共同给药抑制剂以生成产生胰岛素的肠道细胞

摘要

描述了通过共同给药Foxo1抑制剂与Notch抑制剂或ROCK抑制剂或两者的组合从而在受试者中产生制造并分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法。还描述了包含Foxo1抑制剂与Notch抑制剂或ROCK抑制剂或两者的组合的药物组合物。所述方法和组合物可用于治疗与受损的胰腺功能相关的疾患，诸如糖尿病。

说明书

政府利益声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助DK057539和DK58282下的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

1.技术领域

用于治疗和预防糖尿病的方法。

2.相关技术的描述

糖尿病是以慢性高血糖和发展长期并发症为特征的一系列疾患。此系列疾患包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他类型的糖尿病。免疫介导的(1型)糖尿病(或胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)是一种儿童和成人疾病，目前没有足够的用于治愈或预防的手段。1型糖尿病约占所有人类糖尿病的10％。

1型糖尿病与非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的不同之处在于，只有1型糖尿病涉及朗格汉斯胰岛的产生胰岛素的β细胞的特异性破坏；胰岛中的α细胞(产生胰高血糖素)或δ细胞(产生生长抑素)没有受到影响。胰腺β细胞的逐渐丧失导致胰岛素产生不足，从而导致葡萄糖代谢受损并伴有并发症。1型糖尿病主要发生在遗传易感的人群中。虽然在1型糖尿病的病因中有主要的遗传因素，但环境或非种系遗传因素似乎也起着重要作用。在美国，每300人中就有1人患有1型糖尿病。1型糖尿病的发病率正以每年约3％至5％的速度上升。

自1922年以来，胰岛素一直是治疗I型糖尿病和其他与胰岛素缺乏或产生减少有关的病症的唯一可用疗法，但是，它并不能预防该疾病的长期并发症，包括对血管、神经、眼睛和肾脏的损伤，其可能会影响视力、肾功能、心脏功能和血压，并可能导致循环系统并发症。这是因为胰岛素治疗不能完全替代缺失的胰腺功能。尽管进行了数十年的研究，并且1974年出现了胰岛细胞移植，以及关于胰岛细胞移植的埃德蒙顿方案(EdmontonProtocol)的最新成功声明，但替代产生胰岛素的细胞的成功一直是有限的。与胰岛或胰腺移植相关的困难包括获得足够数量的组织以及移植的胰岛在受体中存活和成功发挥功能的相对低的比率尚未得到克服。在移植后四年，接受胰岛细胞移植的患者中只有不到10％保持胰岛素独立。此外，患者在移植后需要终生免疫抑制，用免疫抑制剂有效替代胰岛素。并且尽管采用了新的免疫抑制方案，但每位患者仍有18％的严重副作用发生率。

因此，需要用于治疗、预防和/或降低发生糖尿病或与胰腺功能受损相关的其他疾患的风险的额外治疗方案。

在描述本发明的实施方式之前，应理解本发明不限于所描述的特定工艺、组合物或方法，因为它们可以变化。还应理解的是，说明书中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。本文提及的所有出版物均通过援引以其整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为由于现有发明而承认本发明无权早于这样的公开。

附图说明

本发明以实例而非限制的方式在附图的图中示出，并且其中：

图1提供了显示初始给药Notch抑制剂(DBZ)随后给药Foxo1抑制剂(FBT9)(DBZ治疗后24小时)对体重和血浆葡萄糖的影响的图。

图2提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对Glp1阳性细胞数量的影响：在仅DBZ治疗的动物中增加，在十二指肠和空肠中用DBZ和FBT9的组合治疗的动物中没有增加。

图3提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对生长抑素阳性细胞数量的影响：在仅DBZ治疗的动物中增加，在用DBZ和FBT9的组合治疗的动物中没有增加。

图4提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对血清素(5HT)阳性细胞数量的影响：在仅DBZ治疗的动物中增加，在用DBZ和FBT9的组合治疗的动物中没有增加。

图5提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对CCK阳性细胞数量的影响：任一组均无增加。

图6提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对Edu阳性(即复制)细胞数量的影响：在两组中均增加。

图7提供了显微照片，其示出了初始DBZ治疗和随后的FBT9连续治疗对胰岛素阳性细胞数量的影响。顶部图像下方的图像是顶部图像中黄色框的放大图像。

图8提供了显示FBT9和DBZ的共同治疗(DBZ与第一剂FBT9联合给药，随后连续给药FBT9三天，每天三次(TID))对Foxo1杂合敲除中的体重和血浆葡萄糖的影响的图。

图9示出了独立治疗的影响：单独的DBZ或单独的FBT9 x 3天TID都没有在此方案下产生ins+细胞。

图10提供了显微照片，其示出了上文对于图8所述的共同治疗方案对胰岛素阳性细胞的影响。胰岛素阳性细胞的数量是对于图1-7所述的治疗方案的～5倍高。顶部图像下方的图像是顶部图像中黄色框的放大图像。

图11提供了显微照片，其示出了上文对于图8所述的共同治疗方案对5HT细胞的影响。

图12提供了显微照片，其示出了上文对于图8所述的共同治疗方案对5HT细胞的影响。

图13提供了显微照片，其示出了上文对于图8所述的共同治疗方案对Glp1细胞的影响：在组合治疗中略有增加。

图14提供了显微照片，其示出了上文对于图8所述的共同治疗方案对Glp1细胞的影响：在组合治疗中略有增加。

图15提供了显微照片，其示出了在纯合Foxo1敲除小鼠中给药ROCK抑制剂(“ROCKi”；Y27632)对肠道中产生Ins+细胞的影响。黄色细胞对C-肽呈阳性并且代表真正的β样细胞。

图16提供了用Epcam复染的用ROCKi治疗的Foxo1敲除小鼠的显微照片，其显示胰岛素阳性细胞是上皮细胞。

图17提供了显微照片，其示出了未用ROCKi治疗的Foxo1敲除小鼠中胰岛素阳性细胞的数量显著低于用ROCKi治疗的那些。

图18提供了显示FBT10对肠道类器官的影响的实验图和一系列显微照片。

图19提供了显示FBT10和notch信号抑制剂(DBZ)的组合对肠道类器官的影响的实验图和一系列显微照片。还提供了显示对体重和葡萄糖的影响的图。

图20提供了显示FBT10对肠道类器官的影响的实验图和一系列显微照片。还提供了显示对体重和葡萄糖的影响的图。

发明内容

根据一种实施方式，公开了用于治疗或预防受试者中与胰腺功能受损相关的疾病或疾患的方法，其包括向受试者共同给药治疗有效量的Foxo1抑制剂和治疗有效量的Notch抑制剂或Rock抑制剂或两者。所述疾病或疾患选自由以下组成的组：1型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良、高血糖症；胰岛素敏感性降低、空腹血糖升高、餐后血糖升高和肥胖。所述治疗有效量是产生选自由以下组成的组的效果的量：葡萄糖耐量增加、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增加、空腹血糖降低、餐后血糖降低、体重增加的减少、脂肪量减少、体重减轻的增加和肠道Ins+细胞的生成。在优选的实施方式中，将试剂给药至胃肠道。

其他实施方式涉及治疗或预防受试者中与胰腺功能受损相关的疾病或病症，其包含有效量的Foxo1抑制剂和Notch抑制剂或ROCK抑制剂或两者。在一些实施方式中，有效量是产生选自由以下组成的组的效果的量：葡萄糖耐量增加、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增加、空腹血糖降低、餐后血糖降低、体重增加的减少、脂肪量减少、体重减轻的增加和肠道Ins+细胞的生成。

在受试者中产生制造和分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法，包括向受试者共同给药有效量的Foxo1抑制剂和有效量的Notch抑制剂或Rock抑制剂或两者。在实施方式中，产生胰岛素的肠内分泌细胞响应于试剂的给药进一步产生葡糖激酶和/或glut2。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都旨在具有与本发明所属领域以及在其提交时通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等效的各种方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。然而，技术人员应当理解，所使用和描述的方法和材料是示例性的，并且可能不是适用于本发明的唯一方法和材料。此外，还应理解，除非另有明确说明，否则由于测量受内在可变性的影响，任何温度、重量、体积、时间间隔、pH、盐度、体积摩尔浓度或质量摩尔浓度、范围、浓度和本文给出的任何其他测量、数量或数值表达都旨在为近似值而非精确或关键数字。因此，在适用于本发明且如本领域技术人员所理解的情况下，使用近似或相对术语以及专利申请中常用的程度术语来描述本发明的各个方面是合适的，诸如这样的尺寸、约、大约、大体上、基本上、基本上由……组成、包含和有效量。

向受试者“给药”或“……的给药”药物或治疗性药物组合物的本领域已知的任何方法包括直接给药，包括自我给药(包括口服给药或静脉内、皮下、肌内或腹膜内注射、通过栓剂直肠给药)、直接局部给药至靶组织之中或之上(诸如具有肠道Ins-的肠道区域，诸如下文定义的肠道N3 Prog)或通过将治疗有效量的药物或组合物递送至其靶向的细胞或组织的任何途径或方法给药。如本文所用，术语“共同给药”或“共给药”是指在给药另一活性剂之前、同时或之后给药活性剂，使得任一活性剂的生物学效应重叠。如本文所教导的试剂的组合可协同作用以治疗或预防本文所述的各种疾病、疾患或病症。使用这种方法，人们可以能够以较低剂量的每种试剂达到治疗效果，从而减少不良副作用的可能性。

试剂的“有效量”是产生所需效果的量。

“肠内分泌细胞”是指胃肠道的特化内分泌细胞，其中大部分是不再产生神经原素3的N3 Prog细胞的子代。肠内分泌细胞通常是胰岛素阴性细胞(肠道Ins

术语“列举的试剂”是指Foxo抑制剂、Notch抑制剂和/或ROCK抑制剂。

“列举的疾病或疾患”是指以胰腺功能受损为特征的疾病或疾患，包括不适当的低胰岛素水平、1型和2型糖尿病、代谢综合征、肥胖、葡萄糖耐受不良、高血糖症；胰岛素敏感性降低，空腹血糖升高，餐后血糖升高。不适当的低胰岛素水平是指胰岛素水平低到足以导致疾病或疾患的至少一种症状。胰腺功能受损是指其中病理与受试者的胰腺产生和/或分泌胰岛素的能力降低和/或分泌胰肽(诸如胰高血糖素、胰多肽、生长抑素)的能力改变(增加或减少)相关。与胰腺功能受损相关的疾患包括有时被称为成年潜伏性自身免疫性糖尿病、糖尿病前期、空腹血糖受损、糖耐量受损、空腹高血糖、胰岛素抵抗综合征和高血糖病症的病理。

