阿洛酮糖差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产阿洛酮糖的方法

摘要

本发明提供了一种新型阿洛酮糖差向异构酶变体及其各种用途，其中以丝氨酸(Ser)取代来源于Flavonifractor plautii的野生型D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列第216位的氨基酸残基甘氨酸(Gly)。与来源于Flavonifractor plautii的野生型D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶相比，根据本发明所述的新型阿洛酮糖差向异构酶变体的果糖向阿洛酮糖的转化活性更高，特别是在60℃或更高的高温条件下具有优异的热稳定性，使得酶转化反应在工业级水平进行，用于阿洛酮糖的大规模生产，以防止污染，缩短生产时间，并降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种阿洛酮糖差向异构酶变体等，并且尤其涉及一种阿洛酮糖差向异构酶变体和从中衍生的各种发明，与来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，其具有提高的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-allulose)是果糖的三号位碳的差向异构体，也被称为D-psicose。与糖相比，D-阿洛酮糖的甜度为70％(Oshima 2006)，但只有0.3％的热量，因此它是一种可以作为低卡路里甜味剂应用于疗效食品的功能性单糖(Matsuo et al.2002)。此外，D-阿洛酮糖具有吸收葡萄糖并抑制血糖的功能，因此它可以应用于糖尿病患者食品、保健食品

由于上述特性，阿洛酮糖是很好的替代糖的来源。不过，它属于稀有糖，是自然界中极其稀有的单糖。因此，需要一种高效生产阿洛酮糖的方法来应用于食品工业。传统的阿洛酮糖生产方法主要是通过化学工艺进行。Billik等人提出了利用钼酸盐离子的催化作用将果糖转化为阿洛酮糖的方法。McDonald通过三步化学处理工艺从1,2:4,5-二-δ-异亚丙基-β-D-吡喃果糖生产阿洛酮糖。此外，Doner通过将果糖与乙醇和三甲胺一起加热来生产阿洛酮糖。但是，虽然这些化学生产方法成本很高，但仍然存在效率低并产生大量副产物的缺点。

作为生产阿洛酮糖的生物方法，利用微生物的细胞反应从半乳糖醇、D-塔格糖、D-塔罗糖醇(D-talitol)等生产阿洛酮糖的方法已被提出(Ken Izumori)。但由于底物属于稀有糖，该方法难以应用于工业生产。工业化最有效的方法是在D-酮糖3-差向异构酶群组中寻找能将果糖转化为阿洛酮糖的酶。此前发表的内容包括：将来源于解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H(10)(Mu et al.2011)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(Kim et al.2006)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)(Itoh atal.1994)和球形根瘤菌(Rhizobium sphaeroides)(Zhang et al.2009)的D-塔格糖3-差向异构酶插入大肠杆菌后，利用转化的大肠杆菌中表达的D-塔格糖3-差向异构酶从果糖生产阿洛酮糖。

关于使用酶从果糖生产阿洛酮糖的技术，韩国专利公开号10-0744479公开了使用来源于根癌农杆菌的阿洛酮糖差向异构酶生产阿洛酮糖的方法。此外，韩国专利公开号10-0832339公开了使用中华根瘤菌(Sinorhizobium)YB-58KCTC 10983BP(其具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性)将果糖转化为阿洛酮糖的方法。韩国专利公开号10-1106253公开了包含编码根癌农杆菌C58的阿洛酮糖3-差向异构酶(其具有催化果糖转化为阿洛酮糖的活性)的多核苷酸的大肠杆菌，以及使用该大肠杆菌从果糖生产阿洛酮糖的方法。韩国专利公开号10-1339443公开了来源于属于根瘤菌(Rhizobium)属的微生物的酮糖3-差向异构酶，以及使用该酶将果糖转化为阿洛酮糖的方法。韩国专利公开号10-1318422公开了来源于梭状芽孢杆菌(Clostridium scindens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶从果糖生产阿洛酮糖的方法。韩国专利公开号10-1473918公开了来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶从果糖生产阿洛酮糖的方法。

但是，来源于微生物的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的果糖向阿洛酮糖的转化率不高，并且在最佳活化温度条件下的热稳定性较差，尤其不适合工业化。因此，需要开发新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体，与来源于微生物的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更高的果糖向阿洛酮糖的转化率或热稳定性。关于D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体，韩国专利申请公开号10-2014-0021974公开了来源于Treponema primitia ZAS-1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，它在基因水平上诱导突变，具有快速的阿洛酮糖转化率，并且在高温下具有稳定性。韩国专利公开号10-1203856公开了热稳定性提高的阿洛酮糖差向异构酶变体，它是由来源于根癌农杆菌的野生型阿洛酮糖差向异构酶突变获得的。

