一种体内外抗RSV的甘草有效部位及其制备方法和应用

摘要

本申请公开了一种体内外抗RSV的甘草有效部位及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该用于体内外抗RSV的甘草有效部位，所述甘草有效部位为从甘草粗提取物中获得的正丁醇部位；所述甘草粗提取物为甘草经水提取后得到。该体内外抗RSV的甘草有效部位，该甘草有效部位对RSV的吸附阶段及复制阶段具有较好的抑制作用；可改善RSV所带来的肺组织损伤，显著降低小鼠肺指数，显著降低小鼠血清中TLR4、NF‑кB、TNF‑α、keap1的表达水平，并显著升高小鼠血清中Nrf2、IFN‑β的表达水平。

说明书

技术领域

本申请涉及一种体内外抗RSV的甘草有效部位及其制备方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)感染是儿科临床中常见的一类疾病，婴幼儿是主要患病人群，几乎所有2岁以下的儿童都有过RSV病毒感染。RSV具有高度传染性，可以通过人和人体液的直接传播，也可以存活在物体表面，当接触受污染的东西时，则很容易被传染，而且由于感染RSV病毒后不会产生终生免疫，所以常常会发生反复感染。

目前，国内外没有针对治疗RSV感染的特效药，国际上批准使用的药物仅有利巴韦林和帕利珠单抗，但效果存在争议，尤其是利巴韦林具有致畸作用。因此，研制安全的RSV感染治疗药物成为关键。

发明内容

为了解决上述问题，提供了一种体内外抗RSV的甘草有效部位，该甘草有效部位对RSV的吸附阶段及复制阶段具有较好的抑制作用；可改善RSV所带来的肺组织损伤，显著降低小鼠肺指数，显著降低小鼠血清中TLR4、NF-кB、TNF-α、keap1的表达水平，并显著升高小鼠血清中Nrf2、IFN-β的表达水平。

一种用于体内外抗RSV的甘草有效部位，所述甘草有效部位为从甘草粗提取物中获得的正丁醇部位；所述甘草粗提取物为甘草经水提取后得到。

优选的，所述甘草有效部位为所述甘草粗提取物依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后得到的正丁醇部位。

根据本申请的另一个方面，提供了一种用于体内外抗RSV的甘草有效部位的制备方法，包括如下步骤：

(1)在甘草中加水、浸泡、加热回流提取、浓缩，得甘草水提取液；

(2)将所述甘草水提取液依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，保留正丁醇萃取液，制得甘草有效部位。