“Foxo1基因”是指任何编码Foxo1蛋白的基因，包括直系同源物和其生物活性片段。

术语“FOXO1抑制剂”是指通过直接靶向FOXO1蛋白和/或靶向其结合配偶体、其靶基因或控制FOXO表达的信号网络来完全或部分抑制FOXO1蛋白的活性的化合物。FOXO1抑制剂或FOXO1拮抗剂可以包括FOXO1活性的直接抑制剂以及FOXO家族结合配偶体的调节剂(包括雄激素受体、雌激素受体和smad3)、FOXO家族靶基因的调节剂(包括p15、p21和p27)和控制FOXO家族表达的信号网络的调节剂(包括Skp2)。

“Foxo1敲除小鼠”是指经过基因修饰以去除或破坏Foxo1表达的小鼠。Foxo1敲除小鼠可以是纯合的，其中没有Foxo1表达，或者是杂合的，其中Foxo1表达减少。在N3 Prog细胞特异性Foxo1敲除小鼠(以下称“NKO小鼠”)的肠道中，并非所有肠内分泌细胞都会制造和分泌胰岛素；有些是不产生胰岛素的(以下称“Ins-”)。

“Foxo1 mRNA”是指编码Foxo1蛋白的任何mRNA，包括直系同源物和其生物活性片段。

“肠道Ins+细胞”和“胰岛素阳性肠道细胞”是指制造和分泌胰岛素的任何肠道细胞。肠道Ins+细胞是源自Ins-肠道细胞或由Ins-肠道细胞转换而来的。肠道Ins+细胞具有胰岛素阳性表型(Ins+)，因此它们表达成熟β细胞的标志物，并分泌胰岛素和C-肽以响应葡萄糖和磺酰脲类。肠道Ins+细胞主要来自N3 Prog，且也来自肠道干细胞。在NKO(Foxo1敲除)小鼠中意外发现了这些细胞。与胰腺β细胞不同，肠道Ins+细胞在被β细胞毒素链脲佐菌素消融后再生，从而逆转小鼠的高血糖症。

“N3肠内分泌祖细胞”和“N3 Prog”是指表达产生Ins-肠内分泌细胞的神经原素3的胰岛素阴性肠道祖细胞的亚群。已经发现肠道中的N3 Prog，以下称“肠道N3 Prog”，具有分化为制造和分泌胰岛素的细胞(“肠道Ins

“不产生胰岛素的肠道细胞”或“Ins-肠道细胞”泛指肠道中能够分化成产生胰岛素的肠道细胞(肠道Ins+细胞)的任何细胞，包括干细胞、肠道祖细胞、不产生胰岛素的肠内分泌细胞和N3 Prog。

“Notch抑制剂”是指Notch信号传导途径的抑制剂。

“ROCK抑制剂”或“ROCKi”是指降低Rho激酶(ROCK；ROCK1或ROCK2，例如Genbank登录号NM-005406或例如GenBank登录号NM_004850)的生物活性；或减少编码ROCK多肽的mRNA的表达；或减少ROCK多肽的表达的化合物。

“与胰腺功能受损相关的病理”或胰腺功能障碍是指其中病理学与受试者的胰腺产生和/或分泌一种或多种胰腺激素包括胰岛素和/或胰肽诸如胰高血糖素、胰多肽或生长抑素的能力降低有关。与胰腺功能受损相关的病理包括1型糖尿病和2型糖尿病。其他病理包括有时被称为成年潜伏性自身免疫性糖尿病、糖尿病前期、空腹血糖受损、糖耐量受损、空腹高血糖、胰岛素抵抗综合征和高血糖病症的病理。其他病理包括妊娠糖尿病、青年成熟期发病型糖尿病(MODY)和继发于胰腺切除术的胰岛素依赖。

“药学上可接受的”是指载体(carrier)、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害。

“预防疾病”包括但不限于防止疾病在可能易患该疾病(或疾患)但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；抑制疾病，例如阻止疾病的发展；缓解疾病，例如通过使其消退；缓解由疾病引起的病症，例如通过减轻其症状和/或延迟疾病发作。实例是降低高血糖受试者的血糖水平，和/或维持对受试者血糖水平的可接受的控制。此类治疗、预防、症状和/或病症可由本领域技术人员确定并在标准教科书中描述。

药物的“预防有效量”是当给药于受试者时将具有预期的预防效果，例如预防或延迟疾病或症状的发作(或复发)或降低疾病或症状的发作(或复发)的可能性的药物量。完全预防效果不一定通过给药一次剂量而发生，并且可能仅在给药一系列剂量后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次给药中给药。对于糖尿病，治疗有效量也可以是增加胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性、增加糖耐量或者减少体重增加、体重减轻或脂肪量的量。

症状的“减少”是指症状的严重性或频率的降低，或症状的消除。

“干细胞”是指未分化的、可以自我更新用于无限分裂并分化成多种细胞类型的细胞。肠道中的“祖细胞”是指源自多潜能干细胞的细胞，但自我更新能力有限。

在降低Foxo1蛋白的表达或生物活性的情况下，显著降低是指将Foxo1蛋白的水平降低到足以使肠内分泌或其他不产生胰岛素的细胞获得Ins+表型，包括表达胰岛素。

在测定中显著高于对照中的水平意味着可通过常用测定(elisa或ria)检测，而在对照群体中胰岛素不能通过此类测定检测。显著降低的Foxo1蛋白表达水平意指降低大于对照值的50％(注意：我们知道多达50％的降低没有任何反应，因此降低必须大于50％)。

在与导致测试群体成为产生胰岛素的细胞的试剂接触后确定对照和测试群体中胰岛素表达水平的情况下，显著更高意味着任何可靠的可检测的胰岛素水平，因为未处理的细胞是不产生胰岛素的。筛选测定领域的技术人员可以根据测定定义显著更高或显著更低。

“受试者”或“患者”是哺乳动物，通常是人，但任选地是具有兽医重要性的哺乳动物，包括但不限于马、牛、羊、狗和猫。

活性剂或药物组合物的“治疗有效量”是实现预期治疗效果的量，例如减轻、改善、缓和或消除受试者的疾病或病症的一种或多种表现。完全的治疗效果不一定通过给药一次剂量而发生，并且可能仅在给药一系列剂量后发生。因此，治疗有效量可以在一次或多次给药中给药。

“治疗”患者的疾病、疾患或病症是指采取步骤以获得有益的或期望的结果，包括临床结果。出于本公开的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻或改善疾病的一种或多种症状；减少疾病的程度；延迟或减缓疾病进展；疾病状态的改善和缓和或稳定。

如果疾病是1型糖尿病，症状包括尿频、过度口渴、极度饥饿、异常体重减轻、疲劳增加、易怒、视力模糊、生殖器瘙痒、奇怪的疼痛、口干、皮肤干燥或发痒、阳痿、阴道酵母菌感染、割伤与擦伤愈合不良、过度或异常感染。这些症状与特征性临床实验室发现有关，包括高血糖症(血液中糖浓度过高，即>125mg/dl)、血糖控制丧失(即，血糖水平在通常维持在70-110mg/dl之间的生理范围以上和以下频繁和过度波动)、餐后血糖波动、血胰高血糖素波动、血甘油三酯波动，以及包括因为糖尿病而加速和/或发生的或伴随糖尿病更常见的病症的速度或减退或改善结果的降低，所述病症包括微血管和微血管疾病包括但不限于脑血管损伤有或没有、卒中、心绞痛、冠心病、心肌梗塞、周围血管疾病、肾病、肾损伤、蛋白尿增加、视网膜病、视网膜血管新生、神经病包括可能导致四肢感觉丧失和截肢和/或源自神经病变或血管流动减少的中枢神经病变、自主神经病变和周围神经病变、皮肤病包括但不限于糖尿病皮肤病变、糖尿病脂质渐进性坏死、糖尿病性大疱病、糖尿病性硬皮病、环状肉芽肿、细菌性皮肤感染但限于会导致更深的感染的葡萄球菌和胃轻瘫(胃排空异常)。1型糖尿病可通过本领域普通技术人员熟知的方法诊断。例如，通常，糖尿病患者具有大于126mg/dL葡萄糖的空腹血糖结果的血浆。糖尿病前期通常在血糖水平在100至125mg/dL之间的患者中被诊断出来。其他症状也可用于诊断糖尿病、相关疾病和病症以及受胰腺功能减弱影响的疾病和病症。

当疾病是2型糖尿病时，症状包括：空腹血糖浓度(FPG)≥7.0mmol/L(126mg/dl)，或负荷后(post challenge)血浆葡萄糖浓度>11.1mmol/L(200mg/dl)，按照世界卫生组织(《糖尿病及其并发症的定义、诊断和分类》第1部分：糖尿病的诊断和分类.WHO/NCD/NCS/99.2.日内瓦；1999)的描述进行，使用含有相当于75g无水葡萄糖溶解于水中的葡萄糖负荷，或者HbA1c值≥6.5％，或糖尿病症状和偶然血浆葡萄糖≥200mg/dl(11.1mmol/L)。这些标准在儿童和青少年糖尿病的全球IDF/ISPAD指南(国际糖尿病联合会，ISBN 2-930229-72-1)中有所描述。根据获得的测试结果，受试者可以被诊断为正常、糖尿病前期或糖尿病受试者。糖尿病前期在2型糖尿病发病之前。通常，患有糖尿病前期的受试者具有的空腹血糖水平高于正常水平，但还不足以高至被归类为糖尿病。糖尿病前期大大增加了患糖尿病的风险。2型糖尿病是一种进行性疾病，如果不加以控制，会随着时间推移导致需要胰岛素给药，即胰岛素依赖。

除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常容差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语约修饰。

