丁苯酞衍生物及其在制备保护神经细胞的药物中的应用

摘要

本发明涉及生物医药、化学领域，提供了丁苯酞衍生物及其在制备保护神经细胞的药物中的应用，更具体地，本发明提供了丁苯酞的衍生物或由其组成的药物组合物在制备用于预防和/或治疗细胞损伤相关疾病、神经退行性疾病的药物中的用途；所述的神经细胞损伤疾病包括但不限于中风、脊柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病；所述神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病、或脊髓小脑共济失调。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药、化学领域，具体涉及丁苯酞衍生物及其在制备保护神经细胞的药物中的应用。

背景技术

丁苯酞是一种由芹菜，或者芹菜种子提取中的一种小分子蛋白。这种蛋白很小，很容易通过血脑屏障而对脑细胞产生作用。1978年中国医学科学院药物研究所从水芹籽中分离出左旋丁苯酞。1980年首次化学合成了丁苯酞，最初丁苯酞的研究方向是抗癫痫，但由于丁苯酞用于抗癫痫的治疗剂量与毒性剂量接近，存在较大的安全隐患，研究被因此搁浅。

丁苯酞主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中，可以降低细胞内钙离子的浓度，抑制谷氨酸释放，同时减少花生四烯酸生成、清除氧自由基、提高氧化酶活性等，作用于脑缺血的多个病理环节。同时具有较强的抗脑缺血作用，能够明显改善脑缺血区的微循环和血流量、增加缺血区毛细血管数量、减轻脑水肿、缩小脑梗死的体积、改善脑能量代谢、还有一定抑制血栓的作用。在发病早期越早使用，对患者预后越有改善作用。在生理学上24小时之内丁苯肽就能够见效，但是如果想在临床上看到患者症状有明显改善，至少要5-7天以上。

凡是所有的药都有正作用和副作用，丁苯酞它的副作用和它的正作用是一样的，它可以活化脑细胞，促进脑细胞的代谢。脑细胞活化之后如果活化不当，就有可能产生幻觉，有可能产生癫痫。另外所有的药物都要经过肝肾功能代谢，可能有一部分患者会出现转氨酶的升高。它既然增加脑的血流量，增加血管的增生，对有些特殊部位的脑梗塞，或者少数脑梗塞的情况下，会产生大脑脑梗塞部位的渗血。

发明内容

一方面，本发明提供了以下通示所示的丁苯酞衍生物及其药学上可接受的盐。

其中，R

在一种实施方式中，所述原子包括氢原子或卤素原子；优选地，所述卤素原子包括氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。

在一种实施方式中，所述取代基包括但不限于常见的以下取代基及含有杂原子的所述取代基：烃基、羧基、磺酸基、烃氧羰基、甲酰基、卤甲酰基、氧代、氨基甲酰基、氰基、酚烃基、酚羟基、醇羟基、氨基、烃氧基、烃基、硝基、亚硝基；所述取代基还可以包括C

在一种实施方式中，所述杂原子包括氮、氧、硫、磷、硼、氯、溴、碘。

在一种实施方式中，所述杂原子个数是1-6个；具体地，包括1个、2个、3个、4个、5个、6个；更优选地，1-3个。

在一种实施方式中，所述取代基可以含有碳原子或不含碳原子。

在一种实施方式中，所述取代基含有碳原子，其碳原子数没有特别限定；优选地，1～20个碳原子；更优选地，1～10个碳原子。

在一种实施方式中，所述含碳原子的取代基包括烃基、取代的烃基、苯基、丁基苯基、对甲基苯基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、苄基、取代的C