发明内容

本发明来源于现有技术的背景，并且本发明的第一目的是提供新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体，与来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，其具有提高的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性。

本发明的第二目的是提供生产新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的方法或提供用于生产新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体所需的各种要素。

本发明的第三目的是提供从果糖生产阿洛酮糖的方法或提供从果糖生产阿洛酮糖所需的各种要素。

本发明的申请人已经申请了专利，并且使用来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶从果糖生产阿洛酮糖的发明已经被注册(参见韩国专利公开号10-1473918(2014.12.11))。在pH值范围为约6.5至7.0并且温度为约62至66℃的条件下，来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶显示出最高的果糖转化为阿洛酮糖的活性。在最佳温度条件下，随着反应时间的延长，酶活性迅速下降。因此，它的利用在大规模生产阿洛酮糖的工业化阶段受到限制。此外，由于大规模生产阿洛酮糖的酶转化反应一般在高温下进行以防止污染，因此需要显著提高热稳定性，从而将来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶应用于工业化。本发明的申请人认识到来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固有问题，利用蛋白质结构预测技术验证当野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列特定位置的氨基酸序列被取代时，果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性得到提高，从而完成了本发明。

为了实现第一目的，本发明提供了由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体。

为了实现第二目的，本发明提供了编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸。进一步，本发明提供了包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体。进一步，本发明提供了重组菌株，该重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。进一步，本发明提供了用于生产阿洛酮糖差向异构酶变体的方法，该方法包括以下步骤：培养重组菌株，该重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化，以表达阿洛酮糖差向异构酶变体，并从表达阿洛酮糖差向异构酶变体的重组菌株的裂解物中分离阿洛酮糖差向异构酶变体。

为了实现第三目的，本发明提供了用于生产阿洛酮糖的组合物，该组合物包括由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体。进一步，本发明提供了用于生产阿洛酮糖的组合物，该组合物包括重组菌株、重组菌株的培养物或重组菌株的裂解物，所述重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。进一步，本发明提供了用于生产阿洛酮糖的方法，该方法包括以下步骤：将果糖与由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体或包含阿洛酮糖差向异构酶变体的组合物反应。进一步，本发明提供了用于生产阿洛酮糖的方法，该方法包括以下步骤：将果糖与重组菌株、重组菌株的培养物、重组菌株的裂解物或包含其中任何一个或更多个的组合物反应，该重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。

与来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，根据本发明所述的新型阿洛酮糖差向异构酶变体的果糖向阿洛酮糖的转化活性更高，特别是在60℃或更高的高温条件下具有优异的热稳定性，使得酶转化反应在工业级水平进行，用于阿洛酮糖的大规模生产，以防止污染，缩短生产时间，并降低生产成本。

附图说明

图1显示了本发明的发明人为了提高来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性而选择的作为候选者用于取代的总共五个氨基酸残基的位置。

具体实施方式

下面对本发明进行详细描述。

本发明的一个方面涉及能够将果糖转化为阿洛酮糖的新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体(以下简称“阿洛酮糖差向异构酶变体”)。阿洛酮糖差向异构酶变体是来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列第216位的氨基酸残基甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)取代，并且与野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有很高的果糖向阿洛酮糖的转化活性，特别是在60℃或更高的高温条件下具有优异的热稳定性。阿洛酮糖差向异构酶变体可以通过一种方法获得，其中将编码来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸(由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成)作为模板，用具有预先确定的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物对进行PCR，然后，用成对的扩增的变体片段作为模板并且用引入限制性内切酶识别位点序列的寡核苷酸作为引物进行重叠延伸PCR，然后将编码阿洛酮糖差向异构酶变体的氨基酸序列的多核苷酸片段插入到表达载体中以制备重组表达载体，然后用重组表达载体转化宿主菌株以制备重组菌株，然后培养并表达重组菌株。根据本发明所述的阿洛酮糖差向异构酶变体由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成，但根据本发明所述的阿洛酮糖差向异构酶变体的等同范围不限于此。例如，只要果糖转化为阿洛酮糖的活性和在60℃或更高的高温下的热稳定性保持不变，SEQ ID NO：5所示的某些氨基酸就可以被取代、插入和/或删除。优选通过保守氨基酸替换进行氨基酸取代，其不改变蛋白质的性质。此外，可以通过糖基化、乙酰化、磷酸化等进行氨基酸的修饰。此外，根据本发明所述的阿洛酮糖差向异构酶变体的等同范围包括由于氨基酸序列的突变或修饰而使得耐热、pH等结构稳定性增加或果糖转化为阿洛酮糖的活性增加的蛋白质。此外，根据本发明所述的阿洛酮糖差向异构酶变体的等同范围可以包括与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及用于生产新型阿洛酮糖差向异构酶变体的方法或生产新型阿洛酮糖差向异构酶变体所需的各种要素。生产新型阿洛酮糖差向异构酶变体所需的各种要素包括多核苷酸、引物对、重组载体、重组菌株等。