本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50构成的组的任何数值、数值的组合或子范围。

本文提供的任何化合物、组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“生物标志物”包括提及多于一种生物标志物。

除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为包括性的。

术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”，并且可以与短语“包括但不限于”互换使用。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“主要由……组成”或“基本上由……组成”等同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所引用内容更多的内容，只要所引用内容的基本或新颖特征不因存在比所引用内容更多的内容而改变，但排除现有技术实施方式。

具体实施方式

本公开的实施方式建立在以下发现之上，抑制肠道细胞中的Foxo1导致产生胰岛素阳性肠内分泌细胞(肠道Ins

至少部分地基于这些发现，本发明的某些实施方式涉及通过使肠道Ins

可通过确定所述方法是否改善所治疗疾病的任何症状来监测本文所述治疗方法的功效。替代地，可以监测血清胰岛素或C-肽(胰岛素分泌的副产物和功能性Ins+细胞的指数)的水平，这些水平应响应于治疗而增加。替代地，可以通过监测糖血、糖耐量、脂肪量、体重增加、酮体或所治疗的受试者中列举的疾病或疾患的其他指标来测量功效。

除了降低的胰岛素分泌外，受损的胰腺功能包括产生和/或分泌一种或多种胰腺激素的能力改变，所述一种或多种胰腺激素包括一种或多种胰肽诸如胰高血糖素、胰多肽、生长抑素、IAPP(胰岛淀粉样多肽)、胰岛淀粉素或食欲刺激素。与胰腺功能受损相关的众所周知的病理包括1型糖尿病和2型糖尿病。其他病理包括有时被称为成年潜伏性自身免疫性糖尿病、糖尿病前期、空腹血糖受损、糖耐量受损、空腹高血糖、胰岛素抵抗综合征和高血糖病症的病理。所有这些都在治疗和预防糖尿病的含义之内。

还发现可以使用药物二氮嗪关闭通过肠道Ins

因此，本发明的某些实施方式涉及用于治疗或预防1型或2型糖尿病，或如本文定义的其他列举的疾病或疾患的方法，这些疾病或疾患与动物的不适当低的胰岛素或胰腺功能受损有关，通过将治疗有效量的Foxo1抑制剂与Notch抑制剂和/或ROCK抑制剂共同给药以产生肠道Ins

列举的试剂

Foxo

术语“FOXO1抑制剂”是指通过直接靶向FOXO1蛋白和/或靶向其结合配偶体、其靶基因或控制FOXO表达的信号网络来完全或部分抑制FOXO1蛋白的活性的化合物。Foxo1抑制剂还可以靶向蛋白质进行降解，阻止其进入核，干扰其与DNA或转录过程的其他效应物结合，从而导致无法调节基因表达。FOXO1抑制剂或FOXO1拮抗剂可以包括FOXO1活性的直接抑制剂以及FOXO家族结合配偶体的调节剂(包括雄激素受体、雌激素受体和smad3)、FOXO家族靶基因的调节剂(包括p15、p21和p27)和控制FOXO家族表达的信号网络的调节剂(包括Skp2)。因此，术语“FOXO1抑制剂”旨在包括但不限于中和FOXO1的作用，特别是其作为转录因子的功能的分子。FOXO结合配偶体包括：雄激素受体、β-联蛋白、组成型雄甾烷受体、Cs1、C/EBPα、C/EPBβ、雌激素受体、FoxG1、FSH受体、HNF4、HOXA5、HOXA10、心肌素、PGC-1α、PPARα、PPARγ、孕甾烷X受体、孕酮受体、视黄酸受体、RUNX3、smad3、smad4、STAT3、甲状腺激素受体(van der Vos和Coffer，2008，肿瘤基因(Oncogene)27:2289-2299)。FOXO家族靶基因包括：BIM-1、bNIP3、Bcl-6、FasL、Trail(细胞死亡)、过氧化氢酶、MnSOD、PA26(解毒)；GADD45、DDB1(DNA修复)、p27KIP1、GADD45、p21CIP1、p130、周期蛋白G2(细胞周期阻滞)、葡萄糖激酶、G6Pase、PEPCK(葡萄糖代谢)、NPY、AgRP(能量稳态)、BTG-1、p21CIP1(差异化)、萎缩素-1(atrogin-1)(萎缩)(Greer和Brunet，2005，肿瘤基因(Oncogene)，24(50):7410-25)。控制FOXO表达的信号网络的调节剂包括Skp2(Huang和Tindall，2007，细胞科学杂志(Journalof Cell Science)120:2479-248)。Hausler等人，自然通讯(Nat Commun.)2014年10月13日:5:5190提出了许多其他Foxo靶标。

FOXO1抑制剂抑制或降低Foxo1的生物活性或表达。Foxo1抑制剂可以包括小分子、肽、肽模拟物、促进蛋白质降解的试剂(例如，通过将其靶向蛋白酶体)、嵌合蛋白、天然或非天然蛋白质、核酸或核酸衍生的聚合物诸如DNA和RNA适配体、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、反义核酸、微RNA(miRNA)或互补DNA(cDNA)、PNA(肽核酸)或LNA(锁核酸)、抗体拮抗剂诸如中和抗FOXO1抗体，或驱动此类FOXO1抑制剂表达的表达载体(vector)。

Foxo1的小分子抑制剂包括但不限于5-氨基-7-(环己基氨基)-1-乙基-6-氟-4-氧亚基1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1842856)，1-环戊基-6-氟-4-氧亚基-7-(四氢-2H-吡喃-3-基氨基)-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1841674)，7-(环己基氨基)-6-氟-4-氧亚基-1-(丙-1-烯-2-基)-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1838489)，7-(环己基氨基)-6-氟1-(3-氟丙-1-烯-2-基)-4-氧亚基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1837976)，7-(环己基氨基)-1-(环戊-3-烯-1-基)-6-氟-4-氧亚基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1805469)，7-(环己基氨基)-6-氟-5-甲基-4-氧亚基-1-(戊-3-基)-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(AS1846102)(Nagashima等人，2010，分子药理学(Molecular Pharmacology)78:961-970)，2-环戊基-N-[2,4-二氯-3-(异喹啉-5-基氧甲基)苯基]N-甲基乙酰胺(AS1708727)(Tanaka等人，欧洲药理学杂志(European Journalof Pharmacology)645：185-191)，2-(2-(甲基氨基)嘧啶-4-基)-1,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,2-c]吡啶-4-酮(化合物8)，N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1H-吡唑-5-基)-3-氯-4-甲氧基苯甲酰胺(化合物9)，N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1H-吡唑-5-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(化合物10)，(2-氯-4-((4-(1-异丙基)-2-甲基-1H-咪唑-5-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)(1,4-氧氮杂环庚-4-基)甲酮(化合物11)，2-(2-((4-((4-(1-异丙基-2-甲基-1H-咪唑-5-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)磺酰基)乙氧基)乙-1-醇(化合物12)和7-(3-甲氧基吡啶-4-基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1(2H)-酮(化合物13)(Langlet等人，2017，细胞(Cell)171,824-835)。

靶向FOXO1的siRNA或shRNA的实例包括siRNA #6242(Alikhani等人，2005，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)280:12096-12102)，以及针对FOXO1的抗体的实例包括抗体#9454(Kanao等人，2012，PloS ONE 7(2)，e30958)、抗体H128和ac11350(Liu等人，PLoS ONE 8(2)，e58913)。FOXO1抑制剂还包括抑制FOXO1的正确核定位的分子，诸如例如由选自由以下组成的组的任一基因编码的蛋白质：血清/糖皮质激素调节激酶(登录号：BC016616)，FK506结合蛋白8(登录号：BC003739)，载脂蛋白A-V(登录号：BC011198)，分层蛋白(stratifin)(登录号：BC000995)，转运蛋白1(登录号：BC012035)，真核翻译延伸因子1α1(登录号：BC010735)，淋巴细胞胞质蛋白2(登录号：BC016618)，硫化物醌还原酶样(登录号：BC011153)，血清/糖皮质激素调节激酶样(登录号：BC015326)，酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，ζ多肽(登录号：BC003623)，酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，γ多肽(登录号：BC020963)，如US 2009/0156523的表2中所述。

FOXO1抑制剂还可以包括FOXO1的显性阴性突变体。在Nakae等人，临床研究杂志(JClin Invest)，2001 108(9)：1359-1367中描述了此类突变体的实例。FOXO1显性阴性突变体的特定实例是Δ256突变体Foxo1。显性阴性FOXO1突变体可以蛋白质形式给药或可以通过表达载体在体内表达。

FOXO蛋白

Foxo蛋白的定义特征是叉头框(forkhead box)或基序，其是具有约80到100个氨基酸的DNA结合域，并且由三个螺旋和两个特征性大环或“翼”组成。遵循这些蛋白质的标准化命名法，所有字母都大写的用于人类(例如FOXO1)，并且只有第一个字母大写的用于小鼠(例如Foxo1)。在GenBank NM_002015.3中定义的FOXO1基因(以前也是FOXO1；FKH1；FKHR；和FOXO1A)是胰岛素反应组织诸如肝、脂肪和胰腺细胞中最丰富的FOXO同种型。FOXO4(又名AFX；AFX1；MLLT7；MGC120490；FOXO4)在GenBank NM_005938.3中列出)；FOXO3(又名FOXO2；AF6q21；FKHRL1；FOXO3A；FKHRL1P2；MGC12739；MGC31925；DKFZp781A0677)；在GenBank NM_001455.3中列出。所有内容均通过引用并入本文。本领域技术人员将能够基于该序列使用本领域已知的方法构建合适的反义核苷酸和siRNA。

编码各种FOXO蛋白的基因与动物(包括人和小鼠)中的蛋白本身之间的显著同源性意味着靶向FOXO1 mRNA或基因的shRNA、SiRNA和反义RNA或DNA也可与FOXO3和FOXO4充分互补，以减少它们的表达。类似地，旨在靶向FOXO4或FOXO3的siRNA和反义序列可与FOXO1充分互补以减少其表达。因为实验是在小鼠上进行的，所以始终使用小写字母命名法，但是，如本文所用，“Foxo”意为来自任何物种的任何Foxo蛋白、基因或mRNA。出于本发明的方法和组合物的目的，“Foxo蛋白”包括直系同源物(不同物种中的类似物)，如Foxo1及其生物活性片段。在某些实施方式中，通过降低一种或多种Foxo蛋白例如Foxo1的表达或活性来产生所需的肠道Ins