在一种实施方式中，所述取代的烃基是有1-3个杂原子取代的含有1个碳原子的基团。

在一种实施方式中，所述取代的烃基是三氟甲基，二氟甲基，一氟甲基、三溴甲基、二溴甲基、溴甲基、三氯甲基、二氯甲基、氯甲基、碘甲基、二碘甲基。

在一种实施方式中，所述取代的烃基是三氟甲基。

在一种实施方式中，所述不含碳原子的取代基包括羟基、巯基、氨基、硝基、酰基、硅基、酰基氧基、氧基酰基、二羟硼基、羟氨基、亚硝基、乙硅烷基。

在一种实施方式中，所述不含碳原子的取代基是亚硝基、硝基。

在一种实施方式中，所述不含碳原子的取代基是硝基。

在一种实施方式中，所述R

在一种实施方式中，所述R

在一种实施方式中，所述丁苯酞的衍生物包括：3-丁基-7-硝基异苯并呋喃、3-丁基-7-（三氟甲基）异苯并呋喃、3-丁基-5-（三氟甲基）异苯并呋喃酮。

在一种实施方式中，所述3-丁基-7-硝基异苯并呋喃的化学式如下所示：

在一种实施方式中，所述3-丁基-7-（三氟甲基）异苯并呋喃的化学式如下所示：

在一种实施方式中，所述3-丁基-5-（三氟甲基）异苯并呋喃酮的化学式如下所示：

本发明中，所述药学上可接受的盐包括无机酸和有机酸衍生的盐。

优选地，所述无机酸可以是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸。

优选地，所述有机酸可以是氨基酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸、樟脑酸、戊二酸、乙二酸、乳酸或丙二酸、双羟萘酸、羟基萘酸、龙胆酸、羟基乙酸、扁桃酸、4-乙酰胺基苯甲酸或烟酸；其中氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸、色氨酸或缬氨酸。

另一方面，本发明提供了以本发明丁苯酞衍生物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。

在一种实施方式中，所述药物组合物可以为片剂（包括糖衣片剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口腔崩解片，口腔片剂等等），丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂（包括软胶囊，微胶囊），锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂（例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊），气雾剂，膜剂（例如，口服崩解膜剂，口腔粘膜-粘附膜剂），注射剂（例如，皮下注射，静脉注射，肌内射，腹膜内注射），静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂（例如，直肠栓剂，阴道栓剂），小药丸，鼻制剂，肺制剂（吸入剂），眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂（例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处）。

在一种实施方式中，药物组合物中还包括药学上可接受的固体/液体赋形剂。

在一种实施方式中，所述药学上可接受的固体/液体赋形剂包括粘合剂、填料、润滑剂和崩解剂。

在一种实施方式中，所述粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、西黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素及其衍生物（例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠）、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素微晶纤维素及其混合物。

在一种实施方式中，所述填料包括但不限于滑石、碳酸钙（例如颗粒或粉末）、乳糖、微晶纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶凝淀粉及其混合物。

在一种实施方式中，所述润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、硫酸月桂酯钠、滑石、氢化植物油（例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油）、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。

在一种实施方式中，所述崩解剂包括但不限于琼脂-琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。

在一种实施方式中，本发明的药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。

在一种实施方式中，本发明的药物组合物可单独给药也可与其它神经相关疾病药物联合用药。优选地，所述神经相关疾病药物包括中药、西药或生物活性制剂。

在一种实施方式中，被治疗动物包括哺乳动物、爬行动物、甲壳动物、两栖类、鱼类、家禽类。主要范围为哺乳动物，特别是人。

另一方面，本发明提供了前述丁苯酞的衍生物或药物组合物在制备用于预防和/或治疗细胞损伤相关疾病、神经退行性疾病的药物中的用途。

在一种实施方式中，所述细胞包括脂肪细胞、炎症细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、干细胞、淋巴细胞。

在一种实施方式中，所述神经细胞包括神经元、神经胶质细胞、神经母细胞；更具体地，人神经母细胞瘤细胞；更具体地，SHY5Y细胞系。

在一种实施方式中，所述的神经细胞损伤疾病包括但不限于中风、脊柱损伤和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病。

在一种实施方式中，所述神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓肌萎缩病、原发性侧索硬化病、或脊髓小脑共济失调。

附图说明

图1为3-丁基-7-硝基异苯并呋喃的(HNMR)s质检结果图。

图2为3-丁基-7-（三氟甲基）异苯并呋喃的(HNMR)s质检结果图。

图3为3-丁基-5溴异苯并呋喃酮的(HNMR)s质检结果图。

图4为3-丁基-5-（三氟甲基）异苯并呋喃酮的(HNMR)s质检结果图。

图5为丁苯酞衍生物对Aβ

图6为丁苯酞衍生物对Aβ

图7为丁苯酞衍生物对缺糖缺氧培养的SY5Y细胞进行LDH释放试验的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

