一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用

摘要

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用，涉及mRNA检测技术领域。本发明所述试剂盒建立在RT‑PCR基础上，以mRNA作为标准品构建标准曲线，稀释的系列标准品溶液通过与待测样本同样的反转录、qPCR过程，更好的模拟样本检测过程，直观展示mRNA药物含量，减少质粒的构建工作，实现了生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测，具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽，特异性强等优点，可用于mRNA类药物临床前药物生物分布研究、临床研究生物样品检测和临床治疗患者的药物分布监测。

说明书

技术领域

本发明属于mRNA检测技术领域，具体涉及一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

mRNA药物是近年来极具前景的分子治疗药物，在传染病预防、代谢性疾病、癌症和包括罕见病在内的多种疾病治疗领域均有巨大的应用潜力。mRNA药物的原理是基于mRNA指导蛋白合成的特性，经过必要化学修饰的mRNA，经由不同的递送系统进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。由于mRNA药物具有不进入细胞核、不改变基因组、有瞬时活性、能通过生理代谢降解等优点，且生产成本低、开发的周期短、安全性高使得mRNA药物具有很大优势。但是至目前为止，尚未有mRNA药物得以经过美国FDA批准上市，多数mRNA药物仍处于临床研究阶段，mRNA药物的研发过程中，仍然需要建立系统的、完善的、稳定的检测分析和验证等技术方案，所使用的技术要求能特异性识别及检测不同来源的生物样本中mRNA药物的序列，截止目前尚未有商业化的试剂盒得以实现。传统的mRNA定量检测方法Northernblot、原位杂交等技术，由于操作复杂、具有放射性污染的可能、耗时长、灵敏度较低等缺点，并不适用于mRNA药物的定量检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用，可实现生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括：线性mRNA标准品，样本RNA提取试剂，线性mRNA标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂。

优选的，所述反转录试剂的体系以10μL计，包括1μL 10×RT Mix，1μL SuperpuredNTPs，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase，1μL待测样本总RNA/线性mRNA标准品和余量的Nuclease-Free Water；

所述实时荧光定量PCR试剂的体系以10μL计，包括：5μL 2×SYBR Green Mix，2μLRTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物和余量的Nuclease-FreeWater。

本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mRNA含量的工具中的应用。

优选的，利用所述工具检测机体中mRNA含量的方法包括实时荧光定量PCR。

本发明还提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA；

分别以所述系列mRNA标准品cDNA和机体样本提取的RNA为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，利用所述系列mRNA标准品cDNA的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量；

所述标准曲线以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。

优选的，步骤(1)所述梯度浓度包括在0.01pg/μL～10000pg/μL的范围内设置梯度。

优选的，步骤(1)所述线性mRNA标准品的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；

所述线性mRNA标准品的特异性引物包括mRNA-F1和mRNA-R1，所述mRNA-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述mRNA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，步骤(3)所述实时荧光定量PCR的程序包括：预变性：95℃10min；

变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；

溶解曲线：95℃，15sec；70℃，30sec；95℃，保持。

优选的，步骤(4)所述机体样本包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。

本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：

(a)mRNA类药物临床前药物生物分布研究的工具；

(b)临床研究生物样品检测的工具；

(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。

有益效果：本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒建立在RT-PCR基础上，以mRNA作为标准品构建标准曲线，与常规质粒为标准品方法相比，稀释的系列标准品溶液通过与待测样本同样的反转录、qPCR过程，更好的模拟样本检测过程，直观展示mRNA药物含量，减少质粒的构建工作，实现了生物样本中mRNA药物的快速、准确的定量检测。

本发明还提供了定量检测机体中mRNA含量的方法，2小时内快速检测生物样本mRNA药物含量，具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽，特异性强等优点，可用于mRNA类药物临床前药物生物分布研究、临床研究生物样品检测和临床上治疗患者上的药物分布监测。

附图说明

图1为定量PCR检测猴体内mRNA药物浓度-Cp值拟合标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括：线性mRNA标准品，样本RNA提取试剂，线性mRNA标准品的特异性引物，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂。

本发明所述线性mRNA标准品的序列优选与mRNA药物或mRNA疫苗中的mRNA序列相同。本发明对所述线性mRNA标准品的合成方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法合成所述线性mRNA即可；并基于所述线性mRNA的序列设计特异性引物，用以RT-PCR。在本发明实施例中，优选以SEQ ID NO.1所示的线性mRNA标准品为例，检测猴体内mRNA的含量。

本发明所述样本RNA提取试剂优选包括TRIzol Universal RNA Reagent。本发明所述反转录试剂的体系以10μL计，优选包括1μL 10×RT Mix，1μL Superpure dNTPs(2.5mMeach)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase，1μL待测样本总RNA/线性mRNA标准品和余量的Nuclease-Free Water；所述实时荧光定量PCR试剂的体系以10μL计，优选包括：5μL 2×SYBR Green Mix，2μL RTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物和余量的Nuclease-Free Water。

在本发明中，线性mRNA标准品的特异性引物在配制实时荧光定量PCR试剂的体系时，其上游引物和下游引物分别使用Nuclease-Free Water溶解至浓度为5nM储备液，再按10倍稀释后使用。