由于序列同源性，针对小鼠Foxo1制备的反义或siRNA可用于其他动物，包括人，反之亦然。所有基因ID和登录号以及编码Foxo蛋白、基因、mRNA和cDNA的相应核苷酸在此通过援引全部明确并入本文。

表1.FOXO基因和mRNA的基因ID号

智人叉头框O1(FOXO1)，mRNA

NCBI参考序列：NM_002015.3

小家鼠(Mus musculus)叉头框O1(Foxo1)，mRNA

NCBI参考序列：NM_019739.3

褐家鼠(Rattus norvegicus)叉头框O1(Foxo1)，mRNA

NCBI参考序列：NM_001191846.1

智人叉头框O3(FOXO3)，转录变体1，mRNA

NCBI参考序列：NM_001455.3

智人叉头框O3(FOXO3)，转录变体2，mRNA

NCBI参考序列：NM_201559.2

小家鼠叉头框O3(Foxo3)，mRNA

NCBI参考序列：NM_019740.2

褐家鼠叉头框O3(Foxo3)，mRNA

NCBI参考序列：NM_001106395.1

智人叉头框O4(FOXO4)，转录变体2，mRNA

NCBI参考序列：NM_001170931.1

智人叉头框O4(FOXO4)，转录变体1，mRNA

NCBI参考序列：NM_005938.3

褐家鼠叉头框O4(Foxo4)，mRNA

NCBI参考序列：NM_001106943.

小家鼠叉头框O4(Foxo4)，mRNA

NCBI参考序列：NM_018789.2

基因组RefSeqGene，FOXO1人，NG_023244.1.

Foxo1小家鼠菌株C57BL/6J染色体3，MGSCv37 C57BL/6J，NC_000069.5.

Foxo1大鼠，NC_005101.2，NW_047625.2.

FOXO3人，NC_000006.11.

Foxo3小鼠，NC_000076.5.

Foxo3大鼠，NC_005119.2.

FOXO4人，NC_000023.10.

Foxo4小鼠，NC_000086.6.

Foxo4大鼠，NC_005120.2.

叉头框O1[小家鼠]

GenBank：EDL35224.1

叉头蛋白FKHR1[小鼠]

Swiss-Prot:Q9WVH5

叉头框蛋白O1[智人]

NCBI参考序列：NP_002006.2

叉头框蛋白O1[褐家鼠]

NCBI参考序列：NP_001178775.1

叉头框蛋白O3[智人]

NCBI参考序列：NP_963853.1

叉头框蛋白O3[智人]

NCBI参考序列：NP_001446.1

叉头框蛋白O3[褐家鼠]

NCBI参考序列：NP_001099865.1

叉头框蛋白O3[小家鼠]

NCBI参考序列：NP_062714.1

叉头框蛋白O4[褐家鼠]

NCBI参考序列：NP_001100413.1

叉头框蛋白O4同种型2[智人]

NCBI参考序列：NP_001164402.1

叉头框蛋白O4同种型1[智人]

NCBI参考序列：NP_005929.2

叉头框蛋白O4[小家鼠]

NCBI参考序列：NP_061259.1

Notch抑制剂

Notch信号传导途径已被确定在许多不同的生物学功能中发挥重要作用，包括分化和细胞增殖(参见美国专利No.6,703,221)。该途径由依赖于调节的蛋白水解的四种不同的跨膜受体亚型(称为Notch1-Notch4)激活。Notch的表达模式和功能取决于细胞类型和环境。配体结合后，受体被ADAM家族的金属蛋白酶(Bru等人，Mol.Cell 5:207-216(2000)；Mumm等人，Mol.Cell 5:197-206(2000))和早老蛋白依赖性γ-分泌酶(Selkoe等人，Annu.Rev.Neurosci.26:565-97(2003)；De Strooper等人，Nature 398:518-522(1999))连续切割。最后的蛋白水解切割步骤允许Notch受体的细胞内结构域转移到细胞核，在那里它与转录因子相互作用以诱导靶基因表达。

在细胞核中，Notch胞内结构域经历泛素化。弗林(furin)蛋白酶对Notch前体蛋白的蛋白水解加工及其向细胞膜的运输也决定了受体的转换和可用性，并进而决定了该信号传导途径的激活。Notch胞外结构域的糖基化被边缘(Fringe)蛋白家族成员改变也可修改配体结合的效率。

Notch途径有助于发育期间的生物过程和成人的疾病机制(Bray等人，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.7:678-689(2006)；Artavanis-Tsakonas等人，Science 284:770-776(1999))。通过配体与Notch受体(两者均在细胞表面上表达)的结合的直接细胞与细胞接触触发了下游反应(Thurston等人，Nat.Rev.Cancer 7:327-331(2007))。

Notch抑制剂部分或全部阻止或抑制Notch途径的组分的活性。在一个实例中，Notch途径的组分是Notch蛋白，其包括notch或参与notch信号传导途径的其他蛋白。Notch途径抑制剂是本领域已知的。在一些实施方式中，Notch抑制剂是γ分泌酶抑制剂(GSI)。γ分泌酶是切割Notch的多亚基蛋白酶复合物。这种切割从细胞膜上释放出Notch，允许Notch进入细胞核并修饰基因表达。

可以作为治疗的一部分提供的Notch抑制剂可以包括小分子、肽、肽模拟物、嵌合蛋白、天然或非天然蛋白、核酸或核酸衍生的聚合物诸如DNA和RNA适配体、siRNA(小干扰RNAs)、shRNA(短发夹RNAs)、反义核酸、微RNA(miRNA)或互补DNA(cDNA)、PNA(肽核酸)或LNA(锁核酸)、具有Notch拮抗活性的融合蛋白、抗体拮抗剂诸如中和抗Notch抗体，或驱动此类Notch抑制剂表达的表达载体。

小分子Notch抑制剂包括但不限于DAPT；LY411575；MDL-28170；R04929097；L-685458((5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羟基-(2R)苄基己酰基)-L-亮氨酸-L-苯丙氨酸-酰胺)；BMS-708163(Avagacestat)；BMS-299897(2-[(1R)-1-[[(4-氯苯基)磺酰基](2,5-二氟苯基)氨基]乙基-5-氟苯丁酸)；M-0752；YO-01027；MDL28170(Sigma)；LY41 1575(N-2((2S)-2-(3,5-二氟苯基)-2-羟基乙酰基)-N1-((7S)-5-甲基-6-氧亚基-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂

此外，Notch抑制剂包括反义核酸；RNA干扰分子(例如siRNA)；针对Notch转录物的显性阴性突变体；及其表达载体。这些基于核苷酸的抑制剂的实例可商购获得，诸如从ThermoFisher Scientific等，并且描述于PCT公布WO2005/042705和美国专利公布2012/0322857、美国专利公布2007/0093440；和Okuhashi等人，抗癌研究(Anticancer Research)2013年10月第33卷第10期4293-4298。

Rock抑制剂

ROCK抑制剂没有特别限制，只要它可以抑制Rho激酶(ROCK)的功能。其实例包括：Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸盐)(例如，Ishizaki等人，Mol.Pharmacol.，57,976-983，2000；Narumiya等人，Methods Enzymol.，325，273-284，2000)；Fasudil/HA1077(例如，Uenata等人，Nature 389：990-994，1997)；H-1152(例如Sasaki等人，Pharmacol.Ther.，93：225-232，2002)；Wf-536(例如Nakajima等人，Cancer Chemother.Pharmacol.,52(4)：319-324，2003)及其衍生物；针对ROCK的反义核酸；RNA干扰分子(例如siRNA)；显性阴性突变体；及其表达载体。由于其他低分子量化合物被称为ROCK抑制剂，此类化合物及其衍生物也可用于本发明(例如，美国专利申请公开No.2005/0209261、2005/0192304、2004/0014755、2004/0002508、2004/0002507、2003/0125344和2003/0087919，WO2003/062227、WO2003/059913、WO2003/062225、WO2002/076976和WO2004/039796)。在本发明中，可以使用一种或多种类型的ROCK抑制剂。

在本公开的背景下，ROCK抑制剂包括ROCK1和/或ROCK2的抑制剂两者。Rho相关蛋白激酶(ROCK)是一种属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。它主要涉及通过作用于细胞骨架来调节细胞的形状和运动。由Morgan-Fisher等人(2013)组织化学和细胞化学杂志(J Histochem Cytochem)61(3)185-198综述了关于ROCK的细节以及它们的功能。ROCK I(也称为p160ROCK和ROKβ)和ROCK II(Rho-激酶和ROKα)这两种ROCK是由不同基因编码的160-kDa蛋白。两种激酶的mRNA都普遍表达，但ROCK I蛋白主要存在于诸如肝、肾和肺的器官中，而ROCK II蛋白主要存在于肌肉和脑中。两种ROCK的氨基酸序列高度同源(～65％)，并且它们表现出相同的整体结构域结构。

ROCK在大约20年前首次被确定，并被认为是Rho下游肌动蛋白细胞骨架的调节剂。从那时起，已经确定了ROCK的一系列相互作用伙伴，其中许多与肌动蛋白细胞骨架的调节有关，包括埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)、LIM激酶(LIMK)、肌球蛋白轻链(MLC)和MLC-磷酸酶(MLCP)。

ROCK活性是指ROCK的任何功能，诸如通过下游底物的磷酸化调节细胞骨架，导致肌动蛋白丝稳定性增加和肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的产生。

哺乳动物细胞编码两种Rho激酶，ROCK1和ROCK2。这些激酶通过与活性GTP结合的Rho GTPase结合而被激活。因此，本文提及的ROCK蛋白包括ROCK1和ROCK2。如上所述，ROCK磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基上的许多底物。这些底物涉及广泛的细胞行为。例如，肌球蛋白轻链磷酸酶，参与应力纤维形成和收缩；LIM激酶，参与肌动蛋白稳定；NHE1参与焦点粘着和肌动蛋白；以及PTEN和Ezrin(Mueller等人，Nat.Rev.Drug Discov.4:387-398，2005；Riento等人，Nat.Mol.Cell Biol.4:446-456，2003)。ROCK抑制剂诸如Y-27632和法舒地尔(Fasudil)与激酶结构域中的催化位点结合并取代ATP。