①3-丁基-7-硝基异苯并呋喃

化学式如下所示：

合成路线如下所示：

质检结果图如图1所示。

②3-丁基-7-（三氟甲基）异苯并呋喃

化学式如下所示：

合成路线如下所示：

质检结果图如图2所示。

③3-丁基-5溴异苯并呋喃酮

化学式如下所示：

合成路线如下所示：

质检结果图如图3所示。

④3-丁基-5-（三氟甲基）异苯并呋喃酮

化学式如下所示：

合成路线如下所示：

质检结果图如图4所示。

以上化合物的合成皆质检合格，可以应用于下一步的实验。

实验步骤：

1.SHY5Y细胞以1*10

2.当细胞汇合度达80%~90%时，弃去培养基，PBS洗3遍，分别加入药物（0.5mM，正常培养基DMEM稀释），37℃培养4h。

3.弃去药物，PBS洗2遍，分别加入20μM的Aβ

4.每孔加入10μLPBS配制的MTT溶液（5mg/mL），于37℃孵育4h。用1mL注射器小心将培养基吸出，每孔加入150μLDMSO，充分震荡使甲瓒结晶完全溶解后，酶标仪570nm处测吸光值。同时设置PBS组和无血清培养基培养的空白细胞组分别作为阳性和阴性对照。

5.各组活性细胞百分比=（各组值-PBS组平均值）/（空白组平均值-PBS平均值）*100%

实验结果：

经MTT检测，结果如图5所示：新型化合物丁苯酞衍生物①3-丁基-7-硝基异苯并呋喃；②3-丁基-7-（三氟甲基）异苯并呋喃活性值相对较高，优于丁苯酞（BNP）及左右旋（BNP-L，BNP-R）化合物，且优于③3-丁基-5溴异苯并呋喃酮，差别均具有统计学意义。①、②两个化合物与④3-丁基-5-（三氟甲基）异苯并呋喃酮活性值没有明显差别，④高于模型组和BNP组，但与BNP-L，BNP-R没有差别。说明化合物①、②、④抗神经细胞凋亡活性较好，但化合物①、②相对更好；

本发明全部图片上：Aβ是经过Aβ25-35处理的细胞，BNP-R指右旋的BNP，BNP-L指左旋的BNP，BNP是消旋体BNP，7F-BNP指的是丁苯酞衍生物②，7NO

根据MTT实验结果，进一步检测神经细胞损伤活性氧释放实验，该实验同时检测了所有化合物，但丁苯酞及左右旋和③组细胞因死亡较多，未参与分析。

实验步骤：

1.SHY5Y细胞以1*10

2.当细胞汇合度达80%~90%时，弃去培养基，PBS洗3遍，分别加入药物（0.5mM，正常培养基DMEM稀释）37℃培养4h。

3.弃去药物，PBS洗2遍，分别加入20μM的Aβ

4.孵育结束后，按照ROS试剂盒进行ROS检测。

5.PBS洗2次，加探针37℃孵育20min（按说明书1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩/升），每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针与细胞充分接触。

6.PBS洗涤细胞3次，荧光酶标仪检测（488nm激发波长，525nm发射波长）检测吸光值。

7.ROS活性值=（各组平均值-PBS组平均值）/（空白组平均值-PBS组平均值）实验结果：

结果如图6所示：①ROS活性值最低，较其它组均具有统计学差别。化合物②和④ROS活性值低于模型组，均具有统计学差别。②和④无统计学差别。由此进一步验证化合物①、②、④抗神经细胞损伤活性，①最好。综合MTT实验，①和②较好些。

实验步骤：

1.SHY5Y细胞以1*10

2.当细胞汇合度达80%~90%时，弃去培养基，PBS洗3遍，分别加入不同化合物的药物（正常DMEM稀释），37℃培养4h。

3.弃去药物，PBS洗2遍，分别加入不同浓度的药物（低糖DMEM稀释），并在板子四周封上胶带，37℃培养12h。空白组用正常培养基，不封闭；模型组用低糖培养基封闭，分别做阴性和阳性对照。

4.孵育结束后，PBS洗3遍，每孔加入10μL胰酶消化后，加入200μLPBS重悬离心后，按照LDH试剂盒进行检测。

5.按5x10

6.按说明书加入样品，混匀，25℃水浴15min，加样品，混匀，255℃水浴15min；加样品，充分混匀静置3min，取200微升置96孔板，450nm下测定吸光度。

7.根据标准品浓度和吸光度值做标准曲线，得出公式。按公式计算LDH活力值。

实验结果：

结果如图7所示：新型药物对神经细胞缺糖缺氧损伤保护活性LDH释放实验，发现丁苯酞及左右旋细胞死亡较多，未参与比较分析。

化合物①、②LDH活性值相对模型组小，且均具有统计学差别。化合物④低于模型组，但未见明显差别，化合物③高于模型组，并有统计学差别，效果最差。

说明丁苯酞衍生物①和②对神经细胞缺糖缺氧12小时损伤有很好的保护活性。