优选的，所述步骤(2)包括：

在所述甘草水提取液中加入石油醚，所述石油醚的体积与所述甘草水提取液的体积比为1:1，用石油醚萃取2-3次，至石油醚层无色，分离，保留水相，为第一水相；

在所述第一水相中加入二氯甲烷，所述二氯甲烷的体积与所述第一水相的体积比为1:1，用二氯甲烷萃取2-3次，至二氯甲烷层无色，分离，保留水相，为第二水相；

在所述第二水相中加入乙酸乙酯，所述乙酸乙酯的体积与所述第二水相的体积比为1:1，用乙酸乙酯萃取2-3次，至乙酸乙酯层无色，分离，保留水相，为第三水相；

在所述第三水相中加入正丁醇，所述正丁醇的体积与所述第三水相的体积比为1:1，用正丁醇萃取2-3次，至正丁醇层无色，分离，保留正丁醇层，即得所述甘草有效部位。

优选的，所述步骤(1)包括：

将甘草洗净，加入12倍甘草重量的水，浸泡30min，加热回流提取90min，共提取两次，合并两次提取液，浓缩，得甘草水提取物。

优选的，将步骤(2)中的正丁醇层浓缩、减压干燥至干粉状。

优选的，步骤(2)中的所述正丁醇为水饱和正丁醇溶液。

根据本申请的又一个方面，提供了一种用于体内外抗RSV的甘草有效部位在制备预防和/或治疗RSV的药物中的应用。

优选的，所述甘草有效部位在制备预防和/或治疗RSV致呼吸系统损伤的药物中的应用；所述呼吸系统损伤选自炎症反应、氧化应激所致的呼吸系统损伤。

优选的，所述甘草有效部位抗RSV的活性为，CC

优选的，所述甘草有效部位对RSV复制周期中的吸附阶段以及复制阶段具有抑制作用。

优选的，所述甘草有效部位在体外抗RSV时，加入时间在-2-2h以及8-12h对RSV具有抑制作用。

优选的，加入时间在-2-2h时可使病毒毒力降低96.47％，加入时间在8-12h时可使病毒毒力降低82.12％。

本申请中，“CC

“EC

“DMEM”，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。

“TI”，是指治疗指数，计算方法为TI＝CC

本申请的有益效果包括但不限于：

1.本申请提供的体内外抗RSV的甘草有效部位，对RSV的吸附阶段及复制阶段具有较好的抑制作用；可改善RSV所带来的肺组织损伤，显著降低小鼠肺指数，显著降低小鼠血清中TLR4、NF-кB、TNF-α、keap1的表达水平，并显著升高小鼠血清中Nrf2、IFN-β的表达水平。

2.根据本申请的体内外抗RSV的甘草有效部位的制备方法，工艺简便、易于操作，有利于推广。

3.根据本申请的体内外抗RSV的甘草有效部位的应用，在预防和/或治疗RSV感染的呼吸系统损伤中具有较好的效果，且副作用小。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请实施例1涉及的正丁醇部位抗RSV作用图；

图2为本申请实施例1涉及的甘草酸抗RSV作用图；

图3为本申请实施例1涉及的甘草次酸抗RSV作用图；

图4为本申请实施例1涉及的甘草酸单铵盐抗RSV作用图；

图5为本申请实施例1涉及的利巴韦林抗RSV作用图；

图6为本申请实施例2涉及的利巴韦林在RSV感染过程中的加时实验；

图7为本申请实施例2涉及的正丁醇部位在RSV感染过程中的加时实验；

图8为本申请实施例3涉及的小鼠肺组织结构图，其中A为模型组小鼠的肺组织结构图，B为正常对照组小鼠的肺组织结构图，C为正丁醇部位组小鼠的肺组织结构图，D为利巴韦林组小鼠的肺组织结构图；

图9为本申请实施例3涉及的正丁醇部位对感染RSV小鼠的肺指数的影响；

图10为本申请实施例3涉及的正丁醇部位对RSV感染小鼠血清中TLR4、NF-κB、TNF-α、IFN-β表达水平的影响；

图11为本申请实施例3涉及的正丁醇部位对RSV感染小鼠血清中keap1、Nrf2表达水平的影响。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的材料均通过商业途径购买，其中：

1、药品及主要试剂

甘草药材，购于亳州中强中药饮片有限公司(产地：新疆和田，批号：191101)；

利巴韦林，购于北京索莱宝科技有限公司；

胎牛血清(美国Gibco公司，批号：42A0378K)；

DMEM细胞培养液(美国Gibco公司，批号：8120010)；

青链霉素混合液(Biosharp，批号：70011000)；

磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司，批号：8120150)；

0.25％EDTA胰酶(美国Gibco公司，批号：1951208)；

二甲亚砜(DMSO，美国Amresco公司，批号：821D035)；

噻唑蓝染液(VWR，批号：1636C097)；

Nrf2试剂盒(CUSABIO，批号：B06011498)；

NF-кB试剂盒(CUSABIO，批号：B07011499)；

keap1试剂盒(CUSABIO，批号：A16019408)；

TLR4试剂盒(酶联，批号：12/2020)；

TNF-α试剂盒(酶联，批号：12/2020)；

IFN-β试剂盒(酶联，批号：12/2020)。

2、宿主细胞及病毒毒种：

人喉癌上皮细胞(Hep2细胞)购自上海生博生物医药科技有限公司；

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)由山东省医学科学院基础医学研究所提供。

3、实验动物：

4周龄BALB/c雌性小鼠40只，体质量12～14g，自北京维通利华实验动物技术有限公司购入，合格证号：SCXK(京)2016-0006；实验单位使用许可证编号：SYXK(鲁)2017 0022。

4、仪器：

酶标仪(Molecular Device，Spectra Max M5)；

生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司，HFsafe-1200TE)；

CO

TDD5M台式平衡离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)；

DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；

冷冻干燥机(德国Christ公司，ALPHA1-4LD plus)；

CKX-31倒置显微镜(Olympus公司)。

本申请实施例中用于体内外抗RSV的甘草有效部位，为从甘草粗提取物中获得的正丁醇部位；甘草粗提取物为甘草经水提取后得到的甘草水提取物；

进一步地，甘草有效部位为甘草水提取物依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后得到的正丁醇萃取液。