ROCK抑制剂是本领域技术人员公知的，并且本领域中建议的此类抑制剂在本文中描述并且用于治疗几种临床病症的临床试验中。这些抑制剂包括目前在日本用于治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的法舒地尔。其他ROCK抑制剂已通过针对青光眼和脊髓损伤的I期和II期试验，实例包括Wf-536、Y-27632、RKI-1447和Slx-2119。

在一种实施方式中，ROCK抑制剂是小分子。本领域中描述的示例性小分子ROCK抑制剂包括Y-27632(美国专利No.4,997,834)和法舒地尔(也称为HA 1077；Asano等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.241:1033-1040，1987)。

报道的特异性抑制ROCK的其他小分子包括H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪，Ikenoya等人，J.Neurochem.81:9，2002；Sasaki等人，Pharmacol.Ther.93:225，2002)；N-(4-吡啶基)-N′-(2,4,6-三氯苯基)脲(Takami等人，Bioorg.Med.Chem.12:2115，2004)；以及3-(4-吡啶基)-1H-吲哚(Yarrow等人，Chem.Biol.12:385，2005)。

其他的小分子Rho激酶抑制剂包括在WO03/059913、WO03/064397、WO05/003101、WO04/112719、WO03/062225、WO07/042321和WO03/062227；美国专利No.7,217,722和美国专利No.7,199,147；和U.S.2003/0220357、U.S.2006/0241127、U.S.2005/0182040和U.S.2005/0197328；以及EP2542528、EP2597953中描述的那些抑制剂。表1中提供了众所周知的ROCK抑制剂的非限制性概述(其中一些还描述于：法舒地尔：Ying等人，Mol.CancerTher.5:2158，2006；Y27632：Routhier等人，Oncol.Rep.23:861，2010；Y39983：Tanihara等人，Clin.Sciences 126：309，2008；RKI-1447：Patel等人，Cancer Res.72:5025，2012；GSK269962A：Doe等人，J Pharm.Exp.Ther.320:89，2007)。

可以根据教导实施的ROCK抑制剂的进一步实例包括但不限于AMA-0076；AMA-0247；AR-12286；AR-13324；AS-1892802；ATS-8535；ATS-907；BA-1037；BA-1049；CCG-1423(CAS号285986-88-1)；Cethrin；DE-104；GSK2699662(CAS号850664-21-0)；GSK429286(CAS号864082-47-3)；H1152P(CAS号451462-58-1)；HA1077(法舒地尔；CAS号103745-39-7)；HA1100(CAS号105628-72-6)；盐酸(羟基法舒地尔)；HMN-1152；K-115；Ki-23095；Rho抑制剂(C

ROCK抑制剂的其他实例包括在国际专利公布WO98/06433、WO00/09162、WO00/78351、WO01/17562、WO02/076976、EP1256574、WO02/100833、WO03/082808、WO2004/009555、WO2004/024717、WO2004/108724、WO2005/003101、WO20Q5/035501、WO2005/035503、WO2005/035506、WO2005/058891、WO2005/074642、WO2005/074643、WO2005/Q80934、WO2005/082367、WO2005/082890、WO2005/097790、WO2005/100342、WO2005/103050、WO2005/105780、WO2005/108397、WO2006/044753、WO2006/051311、WO2006/057270、WO2006/058120、WO2006/072792、WO 2011107608A1和WO 2007026920A2中描述的那些抑制剂。

在某些实例中，ROCK抑制剂是能够抑制ROCK活性的小干扰核苷酸序列，诸如使用一个或多个小双链RNA分子的siRNA。例如，通过将细胞(一次或反复)暴露于有效量的合适的小干扰核苷酸序列，可以降低或敲减(knock down)细胞中的ROCK活性。技术人员知道如何设计这样的小干扰核苷酸序列，例如在手册诸如Doran和Helliwell RNA干扰：用于植物和动物的方法第10卷CABI 2009中所描述的。多种技术可用于评估此类小干扰核苷酸序列对ROCK活性的干扰，诸如WO 2005/047542中所述的，例如通过确定候选小干扰核苷酸序列是否降低ROCK活性。可以选择能够干扰的候选小干扰核苷酸序列进一步分析以确定它们是否也抑制黑素瘤细胞的增殖，例如通过评估黑素瘤细胞中是否发生与抑制黑素瘤细胞增殖相关的变化。ROCK的基于核苷酸的抑制剂的实例可从例如ThermoFisher Scientific和Santa Cruz Biotech商购获得。已知的基于核苷酸的抑制剂的其他实例在PCT公布WO2006/053014；PCT公布WO2010/065907和EP2628482A1中描述。

反义和RNA干扰分子

已经注意到Foxo抑制剂、Notch抑制剂或ROCK抑制剂可以包括反义核酸(DNA或RNA)；干扰RNA诸如小干扰RNA(siRNA)或shRNA、微RNA或核酶，以降低或抑制表达以及从而目标蛋白的生物活性。基于靶向的Foxo、Notch和ROCK蛋白的已知序列以及编码它们的基因，可以使用本领域已知的方法容易地设计和工程化与相应基因或mRNA充分互补以关闭或降低表达的反义DNA或RNA。在特定的实施方式中，用于本发明的反义或siRNA分子是在严格条件下与编码一种或多种由GenBank编号确定的Foxo蛋白的靶向的mRNA或靶向的基因，或与基本上同源于编码一种或多种Foxo、Notch或ROCK蛋白的mRNA或基因的变体或片段结合的那些分子。靶向Foxo蛋白的反义分子、siRNA或shRNA的实例在美国专利No.8,580,948和9,457,079等中提供，其通过援引并入。

制备反义核酸的方法是本领域众所周知的。进一步提供了降低一种或多种Foxo、Notch或ROCK基因和mRNA在不产生胰岛素的肠道细胞中的表达的方法，通过使一种或多种本发明的反义化合物或组合物与所述细胞原位接触或与分离的富集细胞群或培养中的包含所述细胞的组织外植体接触。如本文所用，术语“靶核酸”包括编码Foxo、Notch或ROCK蛋白的DNA和从此类DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA)。核酸寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰靶核酸的正常功能。这种通过与其特异性杂交的化合物对靶核酸的功能的调节通常称为“反义”。被干扰的DNA的功能包括复制和转录。被干扰的RNA的功能包括所有重要功能，诸如例如将RNA易位到蛋白质翻译位点，从RNA翻译蛋白质，以及RNA可能参与或促进的催化活性。这种对靶核酸功能的干扰的总体影响是调节或降低由DNA或RNA编码的蛋白质的表达。在本发明的背景中，“调节”是指降低或抑制一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA的表达。

靶向过程包括确定编码Foxo、Notch或ROCK蛋白的靶DNA或RNA内的一个或多个位点，以发生反义相互作用，从而实现所需的抑制效果。在本发明的背景中，优选的基因内位点是包含靶蛋白的mRNA的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的区域。因为，如本领域已知的，翻译起始密码子通常是5'-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中的5'-ATG)，所以翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因的翻译起始密码子具有的RNA序列为5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG，并且5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包括许多密码子序列，尽管在每种情况下的起始氨基酸在真核生物中通常是甲硫氨酸。本领域还已知真核基因可具有两个或更多个替代起始密码子，其中任何一个可优先用于特定细胞类型或组织中或特定条件组下的翻译起始。在本发明的背景中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于启动从基因转录的mRNA分子的翻译的一个或多个密码子。常规实验将确定反义或siRNA的最佳序列。

本领域还已知基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三种序列之一，即5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA(相应的DNA序列分别为5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)。术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指这样一部分mRNA或基因，其从翻译起始密码子在任一方向(即，5'或3')上包含约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指这样一部分mRNA或基因，其从翻译终止密码子在任一方向(即，5'或3')上包含约25至约50个连续核苷酸。

本领域已知的开放阅读框(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可以被有效靶向的区域。其他靶区包括5'非翻译区(5'UTR)，本领域已知是指从翻译起始密码子在5'方向上的mRNA部分，并因此包括mRNA的5'加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸，以及3'非翻译区(3'UTR)，本领域已知是指从翻译终止密码子在3'方向上的mRNA部分，并因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3'端之间的核苷酸或基因上相应的核苷酸。

本领域还已知，可以通过使用替代信号来启动或停止转录来产生变体，并且前mRNA和mRNA可以具有多于一个起始密码子或终止密码子。使用替代起始密码子的源自前mRNA或mRNA的变体被称为该前mRNA或mRNA的“替代起始变体”。那些使用替代终止密码子的转录物被称为该前mRNA或mRNA的“替代终止变体”。一种特定类型的替代终止变体是“polyA变体”，其中产生的多种转录物由转录机制对“polyA终止信号”之一的替代选择产生，从而产生终止于独特polyA位点的转录物。

一旦确定了一个或多个靶位点，就选择与靶充分互补的核酸；意味着核酸将充分杂交并具有足够的特异性，以产生抑制基因表达和转录或mRNA翻译的所需效果。

在本发明的背景下，“杂交”是指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键结合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，它们通过形成氢键配对。如本文所用，“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸的某个位置处的核苷酸能够与DNA或RNA分子的相同位置处的核苷酸氢键结合，则认为该核酸与DNA或RNA在那个位置是彼此互补的。当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此氢键结合的核苷酸占据时，核酸和DNA或RNA是彼此互补的。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用于表示足够程度的互补性或精确配对的术语，以便在核酸和DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。本领域理解反义化合物的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以进行特异性杂交。当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能导致功能丧失时，反义化合物是可特异性杂交的，并且有足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶序列的非特异性结合，即在体内测定或治疗性处理情况时的生理条件下，以及在体外测定的情况时在进行测定的条件下。

根据本文教导的反义化合物可包含约8至约50个核碱基(即，约8至约50个连接的核苷)。在特定的实施方式中，反义化合物是包含约12至约30个核碱基的反义核酸。替代地，反义化合物属于核酶、外部引导序列(EGS)核酸(寡酶(oligozyme))和其他与靶核酸杂交并调节其表达的短催化RNA或催化核酸。本发明上下文中的核酸包括“寡核苷酸”，其是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸，以及具有功能类似的非天然存在部分的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，这是因为期望的特性诸如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增强的稳定性。