本发明还提供了上述试剂盒在制备定量检测机体中mRNA含量的工具中的应用。本发明利用所述工具检测机体中mRNA含量的方法优选包括实时荧光定量PCR，且所述实时荧光定量PCR的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液；以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA；

分别以所述系列mRNA标准品cDNA和机体样本提取的RNA为模板为模板，利用上所述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，利用所述系列mRNA标准品cDNA的数据建立标准曲线，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量；

所述标准曲线以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标。

本发明利用Nuclease-Free Water稀释线性mRNA标准品，呈梯度浓度，得系列线性工作液。本发明所述梯度浓度优选包括在0.01pg/μL～10000pg/μL的浓度范围内设置梯度，如在本发明实施例中，其设置梯度分别为0.01pg/μL、0.1pg/μL、1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1000pg/μL和10000pg/μL。本发明以核苷酸序列为SEQ ID NO.1的线性mRNA为标准品为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的保护范围。本发明还针对所述线性mRNA标准品设计特异性引物，包括mRNA-F1和mRNA-R1，所述mRNA-F1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示(GCAACAGTGTGCGGACCTAA)，所述mRNA-R1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示(CGTCCGTCGTGTCAGCTATG)。

得系列线性工作液后，本发明以所述系列线性工作液为模板，利用上述试剂盒中的反转录试剂进行反转录，得系列mRNA标准品cDNA。本发明利用上述反转录体系进行反转录时，所述反转录体系优选为10μL，包括：1μL10×RT Mix，1μL Superpure dNTPs(2.5mMeach)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase；检测未知样本时加入1μL待测样本总RNA，用Nuclease-Free Water补足至10μL，标曲构建时则加入1μL mRNA标准品，1μL空白食蟹猴全血RNA基质，用Nuclease-Free Water补足至10μL。本发明所述反转录优选为在37℃反应60min。本发明优选以Oligo-dT为反转录引物对稀释好的系列线性工作液、待测样品总RNA反转录，得到的cDNA使用Light Cycler480型实时荧光定量PCR仪进行qPCR检测。

得系列mRNA标准品cDNA后，本发明以所述系列mRNA标准品cDNA为模板，利用上述试剂盒中的实时荧光定量PCR试剂进行实时荧光定量PCR，以Cp值为纵坐标，以所述系列线性工作液的浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。本发明所述实时荧光定量PCR的反应体系优选为10μL体系，包括5μL2×SYBR Green Mix，2μL RTase Mix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物，用Nuclease-Free Water补足至10μL。本发明所述实时荧光定量PCR的程序优选包括：预变性：95℃10min；

变性及退火延伸：95℃15sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；

溶解曲线：95℃15sec，70℃30sec，95℃保持。

在本发明中，优选用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液，以Cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(R

得标准曲线后，本发明以机体样本提取的RNA为模板，依次进行步骤(2)所述反转录和步骤(3)所述实时荧光定量PCR，利用所述标准曲线定量检测机体中mRNA含量。

本发明所述反转录的体系和程序以及实时荧光定量PCR的体系和程序优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述机体样本优选包括脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉或全血。

本发明还提供了上述试剂盒在制备以下(a)、(b)和(c)至少一种工具中的应用：

(a)mRNA类药物临床前药物生物分布研究的工具；

(b)临床研究生物样品检测的工具；

(c)临床治疗患者的药物分布监测的工具。

本发明所述试剂盒在所述应用中的方法优选与上述相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)本发明所需要试剂包括mRNA标准品(SEQ ID NO.1)、qPCR上下游引物(SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.3)、TRIzol Universal RNA Reagent、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒、氯仿、异丙醇、Nuclease-Free Water。

2)本发明的检测仪器为Light Cycler 480型实时荧光定量PCR仪，型号为LightCycler 480；基因扩增仪，型号为Life-Eco。

3)主要试剂配制：引物(5nM)使用Nuclease-Free Water溶解引物粉末至浓度为5nM储备液，再按10倍稀释后使用。

4)线性工作液及质控工作液配制：分别用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液；用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制QCH、QCM、QCL、LLOQ浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μL的质控工作液。

5)建立反转录体系：反应体系为10μL，包括1μL 10×RT Mix，1μL SuperpuredNTPs(2.5mM each)，1μL Oligo-(dT)15，0.5μL Quant Reverse Transcriptase；检测未知样本时加入1μL待测样本总RNA，用Nuclease-Free Water补足至10μL，标曲构建时则加入1μL mRNA标准品，1μL空白食蟹猴全血RNA基质，用Nuclease-Free Water补足至10μL。

6)建立qPCR反应体系：反应体系为10μL，包括5μL2×SYBR Green Mix，2μL RTaseMix，0.2μL上游引物，0.2μL下游引物，1μL反转录产物，用Nuclease-Free Water补足至10μL。

7)方法学验证：标准曲线：用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制系列浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000pg/μL的线性工作液，以Cp值为纵坐标，浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，要求相关系数(R