所述多核苷酸是编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸，并且优选由SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列组成。本文使用的术语“多核苷酸”是指所有未修饰的或修饰的多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脱氧核糖核苷酸(DNA)。多核苷酸包括单链或双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链或双链RNA、单链和双链区域混合的RNA或其杂交分子，但不限于此。此外，编码阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的等同范围包括与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列具有实质同源性(substantialhomology)的序列。实质同源性是通过比对SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列与任何其它序列以便尽可能多地对应并分析序列来确定的，并且是指任何上述其它序列与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列具有70％或更高、90％或更高、或98％或更高的序列同源性。本领域普通技术人员容易理解，可以使用本领域已知的基因重组技术等，通过取代、添加、或删除多核苷酸的核苷酸序列的一个或更多个碱基，来制备编码在具有实质同源性的范围内具有相同活性的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸。可以通过使用市售的计算机程序以百分比(％)计算两个或更多个序列之间的同源性来进行这种同源性比较。

进一步，引物对用于合成编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸，并且优选由具有以下核苷酸序列的正向引物和反向引物组成。

*正向引物序列(5’→3’)

GCTGGGGCATTTCCACGTGAGCGAGAACAACCGCCGCCCCG

*反向引物序列(5’→3’)

CGGGGCGGCGGTTGTTCTCGCTCACGTGGAAATGCCCCAGC

进一步，重组载体包括编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸。重组载体可以以将编码阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸通过已知的标准方法插入到克隆载体或表达载体中的方式提供。本发明中使用的术语“克隆载体”被定义为能够将DNA片段携带并复制到宿主细胞中的物质。在本发明中，克隆载体可以进一步包括多聚腺苷化信号、转录终止序列和多个克隆位点。在这种情况下，多个克隆位点包括至少一个核酸内切酶限制性酶切位点。此外，克隆载体可以进一步包括启动子。例如，在本发明中，编码阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸可以位于多聚腺苷化信号和转录终止序列的上游。此外，本发明中使用的术语“表达载体”被定义为在合适宿主中转录和翻译克隆的DNA所需的DNA序列。进一步，本发明中使用的术语“表达载体”是指包含与插入序列可操作地连接的必需调节元件的基因构建体，使得如果它存在于个体的细胞中则该插入序列被表达。可以用标准重组DNA技术产生和纯化表达载体。表达载体的种类没有特别限制，只要它具有在原核和真核细胞等各种宿主细胞中表达期望基因并制备期望蛋白质的功能。但它优选是能够以类似于自然状态的形式产生大量外源蛋白的载体，同时具有表现出强活性和强表达能力的启动子。表达载体优选至少包含启动子、起始密码子、编码期望蛋白的基因和终止密码子。此外，它可以适当地包括编码信号肽、另外的表达控制序列、期望基因5’和3’端的非翻译区、选择标记区域、复制单元等的DNA。术语“启动子”是指足以启动转录的最小序列。进一步，启动子可以包括足以表达细胞类型特异性的或由外部信号或试剂诱导的依赖于可调节启动子的基因的启动子结构，这些结构可以位于基因的5’或3’部分。这些启动子包括保守型启动子和诱导型启动子。启动子序列可以来源于原核生物、真核生物或病毒。本文使用的术语“可操作地连接”是指通过多核苷酸序列缔合在单个多核苷酸上使得一个功能受另一个调控。例如，如果启动子能够调节编码序列的表达(即，编码序列受启动子的转录调节)，那么启动子与编码序列连接并可操作，或者，如果核糖体结合位点的位置便于翻译，那么核糖体结合位点与编码序列连接并可操作。编码序列可以通过以正义或反义方向与调节序列连接来操作。根据本发明的重组载体优选为表达载体。