反义核酸已被用作治疗动物和人类的疾病状态的治疗部分。反义核酸药物，包括核酶，已安全且有效地给药于人体，并且目前正在进行大量临床试验。因此确定核酸可以是有用的治疗方式，其可以被配置成可用于治疗细胞、组织和动物尤其是人类的治疗方案中，例如用于下调Foxo、Notch或ROCK蛋白的表达。

反义和siRNA化合物可用于诊断、治疗和预防以及作为研究试剂和试剂盒。对于治疗，怀疑患有可以通过降低Foxo、Notch或ROCK蛋白的表达来治疗的其中存在不适当的低胰岛素水平的疾病或疾患(诸如糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良和/或肥胖)的动物，优选人，根据本文的教导通过给药反义化合物进行治疗。通过将有效量的反义化合物加入到合适的药学上可接受的稀释剂或载体中，可以将化合物用于药物组合物中。本发明的反义化合物和方法可用于预防，例如以预防或延迟糖尿病、葡萄糖耐受不良、代谢综合征或肥胖的出现。本发明的反义化合物和方法还可用于延缓代谢综合征、葡萄糖耐受不良、糖尿病、动脉粥样硬化或肥胖的进展。

虽然反义核酸是反义化合物的典型形式，但本公开包括其他寡聚反义化合物，包括但不限于寡核苷酸模拟物。

本发明还包括包含本文所述反义化合物的药物组合物和制剂。术语“制剂”包含在术语组合物中。

在哺乳动物细胞培养中，siRNA介导的基因表达降低已经通过用合成RNA核酸转染细胞来实现(Caplan等人，2001；Elbashir等人，2001)。2004/0023390申请，其全部内容通过援引并入本文，如同在本文中完整阐述一样，提供了使用病毒载体的示例性方法，所述病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至编码靶向目标基因的小干扰RNA分子(siRNA)的核酸序列的pol II启动子。

某些实施方式涉及shRNA、反义或siRNA在动物中阻断FOXO1、3和/或4、Notch或ROCK或其直系同源物、类似物和变体的表达的用途。可以使用本领域的常规技术设计反义核苷酸以靶向编码FOXO、Notch或ROCK蛋白的人DNA或mRNA，如下文更详细描述的。本发明的反义化合物在体外合成，且不包括生物来源的反义组合物，或设计用于指导反义分子的体内合成的基因载体构建体。

存在将反义或RNA干扰分子递送至肠道细胞的各种实施方式。有经过测试的递送方法来实现体内转染，诸如用脂质体或纳米颗粒包被siRNA。还有一种新技术专门针对将siRNA递送至肠道上皮，称为“Transkingdom RNA干扰”。该技术的发明人已经对非致病性大肠杆菌细菌进行了基因工程化，其能够产生靶向哺乳动物基因的短发夹RNA(shRNA)(Xiang,S.等人，2009.通过TransKingdom RNAi(kRNAi)的体外和体内基因沉默(In vitroand in vivo gene silencing by TransKingdom RNAi(tkRNAi)).Methods Mol Biol487:147-160)。使用两个因素来促进shRNA转移：侵染素(Inv)和李斯特菌溶血素O(HlyA)基因。他们已经证明，重组大肠杆菌可以通过口服给药来递送靶向联蛋白b1(Ctnnb1)的shRNA，该shRNA会抑制该基因在肠上皮细胞中的表达，而不会因细菌渗漏到血液中而导致明显的全身并发症。本发明的某些实施方式涉及使用适于沉默一种或多种Foxo蛋白的siRNA的Transkingdom RNA干扰方法。

其他人已经使用这种技术来敲减Abcb1(Kruhn,A.等人，2009.通过transkingdomRNA干扰递送短发夹RNA调节经典ABCB1介导的癌细胞的耐多药表型(Delivery of shorthairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells).Cell Cycle 8)。

在一种特定实例中，编码Foxo1 shRNA的细菌可以从Cequent Technologies购买，并且尤其可以通过以推荐浓度经口灌胃给药。可以使用活组织检查例如或测试动物中肠道细胞中Foxo1敲减的分析来确定剂量。

在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸，以及具有功能类似的非天然存在部分的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，这是因为期望的特性诸如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增强的稳定性。

嵌合反义化合物可以形成如上所述的两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。此类化合物在本领域中也被称为杂交体或缺口聚物(gapmer)。教导制备此类杂交体结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922。

反义核酸或RNA干扰分子通常给药于受试者或原位产生，使得它们与编码目标蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA充分杂交或结合，从而降低蛋白质的表达，例如通过减少转录和/或翻译。杂交可以通过常规核苷酸互补以形成稳定的双链体，或者，例如，在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。本发明的反义核酸分子的给药途径的实例包括在组织部位直接注射。替代地，可以修饰反义核酸分子或RNA干扰分子以靶向选定的细胞，并然后全身给药。例如，对于全身给药，可以修饰反义分子以使其特异性结合在选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过将反义核酸分子连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体。

也可以使用本文所述的载体将反义核酸分子或RNA干扰分子递送至细胞。为了获得足够的反义分子的细胞内浓度，载体构建体中可以将反义核酸分子或干扰RNA分子置于强pol II或pol III启动子控制下。

用于本文的反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交体，与通常的β单元相反，其中的链彼此平行(Gaultier等人，(1987)Nucleic Acids.Res.15:6625-6641)。反义核酸分子还可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，(1987)Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人，(1987)FEBS Lett.215:327-330)。上述关于反义技术的文章中描述的所有方法均通过援引并入本文。

抑制剂实施方式还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与它们具有互补区的单链核酸，诸如mRNA。因此，核酶(例如，锤头状核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591中所述)可用于催化切割靶向的mRNA转录物，从而抑制翻译。可以根据其cDNA的核苷酸序列设计对靶向的编码核酸具有特异性的核酶。例如，可以构建Tetrahymena L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与靶向的mRNA中待切割的核苷酸序列互补。参见，例如，Cech等人美国专利No.4,987,071；和Cech等人美国专利No.5,116,742。替代地，靶向的FOXO、Notch或ROCK mRNA可用于从RNA分子池中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见，例如，Bartel和Szostak(1993)Science261:1411-1418，其通过援引并入本文。

如本文所用，术语“核酸”是指RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA和合成(例如，化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链的(即正义或反义单链)。如本文所用，“分离的核酸”是指与哺乳动物基因组中存在的其他核酸分子分离的核酸，其他核酸分子包括通常位于哺乳动物基因组中该核酸的一侧或两侧的核酸(例如，在ARPKD基因侧面的核酸)。如本文所用的关于核酸的术语“分离的”还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在的序列在自然界中未发现并且在天然存在的基因组中不具有紧邻连续的序列。

分离的核酸可以是，例如DNA分子，条件是通常在天然存在的基因组中紧邻该DNA分子侧面存在的核酸序列之一被去除或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于独立于其他序列的作为单独的分子存在的DNA分子(例如，化学合成的核酸，或通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA的DNA。此外，分离的核酸可以包括工程化核酸，诸如作为杂交体或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库或包含基因组DNA限制性消化的凝胶切片中的数百至数百万其他核酸中的核酸不被视为分离的核酸。

如本文所用，“分离”是指通过人为干预改变或脱离自然状态。例如，天然存在于活体动物中的siRNA不是“分离的”，但合成的siRNA，或部分或完全与其天然状态的共存材料分开的siRNA是“分离的”。分离的siRNA可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境中，诸如例如，siRNA已被递送到其中的细胞。除非另有说明，否则本文中的所有核酸序列均以5'到3'方向给出。此外，核酸序列中的所有脱氧核糖核苷酸均由大写字母表示(例如，脱氧胸苷为“T”)，而核酸序列中的核糖核苷酸均由小写字母表示(例如，尿苷为“u”)。

抗体

降低Foxo蛋白、Notch途径或ROCK的蛋白的生物活性的试剂包括对预期靶标具有特异性结合亲和力的抗体(包括抗体片段的部分或片段或变体或者抗体的变体)，从而干扰其生物活性。这些抗体识别靶蛋白或其生物活性片段中的表位，诸如Foxo 1、3或4、Notch或ROCK。在某些实施方式中，抗体降低Foxo增加N3合成的能力。

“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其抗原结合部分(片段)，其与完整的抗体竞争特异性结合，并且意在包括生物活性抗体片段。治疗或预防列举的疾病或改变所述表型的治疗上有用的抗体包括针对任何Foxo、Notch或ROCK蛋白或其类似物、直系同源物或变体的任何抗体，其降低肠道Ins-细胞诸如肠道N3 Prog细胞中相应靶标的生物活性。

一旦产生，就可以通过标准免疫测定方法测试抗体或其片段对靶多肽的识别，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)。参见，分子生物学短协议(ShortProtocols in Molecular Biology)编辑Ausubel等人，绿色出版协会(Green PublishingAssociates)和约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)(1992)。

术语“表位”是指抗体结合的抗原上的抗原决定簇。表位通常由具有化学活性的分子表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位通常具有至少五个连续的氨基酸。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体、单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab’)

对目标多肽具有特异性结合亲和力的抗体片段可以通过已知技术产生。此类抗体片段包括但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')

“分离的抗体”是这样的抗体，其(1)不与在其天然状态下伴随它的天然相关组分包括其他天然相关抗体相关，(2)不含来自相同物种的其他蛋白，(21)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。

术语“人抗体”包括具有一个或多个源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在优选的实施方式中，所有可变域和恒定域都源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以多种方式制备，如下所述。

人源化抗体是源自非人物种的抗体，其中重链和轻链的框架和恒定域中的某些氨基酸已经突变，以避免或消除人的免疫反应。替代地，人源化抗体可以通过将人抗体的恒定域与非人物种的可变域融合来产生。如何制造人源化抗体的实例可见于美国专利No.6,054,297、5,886,152和5,877,293，其通过援引并入本文。

术语“嵌合抗体”是指包含来自一种抗体的一个或多个区和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区的抗体。

