范围为0.16-10ng/ml sHLA-G。每个样品一式两份进行测试。

图6所示的结果表明，经预处理的肝祖细胞在其上清液中具有增强的HLA-G水平。

使用商业酶联免疫测定(ELISA)试剂盒测量可溶性蛋白的表达。HLA-E阳性肝祖细胞或具有与基线HLA-E表达相比升高的HLA-E表达水平的肝祖细胞还具有与在未经预处理的肝源性祖细胞或干细胞(未处理)中检测到的PGE2基线水平相比升高的PGE2(前列腺素E2)分泌水平。

图7证实了在根据本发明的实施方式用选自IFNγ、TNFα、IL-1β和/或IL-10的一种或多种细胞因子预处理后，具有升高的HLA-E水平的肝祖细胞中免疫调节因子PGE2的分泌升高。对分离自三个不同的供体(n＝3)的肝祖细胞进行了测试。结果表示为平均值±SEM。所有数据均用Prism 5软件进行分析。

如实施例1中所述制备经预处理的HLA-E阳性肝祖细胞。

使用荧光显影剂测量IDO1的酶活性，该显影剂选择性地与化合物N-甲酰基犬尿氨酸(NFK)反应以产生高荧光性产物(Ex/Em＝402/488nm)。NFK的形成与IDO酶活性的量直接相关。

如图8所示，与未经预处理的肝祖细胞(未处理)中的基线IDO1酶活性相比，经预处理的肝祖细胞中的IDO1酶活性增强。对分离自三个不同的供体(n＝3)的肝祖细胞进行了测试。结果表示为平均值±SEM。所有数据均用Prism 5软件进行分析。

本发明不应当限于先前描述的任何实现形式，并且可以在不重新评估所附权利要求的情况下向所呈现的制造例添加一些修改。

将细胞解冻并以30.000个细胞/cm

HLA-E的表达通过流式细胞术(MacsQuant)使用抗HLA-E抗体(#130-117-401，来自Miltenyi的Clone REA1031)来测定。相对中值荧光强度(rMFI，MFI抗体/MFI同种型)以及表达HLA-E的细胞的百分比已使用同种型对照抗体确定。

结果：

发现每个细胞的HLA-E表达在受刺激的细胞中与未受刺激的细胞相比有所增加。此外，群体中HLA-E阳性细胞的百分比显著增加，导致细胞群具有高百分比的表达HLA-E的细胞，这对于治疗用途是有用的。

图9A显示了代表性直方图，显示了用促炎混合物刺激的肝祖细胞中HLA-E的更高表达。图9B显示了有或没有促炎处理的HLA-E阳性细胞的平均百分比。处理24小时后，与未处理的细胞相比，经处理的群体显示出HLA-E阳性细胞的增加(14.7％对86.4％)。在刺激条件下，HLA-E阳性细胞最少为69.6％，最多为98.2％，而在未刺激的群体中，HLA-E阳性细胞为4.1％至22.3％。当细胞与同种型对照相比具有更高的荧光强度时，认为该细胞是HLA-E阳性的，如图9A所示。

图9C显示了刺激24小时后HLA-E的表达增加：受刺激细胞的平均rMFI为8.3，而未受刺激细胞的平均rMFI为3.0。在刺激条件下，观察到rMFI在6.8和11.8之间，而在未刺激的细胞中，检测到rMFI为2.2至3.8(rMFI：相对中值荧光强度，或MFI抗体/MFI同种型(细胞被HLA-E抗体染色时的荧光信号除以细胞被同种型对照染色时的荧光信号))。(n＝5，包括两个不同的肝脏供体)。

使用从PBMC中分离出的CD8+T细胞开发了一种基于细胞的测定方法，以研究HLA-E的表达对肝干细胞或祖细胞的影响。

人CD8+T细胞的分离和培养：

通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从正常成体供体的血沉棕黄层中分离出人外周血单个核细胞(PBMC)。根据制造商的说明(Invitrogen

肝干细胞培养和预处理：

在细胞毒性测定开始前两天(＝第-2天)，将肝干细胞解冻并以30.000个细胞/cm

CD8+T细胞细胞毒性测定：

进行了两次连续的共培养。将来自第一次接触的CD8+T细胞与同一批肝干细胞一起放回培养物中。第0天的第一次接触始于在24孔板中以20000个细胞/cm

促炎预处理对CD8+T细胞细胞毒性抗性的影响通过光学显微镜、共培养结束时活力和细胞计数的测定以及通过测量共培养上清液中分泌的IFNγ(CD8+T细胞活化的替代物)来评估。

结果：

图10A显示了与CD8+T细胞共培养(第二次接触的第5天)后肝干细胞的代表性图片。在共培养结束时仍观察到用促炎细胞因子刺激的肝干细胞，而大多数未受刺激的细胞被杀死。

图10B显示了与CD8+T细胞共培养(第二次接触)结束时的肝干细胞计数。细胞计数通过流式细胞术测定(使用来自Miltenyi的MacsQuant进行绝对计数，不包括CD8+阳性细胞)。当细胞受到刺激时，与未受刺激的细胞相比，计数的细胞更多，平均分别为15199和3581个细胞(n＝4，包括两个不同的肝脏供体和两个PBMC供体)。

图10C显示了与肝干细胞共培养(第二次接触)结束时的CD8+T细胞计数。在实验结束时测量CD8+T细胞的数量，因为T细胞一旦被激活就会增殖。平均而言，与受刺激的细胞相比，在与未受刺激的细胞共培养结束时有更多的CD8+T细胞(188369对87930个细胞)。CD8+T细胞的数量通过流式细胞术来计数(使用Miltenyi的MacsQuant进行绝对计数，仅包括CD8+阳性细胞)。(n＝4，包括两个不同的肝脏供体和两个PBMC供体)。

图10D显示了表达高水平HLA-E的肝祖细胞群/CD8+T细胞共培养(第二次接触)结束时的IFNγ浓度。与受刺激的肝祖细胞相比，当CD8+T细胞与未受刺激的肝祖细胞一起温育时，共培养物上清液中的IFNγ浓度更高。由于T细胞分泌的IFNγ与激活有关，这表明受刺激的肝干细胞激活的CD8+T细胞较少。通过ELISA在CD8+T细胞-肝干细胞共培养上清液中测量IFNγ。(n＝12，包括两个不同的肝干细胞供体和四个PBMC供体)。

结论：

在用促炎混合物刺激后，表达高水平HLA-E的肝祖细胞群受到保护免受CD8+T细胞介导的细胞溶解作用。此外，与未受刺激的细胞相比，当与受刺激的肝干细胞一起温育时，CD8+T细胞的活化会降低(如T细胞增殖和IFNγ分泌的减少所示)。这种保护作用与更高的HLA-E表达水平相关。