用于体内外抗RSV的甘草有效部位的制备方法，包括如下步骤：

(1)在甘草中加水、浸泡、加热回流提取、浓缩，得甘草水提取液；

(2)将所述甘草水提取液依次经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，保留正丁醇萃取液，制得甘草有效部位。

甘草有效部位的具体制备方法，包括如下步骤：

(1)取200g甘草药材，洗净，加入12倍甘草药材重量的水，浸泡30min，加热回流提取90min，共提取两次，将两次提取液合并后离心，过滤后浓缩，得甘草水提取液；

(2)在甘草水提取液中加入石油醚，石油醚的体积与甘草水提取液的体积比为1:1，用石油醚萃取2-3次，至石油醚层无色，分离，保留水相，为第一水相；

在第一水相中加入二氯甲烷，二氯甲烷的体积与第一水相的体积比为1:1，用二氯甲烷萃取2-3次，至二氯甲烷层无色，分离，保留水相，为第二水相；

在第二水相中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯的体积与第二水相的体积比为1:1，用乙酸乙酯萃取2-3次，至乙酸乙酯层无色，分离，保留水相，为第三水相；

在第三水相中加入正丁醇，正丁醇的体积与第三水相的体积比为1:1，用正丁醇萃取2-3次，至正丁醇层无色，分离，保留正丁醇层；

将正丁醇层浓缩、减压干燥至干粉状。

需要说明的是，步骤(2)中使用的正丁醇为水饱和正丁醇溶液。

实施例1甘草有效部位的体外抗RSV研究

1.1样品制备：

供试品溶液的制备：用含2％FBS的DMEM细胞培养液将干粉状物质配制成6mg/mL的溶液。

对照品溶液的制备：用含1％DMSO及2％FBS的DMEM细胞培养液分别将甘草酸、甘草次酸、甘草酸单铵盐、利巴韦林配置成1mM的甘草酸溶液、甘草次酸溶液、甘草酸单铵盐溶液、利巴韦林溶液。

1.2细胞的培养与复苏

从液氮罐中取出保存的细胞，于37℃下迅速融化。在生物安全柜中将细胞悬液转移至无菌离心管中，离心(1000r，3min)，弃去上清液，加入新的细胞培养液，吹打细胞，将混悬液转移至细胞培养皿中，于CO

1.3病毒的扩增

待细胞汇合至70％左右，弃去原培养液，PBS清洗去除细胞碎片。加入0.2mL病毒液RSV，轻摇培养皿使病毒与细胞充分接触。于CO

1.4病毒毒力的测定

1×10

病毒毒力测定结果：RSV以Hep2细胞为宿主细胞，RSV病毒半数感染浓度TCID

1.5药物的细胞毒性测定

1×10

1.6药物抗RSV活性测定

1×10

上述1.5药物的细胞毒性测定的结果、1.6药物抗RSV活性测定的结果以及各药品对RSV的治疗指数TI值见图1-图5。

其中，正丁醇部位(也可称为甘草有效部位)对于Hep2细胞的CC

实施例2加时实验考察对RSV复制周期的作用阶段的研究

为了研究正丁醇部位作用在RSV复制周期的具体阶段，进行了加时实验，实验前24小时将Hep2细胞以8×10

测试结果见图6和图7。参考图6，阳性对照药物利巴韦林在6～10h时对RSV具有较好的抑制作用，主要对于病毒的复制阶段具有较好的抑制作用，-2～6h时对RSV没有抑制作用；参考图7，正丁醇部位在-2～2h和8～12h时对RSV具有较好的抑制作用，且加入时间在-2-2h时可使病毒毒力降低96.47％，加入时间在8-12h时可使病毒毒力降低82.12％，12h之后加入药物对于病毒的抑制作用逐渐降低，主要对于病毒的吸附、复制阶段具有较好的抑制作用，对病毒的穿入阶段无抑制作用，相较于利巴韦林，正丁醇部位对RSV具有一定的药物预防作用。

实施例3正丁醇部位体内抗RSV作用及其作用机制

3.1 RSV感染小鼠模型的建立及给药处理

将4周龄的BALB/c雌性小鼠分为4组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、阳性药(利巴韦林36mg·Kg

3.2样品处理与指标检测

按照预定方案给药4天，在第五天给药1h后，眼球取血，脱颈，解剖小鼠，取肺组织并称重计算肺指数，4％甲醛固定，脱水、组织透明、浸蜡、包埋、切片、烘干后HE染色病理切片观察肺部病变。将眼球取出的血置于EP管中4℃过夜后，于4℃，3000r/min的转速下离心20min，取上清液，用ELISA法测定小鼠血清中keap1、Nrf2、NF-κB、TNF-α、IFN-β、TLR4的含量。