根据本说明书的教导，本领域普通技术人员可以容易地制备抗体的片段、部分或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基末端出现在功能域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构域和功能域。优选地，计算机化的比较方法用于鉴定存在于已知结构和/或功能的其他蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人,Science 253:164(1991)。

试剂的生物活性片段或变体

治疗剂的生物活性片段或变体也在本发明的范围内。如本文所述，“生物活性”意为单独或与本文所述的其他试剂共同给药，增加选自包括以下的组中的至少一种效果：诱导哺乳动物肠道Ins-细胞表达胰岛素、增加胰岛素敏感性、增加糖耐量、减少体重增加、减少脂肪量、增加胰腺功能受损(即不产生或分泌正常水平的胰岛素)的动物中的体重减轻。下面描述了片段和变体。片段可以是离散的(不与其他氨基酸或肽融合)，也可以在更大的肽内。此外，几个片段可以包含在单个较大的肽中。

肽的其他变体包括为试剂提供有用的和新的特征的那些变体。例如，肽试剂的变体可具有降低的免疫原性、增加的血清半衰期、增加的生物利用度和/或增加的效力。“肽试剂的变体”是指在其氨基酸序列中含有修饰诸如一处或多处氨基酸取代、添加、缺失和/或插入但仍具有生物活性的肽。在一些情况下，相对于衍生变体的相应肽，变体的抗原性和/或免疫原性基本上没有改变。使用标准诱变技术可以容易地引入此类修饰，诸如寡核苷酸定向位点特异性诱变，例如由Adelman等人(DNA，2:183，1983)所教导的，或通过化学合成。变体和片段不是相互排斥的术语。片段还包括可以含有一个或多个氨基酸取代、添加、缺失和/或插入的肽，使得片段仍然具有生物活性。全功能变体通常仅包含保守变化或非关键残基或非关键区域中的变化。功能变体还可以包含相似氨基酸的取代，这导致功能没有变化或变化不显著。替代地，这类取代可能在某种程度上对功能产生积极或消极的影响。这样的功能试剂变体的活性可以使用诸如本文所述的那些的测定法来确定。

一些变体也是试剂的衍生物。衍生化是化学中使用的一种技术，它将化学化合物转化为具有相似化学结构的产物，称为衍生物。通常，化合物的特定官能团参与衍生化反应并将离析物转化为偏离反应性、溶解度、沸点、熔点、聚集态、功能活性或化学组成的衍生物。产生的新化学性质可用于定量或分离离析物，或可用于优化作为治疗剂的化合物。众所周知的衍生化技术可以应用于试剂。因此，上述肽试剂的衍生物将包含已经以某种方式化学修饰使得它们不同于天然氨基酸的氨基酸。

还提供了试剂模拟物。“模拟物”是指具有与天然或非天然存在的肽基本相同的结构和功能特征的合成化学化合物，并且包括例如具有修饰的主链、侧链和/或碱基的肽-和多核苷酸-样聚合物。肽模拟物通常作为非肽药物用于制药工业，其性质类似于模板肽的性质。通常，模拟物在结构上与具有生物学或药理学活性的模式肽(paradigm peptide)相似(即具有相同的形状)，但一个或多个肽键被替换。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物也可以掺入任何量的天然氨基酸保守置换，只要这种置换也不会显著改变模拟物的结构和/或活性即可。

在Karsenty美国申请20100190697中描述了可以对本发明范围内的活性试剂作出的各种蛋白质修饰的简要描述。

药物制剂

本发明的某些实施方式涉及药物组合物和制剂，其包括一种或多种如本文定义的列举的试剂，包括但不限于小分子、多肽、抗体、核酸(包括反义RNA、siRNA、微RNA、Cop1(含有胱天蛋白酶募集域的蛋白质16)和核酶，这些试剂降低FOXO、Notch或ROCK蛋白在肠道Ins-细胞中的表达和/或生物活性，从而使它们分化或转化为制造和分泌胰岛素的肠道Ins

治疗剂通常以足以治疗或预防受试者的1型和2型糖尿病、代谢综合征和肥胖或减少脂肪量的量给药。本发明的药物组合物提供有效治疗或预防列举的疾病或疾患的量的活性剂。

候选试剂可以被化学修饰以促进其被肠道Ins-细胞吸收。例如，它可以与胆汁酸或脂肪酸融合以促进被肠道细胞的吸收；或者它可以包装在脂质体或其他基于脂质的乳液系统中以促进其吸收；它可以由表达修饰的细胞表面抗原的细菌编码，这促进其与肠道上皮细胞的结合，包括N3 Prog细胞-渗透性肽，用于改善细胞摄取。(Gratton等人，NatureMedicine 9,357-362(2003))。

本发明的药物组合物可以多种方式给药，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。例如，可以靶向已知具有最高密度的可生成肠道Ins+细胞的肠道Ins-细胞的某些肠道区域。某些区域包括但不限于回肠、十二指肠、结肠和直肠。因此，在一些实施方式中，药物组合物以靶向其在肠道目标区域释放的制剂给药。在肠道中靶向递送的技术是本领域公知的。参见例如Wikberg等人，Aliment Pharmacol Ther.1997:11(Suppl3):109-115；Dar等人，(2017年)基于聚合物的药物递送：寻求局部靶向发炎的肠黏膜(Polymer-based drug delivery:the quest for local targeting of inflamedintestinal mucosa)，药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting)，25:7,582-596；美国专利公布20050058701和US20040224019；WO2014/152338；美国专利No.7670627；8414559；9023368和9730884，所有这些都通过援引并入。给药也可以是静脉内、肠胃外/动脉内、皮下、腹腔内或肌肉内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内给药。也可以使用栓剂。在一些实施方式中，配制包含活性剂的缓释制剂。术语“缓释”是指药物在超过一天的时间段内从聚合物药物递送系统中释放，其中将活性剂配制在聚合物药物递送系统中以释放有效浓度的药物。

某些药物，例如阻止胆汁酸吸收的树脂或糖分解的抑制剂，用于治疗2型糖尿病并且在血浆中根本不吸收。这类制剂可用于本发明的药物制剂。

作为单剂量或多剂量给药至个体的剂量将根据多种因素而变化，包括药代动力学特性、受试者状况和特征(性别、年龄、重量、体重指数(BMI)、总体健康)、症状的程度、同时治疗、治疗频率和所需的效果。并非意在限制，所列举的试剂的剂量范围可以在0.01和500ng/mL之间、在0.01和200ng/mL之间、在0.1和200ng/mL之间、在0.1和100ng/mL之间、在1和100ng/mL之间、在10和100ng/mL之间、在10和75ng/mL之间、在20和75ng/mL之间、在20和50ng/mL之间、在25和50ng/mL之间或在30和40ng/mL之间。在某些实施方式中，药物组合物可包含约0.1mg至5g、约0.5mg至约1g、约1mg至约750mg、约5mg至约500mg或约10mg至约100mg的治疗剂。

除了使用渗透泵持续给药之外，活性剂可以作为单一治疗给药，或者优选地可以包括一系列治疗，这些治疗以引起所列举疾病的一种或多种症状减轻或改善，或达到包括以下效果的预期效果的频率和持续时间持续：增加胰岛素分泌和血清胰岛素、增加胰岛素敏感性、增加糖耐量、减少体重增加、减少脂肪量和引起体重减轻。

应当理解，活性剂的适当剂量取决于普通技术医师、兽医或研究人员的知识范围内的许多因素。剂量变化，例如取决于被治疗的受试者或样品的身份、大小和状况，进一步取决于给药组合物的途径，以及实践者期望活性剂具有的效果。还应理解，适当剂量的活性剂取决于关于要调节的表达或活性的效力。这样的适当剂量可以使用本文所述的测定法来确定。当将这些活性剂中的一种或多种给药于动物(例如人)以调节Foxo蛋白的表达或活性时，可以首先开出相对低的剂量，随后增加剂量直到获得合适的响应。此外，应理解任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、任何药物组合以及要调节的表达或活性的程度。

1型糖尿病通常在儿童和年轻人中被诊断出——但可以发生在任何年龄，并且以前被称为青少年糖尿病。在1型糖尿病中，身体不会产生胰岛素。胰岛素是将糖(葡萄糖)、淀粉和其他食物转化为日常生活所需的能量所需要的激素。与1型糖尿病相关的病症包括高血糖症、低血糖症、酮症酸中毒和乳糜泻。

2型糖尿病是最常见的糖尿病形式。在2型糖尿病中，要么身体不产生足够的胰岛素，要么细胞忽略胰岛素。与2型糖尿病相关的病症包括高血糖症和低血糖症。

与能量代谢相关的疾患包括糖尿病、葡萄糖耐受不良、胰岛素敏感性降低、胰腺β细胞增殖降低、胰岛素分泌降低、体重增加、脂肪量增加和血清脂联素降低。

可以使用本领域公知的方法将治疗剂与可接受的载体一起配制。治疗剂的实际量将必然根据药物组合物的具体制剂、给药途径和剂量、待治疗病症的特定性质以及可能的个体受试者而变化。本发明的药物组合物的剂量范围可以很宽，取决于所需的效果、治疗适应症和给药途径、方案以及组合物的纯度和活性。

合适的受试者可以是怀疑患有、已被诊断患有或存在发展所列举疾病以及可由本领域技术人员确定的类似病症的风险的个体或动物。

配制和给药技术可见于“雷明顿:药学的科学与实践(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy)”(20.sup.th版，Gennaro(编辑)和Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，2000)，其通过援引并入本文。本发明的药物组合物可以通过医疗装置诸如但不限于导管、球囊、可植入装置、可生物降解植入物、假体、移植物、缝合线、补片、分流器或支架给药至受试者。美国专利No.7,563,884中阐述了寡核苷酸的药物制剂的详细描述。

本发明的药物组合物可以多种方式给药，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。给药可以是局部(包括眼部和粘膜，包括阴道和直肠递送)，肺部，例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或肠胃外。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔内或肌肉内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内给药。具有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸被认为特别可用于口服给药。

列举的试剂可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂，用于辅助摄取、分布和/或吸收。教导此类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，其每个都通过援引并入本文。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。