精密度与准确度：用移液器移取适量mRNA标准品用Nuclease-Free Water配制QCH、QCM、QCL、LLOQ浓度为7500、75、0.3、0.1pg/μL的质控工作液，在6个分析批中运行质控样本，每批4个浓度水平(QCH，QCM，QCL和LLOQ)，每浓度水平各5个质控样本。6个分析批由至少2人于多日内完成。要求低、中、高浓度质控样本批内及批间的变异系数(CV％)小于10％，定量下限样本CV％小于15％，计算各样本准确度(实测值的平均值/理论值×100％)，准确度在50～200％合格。

耐用性：提取空白食蟹猴肝脏总RNA，稀释为50ng/μL作为空白肝脏RNA基质。另使用Nuclease-Free Water作为0μg/μL基质。分别将阳性对照样本(QCH、QCL)、阴性对照样本(Nuclease-Free Water)与不同基质混合进行反转录，然后进行荧光定量PCR检测，样本准确度在50～200％内，阴性对照Cp值大于LLOQ或无Cp值，视为基质浓度对检测方法无影响。

特异性：①：空白食蟹猴全血RNA与75pg/μL的标准品；②：空白食蟹猴全血RNA中加入与标准品等体积Nuclease-FreeWater。对①②进行反转录，然后进行qPCR检测。考察该方法对质粒标准品的特异性。要求反应①的Cp值小于定量检测下限(LLOQ)的Cp值，反应②的Cp值大于标准曲线的LLOQ的Cp值或无Cp值。

稳定性：提取空白食蟹猴全血、肝脏RNA并稀释为50ng/μL，将空白食蟹猴全血、肝脏RNA与低、高浓度mRNA标准品(QCH、QCL)混合进行反转录，得到的cDNA作为稳定性样本1、2、3、4，每个样本3个平行，保存于-60℃以下，并按每次使用量进行分装，样本回收率在50～200％视为稳定。

由表1及图1可知，标准曲线PCR整体扩增效率在99.81～106.28％之间，各检测批次的标准曲线相关系数(R

表1标准曲线验证结果

注：NA表示无结果

精密度与准确度结果见表2，在6个分析批中运行质控样本QCH、QCM、QCL、LLOQ，对于批内变异系数(CV％)，6个批次样本CV％均不大于3.72％，各质控样品批内精密度符合接受标准。对于批间变异系数(CV％)，4个浓度CV％均不大于9.49％，各质控样品批间精密度符合接收标准。

对于准确度，6个批次样本准确度在69.59％～183.79％之间，各质控样品符合接受标准。

表2精密度与准确度验证结果

耐用性结果见表3，以Nuclease-Free Water(0μg/μL)作为基质的耐用性样本QCH-1、QCL-1、NTC-1，阴性对照NTC-1无Cp值，提示Nuclease-Free Water对检测方法无影响，QCH-1、QCL-1准确度在89.83％～123.06％之间，符合接受标准。以空白食蟹猴肝脏RNA作为基质耐用性样本QCH-2、QCL-2、NTC-2，阴性对照NTC-2无Cp值，提示空白食蟹猴肝脏RNA对检测方法无影响，QCH-2、QCL-2准确度在112.43％～130.60％之间，符合接受标准。

表3耐用性验证结果

注：NA表示无结果。

特异性结果见表4，样本1、2分别为空白食蟹猴全血RNA与75pg/μL的标准品混合、空白食蟹猴全血RNA与Nuclease-Free Water混合，结果显示样本1反应Cp值小于特异性标准曲线定量检测下限STD1 Cp值，样本2反应Cp值高于STD1 Cp值，提示本试验方法对质粒标准品具有特异性。

表4特异性验证结果

稳定性样本验证结果见表5，稳定性样本1、2、3、4分别为空白食蟹猴全血、肝脏的RNA与低、高浓度标准品(QCH、QCL)混合进行反转录得到的cDNA，样本于配制后立即进行qPCR检测，回收率在99.09％～157.03％之间，符合接受标准；于2～8℃下放置4小时后进行qPCR检测，回收率在85.17％～162.63之间，符合接受标准；于-60℃下放置一周后进行qPCR检测，回收率在56.99％～129.62％之间，符合接受标准。提示样本于2～8℃下放置4小时；-60℃及以下放置一周稳定性良好。

表5稳定性验证结果

方法学验证结果显示，方法标准曲线、精密度和准确度、耐用性、特异性、稳定性均符合接受标准。经验证后，由本方法能成功检测组织中如脾脏、肾脏、脑、睾丸、小肠、骨髓、腹股沟淋巴结、注射局部肌肉及全血中mRNA疫苗浓度，在腹股沟淋巴结中检测到mRNA疫苗浓度最高为1.49pg/μL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东莱恩医药研究院有限公司

<120> 一种定量检测机体中mRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒及检测方法和应用

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<210> 1

<211> 1521

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

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aagcacaagg accacgacga cggggaccac ucgucgguca cgcacuugga cuggugggcc 60

ugggucgacg gggggcggau gugguugucg aagugggccc cgcacaugau ggggcuguuc 120

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