肺指数＝肺重(g)/小鼠体重(g)×100％

3.3正丁醇部位对RSV感染小鼠肺组织炎性浸润等病理形态的影响

采用HE染色法观察甘草正丁醇部位对RSV感染小鼠所致肺组织病理形态变化。结果见图8。

正常对照组小鼠(图8B)肺泡结构清晰，肺泡腔内未见渗出物，未见炎性细胞浸润；模型组小鼠(图8A)肺泡壁增厚，多数肺泡腔变小或几乎看不见，肺泡腔内及肺间质有明显出血，伴有炎性细胞浸润；正丁醇部位组(图8C)肺泡壁增生情况得到改善，肺泡形态趋于正常，肺泡腔出血情况减轻，炎性细胞浸润情况减轻；利巴韦林组(图8D)肺泡壁较模型组得到改善，肺泡腔及肺间质出血情况得到改善，炎性细胞浸润情况减轻。说明正丁醇部位可使肺组织病变情况得到明显改善。

3.4正丁醇部位对感染RSV小鼠的肺指数的影响

参考图9，与正常对照组相比，模型组肺指数显著上升(P<0.01)，提示RSV感染小鼠模型造模成功，给药后，正丁醇部位组、利巴韦林组小鼠肺指数显著下降(P<0.05)，且正丁醇部位与利巴韦林的作用效果相差不大。说明正丁醇部位可抑制RSV感染所引起的小鼠病毒性肺炎。(图9，注：与正常对照组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01)

3.5正丁醇部位对感染RSV小鼠炎症及免疫反应相关因子的影响

参考图10，与模型组相比，正丁醇部位组、利巴韦林组显示均可显著降低(P<0.05)NF-κB p105蛋白的表达水平，利巴韦林组较正丁醇部位组的效果更为显著；与模型组相比正丁醇部位组可显著降低(P<0.05)小鼠血清中TLR4水平，利巴韦林组效果较差；与模型组相比，正丁醇部位组、利巴韦林组可以显著(P<0.05)降低小鼠血清中TNF-α水平；与模型组相比，正丁醇部位组可显著升高(P<0.05)小鼠血清中IFN-β的水平。(图10，注：与正常对照组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01)

3.6正丁醇部位对感染RSV小鼠氧化应激通路的影响

参考图11，与模型组相比，正丁醇部位组、利巴韦林组均可显著升高(P<0.01)小鼠血清中Nrf2水平，且利巴韦林组效果较正丁醇部位组效果好；与模型组相比正丁醇部位组可显著降低小鼠血清中keap1的含量。(图11，注：与正常对照组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01)

根据上述实验数据可知，RSV病毒入侵机体后可造成组织的氧化应激损伤，以及一系列的炎症损伤。TLR4是链接固有免疫与炎症的桥梁，宿主的TLR4可识别RSV的F蛋白，在TLR4信号传导中进一步激活NF-κB通路，进而诱导炎症因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的表达，促发炎症反应。干扰素是机体所产生的具有广谱抗病毒作用的一种细胞因子，RSV的G蛋白可抑制IFN-β的表达进而促进RSV的免疫逃逸。Nrf2可作为呼吸道病毒疾病治疗的潜在靶点，Nrf2是机体对抗氧化应激损伤的重要靶点；在生理条件下，Nrf2与keap1偶联于细胞质中，应激状态下Nrf2从胞浆解离至细胞核内并促进抗氧化基因的表达。Nrf2和NF-κB存在功能性的相互作用，Nrf2的降低会加剧NF-κB的活性，Nrf2的激活可促进炎症的缓解；正丁醇部位体内抗RSV实验结果显示正丁醇部位可以提高感染RSV小鼠血清中IFN-β的表达水平，抑制RSV的免疫逃逸；通过抑制TLR4/NF-κB通路并降低TNF-α水平，抑制RSV所引起的肺部炎症反应；并且可以通过keap1/Nrf2通路降低小鼠的氧化应激水平从而改善RSV引起的小鼠肺组织损伤。

本申请通过抑杀病毒、炎症反应、免疫调节、氧化应激方面，对甘草的正丁醇部位的体内外抗RSV病毒作用进行了一定的研究，为后续甘草抗病毒深入的作用机制研究及活性物质基础的寻找奠定一定的基础。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。