本文公开的药物制剂可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与一种或多种药物载体或一种或多种赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并然后如果需要，使产品成型来制备制剂。

用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸或碱调节，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(其中治疗剂是水溶性的)或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.RTM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应是存在容易注射性的程度的流体。它在制造和储存条件下应是稳定的，并且应被保存以防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。

载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以维持适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散情况下维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。对微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，组合物中优选地包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射溶液的制备可以通过将所需量的活性剂与根据需要上面列举的成分之一或组合一起加入到适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性剂加入到包含基本分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分的无菌溶媒(vehicle)中来制备。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其可得到活性成分以及其先前经过无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压缩成片剂。取决于所治疗的具体病症，本文公开的用于治疗动脉粥样硬化或代谢综合征的其他要素的药物组合物可被配制并全身或局部地给药。配制和给药技术可见于“雷明顿:药学的科学与实践”(20.sup.th版，Gennaro(编辑)和Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，2000)。对于口服给药，试剂可以包含在肠溶形式中以在胃中存活或进一步被包被或混合以通过如上所述的已知方法在GI道的特定区域中释放。出于口服治疗给药的目的，活性剂可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。还可以使用流体载体制备口腔组合物以用作漱口水，其中流体载体中的化合物经口施用并且漱口并吐出或吞咽。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分被包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如海藻酸、

对于通过吸入给药，化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器递送，该压力容器或分配器含有合适的推进剂，例如气体，诸如二氧化碳，或从雾化器递送。

全身给药也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜给药的清洁剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可以通过使用鼻用喷雾或栓剂来完成经粘膜给药。对于经皮给药，活性剂被配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

如果合适，还可以将化合物制备成栓剂形式(例如，使用常规栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。

在一种实施方式中，列举的试剂与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals公司商购获得。脂质体悬浮液(包括用例如单克隆抗体靶向特定细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利No.4,522,811中所述。

特别有利的是，将口服或肠胃外组合物配制成单位剂型以易于给药和剂量的均匀性。如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含经计算可产生所需的治疗效果的预定量的活性剂与所需的药物载体联合。单位剂型的规格由活性剂的独特特性和要达到的特定治疗效果，以及复合这种活性剂用于治疗个体的领域中固有的限制决定并直接取决于此。

如前所述，试剂可以通过泵持续给药或在白天持续很长的时间频繁给药。在某些实施方式中，试剂可以约0.3-100ng/小时、优选约1-75ng/小时、更优选约5-50ng/小时、甚至更优选约10-30ng/小时的速率给药。试剂可以约0.1-100pg/小时、优选约1-75微克/小时、更优选约5-50微克/小时、甚至更优选约10-30微克/小时的速率给药。还应理解，用于治疗的抗体、蛋白质或多肽的有效剂量可在特定治疗过程中增加或减少。通过监测生物样品优选血液或血清中的胰岛素水平和/或监测血糖控制，剂量的变化可以得出并变得明显。

在实施方式中，可以使用渗透泵通过皮下、长期、自动药物递送来递送试剂以在期望时间内输注期望剂量的试剂。胰岛素泵随处可见，并且被糖尿病患者使用以在很长的时间内自动递送胰岛素。这类胰岛素泵可适于递送试剂。用于控制葡萄糖耐受不良、1型或2型糖尿病的试剂的递送速率可以在大范围内容易地调整以适应个体不断变化的胰岛素需求(例如，基础速率和推注剂量)。新型泵允许采用周期性计量方式，即液体以小固定体积的周期性离散剂量而非持续流动方式递送。通过控制和调整计量周期来控制和调整装置的总液体递送速率。泵可以与连续血糖监测装置和远程单元相偶联，诸如美国专利No.6,560,471中描述的系统，标题为“分析物监测装置和使用方法(Analyte Monitoring Device andMethods of Use)”。在这样的布置中，控制连续血糖监测装置的手持远程单元可以与血糖监测单元和递送列举的试剂的流体递送装置无线通信并控制两者。

组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，诸如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。组合物也可配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可包含增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。悬浮液还可以含有稳定剂。

实施例

实施例1 Foxo1抑制剂(化合物9)和Notch抑制剂(DBZ)的共同给药

该实验包括对8周龄的小鼠进行手术以植入肠空肠(enterojejujnal)导管，从而将药物局部递送到肠粘膜。经过1周的恢复期后，用单次腹腔注射DBZ或溶媒对照治疗小鼠。Foxo1抑制剂化合物9(Langlet等人，2017Cell，见下文)

在同一天或在第二天开始给药，每天三次，通过肠空肠导管注射3天。在实验结束时，处死小鼠并使用免疫组织化学分析肠道的肠内分泌细胞含量。这些实验的结果在图1-14中提供。图7显示通过初始DBZ治疗和随后的FBT9治疗产生了胰岛素阳性细胞。图10显示肠道中胰岛素阳性细胞的数量比图7的治疗增加～5倍。图10的治疗方案涉及给药第一剂FBT9和DBZ，然后是后续剂量的FBT9。

实施例2在Foxo1敲除小鼠中给药ROCK抑制剂

该实验包括通过经口灌胃给予Y-27632来治疗8周龄小鼠(Foxo1敲除小鼠)，每天一次，持续2天。在第3天，处死小鼠并使用免疫组织化学分析肠道的肠内分泌细胞含量。这些实验的结果在图15-17中提供。图15和16中的箭头代表c-肽和胰岛素阳性细胞，它们类似于真正的β样细胞。图17显示胰岛素阳性细胞的量在没有用ROCK抑制剂治疗的情况下显著减少。

实施例3 Foxo1抑制剂(化合物10，“FBT10”)在小鼠肠道类器官中的给药

来自野生型小鼠的小鼠肠道类器官用FBT10(化合物10，Langlet等人，2017Cell，见下文)治疗。

在治疗72小时后，一些细胞转变成由免疫组织化学证实的胰岛素和血清素(5HT)阳性细胞(见图18)。该数据表明FBT10能够从肠道细胞生成胰岛素阳性细胞。

实施例4 Foxo1抑制剂(FBT10)和Notch抑制剂(DBZ)的共同给药

按照上面在实施例1中使用的方案来测试FBT10和DBZ的组合。该实验包括对8周龄的小鼠进行手术以植入肠空肠导管，从而将药物局部递送到肠粘膜。经过1周的恢复期后，用单次腹腔注射DBZ或溶媒对照治疗小鼠。Foxo1抑制剂化合物10(FBT10)在同一天或第二天开始给药，每天三次，通过肠空肠导管注射3天。在实验结束时，处死小鼠并使用免疫组织化学分析肠道的肠内分泌细胞含量。该实验的结果在图19中提供。关于表示对体重和血糖的影响的图，每条线代表个体动物。在FBT10治疗后十二指肠和结肠中存在胰岛素阳性细胞。在溶媒治疗的十二指肠或结肠中未发现胰岛素阳性细胞。

实施例5在NOD小鼠中给药FBT10。

NOD小鼠(小鼠模型，其胰腺β细胞被免疫反应破坏)用FBT10或溶媒治疗96小时的时间。该实验结果示于图20。从显微照片中可以看出，FBT10在空肠中产生了胰岛素阳性细胞。在结肠中未检测到胰岛素阳性细胞。图20还提供了显示对体重和血糖的影响的图(每条图线代表个体动物)

实施例6

Foxo反义和RNA干扰分子的实例

GCACCGACTTTATGAGCAACC SEQ ID NO:1短发夹RNA(来自BD Biosciences)

FOXO1-反义(TTG GGT CAG GCG GTT CA SEQ ID NO:2)；

FOXO3a-正义(CCC AGC CTA ACC AGG GAA GT SEQ ID NO:3)

FOXO3a-反义(AGC GCC CTG GGT TTG G SEQ ID NO:4)；

FOXO4-正义(CCT GCA CAG CAA GTT CAT CAA SEQ ID NO:5)和

FOXO4-反义(TTC AGC ATC CAC CAA GAG CTT SEQ ID NO:6)

Accell SMARTpool siRNAA-041127-13，

靶序列：CUAUUAUUGUACAUGAUUG FOXO1 SEQ ID NO.7

Accell SMARTpool siRNA A-041127-14,FOXO1

靶序列：CGAUGAUACCUGAUAAUG SEQ ID NO.8

Accell SMARTpool siRNAA-041127-15,FOXO1

靶序列：UCGUAAACCAUUGUAAUUA SEQ ID NO.9

摩尔质量13,489.3(g/mol)

消光系数376,470(L/mol·cm)

Accell SMARTpool siRNA A-041127-16,FOXO1

靶序列：CCAGGAUAAUUGGUUUUAC SEQ ID NO.10

摩尔质量13,519.3(g/mol)

消光系数361,874(L/mol·cm)

R1-02，四个对照各5nmol+递送介质

目录项

K-005000-R1-02

Accell小鼠控制siRNA试剂盒-红

ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-05,FOXO1

靶序列：GGUGUCAGGCUAAGAGUUA SEQ ID NO.11

摩尔质量13,429.9(g/mol)

消光系数371,219(L/mol·cm)

ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-06,FOXO1

摩尔质量13,414.8(g/mol)

消光系数377,004(L/mol·cm)

靶序列：GUAAUGAUGGGCCCUAAUU SEQ ID NO.12

ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-07,FOXO1

摩尔质量13,459.8(g/mol)

消光系数357,691(L/mol·cm)

靶序列：GCAAACGGCUUCGGUCAAC SEQ ID NO.13

ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-041127-08,FOXO1

摩尔质量13,384.9(g/mol)

消光系数384,302(L/mol·cm)

靶序列：GGACAACAACAGUAAAUUU SEQ ID NO.14

用于抑制Foxo1表达的其他基于反义的方法的实例在美国专利No.7229976中提供。

本文通过上述实验和随后的实施例说明了本发明，但不应将其解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、未决专利申请和公开专利的内容特此通过援引明确并入。本领域的技术人员将理解，本发明可以以多种不同的形式实施并且不应被解释为限于在此阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式使得使本公开将本发明充分传达给本领域技术人员。本发明所属领域的技术人员在受益于前述描述中所呈现的教导的情况下将想到本发明的许多修改和其他实施方式。尽管使用了特定术语，但除非另有说明，否则它们按本领域中使用。