进一步，重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。本文使用的术语“重组菌株”是指将编码一种或更多种靶蛋白的多核苷酸或具有该多核苷酸的表达载体引入宿主细胞而转化的细胞。将表达载体引入宿主细胞制备转化子的方法包括瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、电注射、化学处理方法(如PEG)、使用基因枪的方法、热休克方法等，但不限于此。可以用本发明中的表达载体转化的宿主细胞不是大大受限，只要它们是本领域已知的，例如原核细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞，并且优选是具有高DNA引入效率和对引入的DNA具有高表达效率的宿主。例如，宿主细胞可以是大肠杆菌。大肠杆菌可以包括BL21、JM109、K-12、LE392、RR1、DH5α、W3110等，但不限于此。此外，宿主细胞可以是选自由以下组成的组的菌株：芽孢杆菌(Bacillus)菌株(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))、棒状杆菌(Coryne bacterial)菌株(如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))、沙门氏菌(Salmonella)菌株(如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium))、其它粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、和肠杆菌(Enterobacteriaceae)菌株(如各种假单胞菌(Pseudomonas))。

进一步，用于生产阿洛酮糖差向异构酶变体的方法包括以下步骤：培养重组菌株以表达阿洛酮糖差向异构酶变体，所述重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化，或者用包括编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化；从表达阿洛酮糖差向异构酶变体的重组菌株的裂解物中分离阿洛酮糖差向异构酶。可以利用乳糖、异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导因子诱导宿主细胞表达蛋白质，并且可以调节诱导时间使得蛋白量最大化。在本发明中，可以从重组菌株的裂解物中回收阿洛酮糖差向异构酶变体。蛋白质表达所用的细胞可以通过各种物理或化学手段裂解，如反复冻融、超声、机械破碎或细胞裂解剂，并可通过常规生化分离技术分离或纯化(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989；Deuscher,M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology,Vol.182.Academic Press.Inc.,San Diego,CA,1990)。例如，分离和纯化宿主细胞表达的蛋白质的方法包括电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱法(离子交换层析、亲和层析、免疫吸附亲和色谱、反相高效液相色谱和凝胶渗透高效液相色谱)、等电聚焦电泳以及各种改良的或复合的方法，但不限于此。同时，在本发明中，优选地可以通过使用肽标签的亲和层析从重组菌株的裂解物中分离出阿洛酮糖差向异构酶。作为肽标签，可以使用各种已知的标签，如HA标签、FLAG标签、His标签、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、原癌基因(c-myc)标签、V5标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)，在它们当中，优选使用His标签。His标记的蛋白质被特异性捕获在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂柱上，并且可以通过EDTA或咪唑被释放。

本发明的又另一个方面涉及从果糖生产阿洛酮糖的方法或从果糖生产阿洛酮糖所需的各种要素。作为从果糖生产阿洛酮糖所需的各种要素，涉及用于生产阿洛酮糖的组合物。

用于生产阿洛酮糖的组合物的实例包括由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体。进一步，用于生产阿洛酮糖的组合物的另一个实例包括重组菌株、重组菌株的培养物或重组菌株的裂解物，该重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化或者用包括编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。在这种情况下，优选地，用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包括一种或更多种选自由锰离子、镍离子和钴离子组成的组，并且更优选地，可以进一步包括镍离子或钴离子。根据本发明的新型阿洛酮糖差向异构酶变体具有金属酶特性，其中由金属离子调节其活化，并且在存在特定金属离子(如镍离子和钴离子)的条件下进行酶反应，以提高阿洛酮糖的生产产量。

进一步，从果糖生产阿洛酮糖的方法的实例包括将果糖与包含重组菌株的组合物、重组菌株的培养物、重组菌株的裂解物或包含其中一种或更多种的组合物反应，该重组菌株用编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸转化或者用包含编码由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶变体的多核苷酸的重组载体转化。进一步，从果糖生产阿洛酮糖的方法可以另外包括加入金属离子，金属离子的种类如上所述。作为实例，可以将金属离子加入到作为底物的果糖中，或加入到酶变体和果糖的混合物中。进一步，作为另一个实例，可以将金属离子加入到固定有酶变体的载体中(在加入果糖之前)，加入到固定有酶变体的载体和果糖的混合物中(在加入果糖之后)，或者在加入果糖时以和果糖的混合物的形式加入。在使用重组菌株的情况下，可以在培养物中加入金属离子或者在添加有金属离子的培养基中进行培养。进一步，在从果糖生产阿洛酮糖的方法中，优选将阿洛酮糖差向异构酶变体或重组菌株固定化在载体中。载体可以建立一种环境，在其中可以长时间保持固定化酶的活性，并且载体可以选自所有已知的可用于酶固定化的载体。例如，海藻酸钠可以用作载体。海藻酸钠是藻类细胞壁中含量丰富的天然胶质多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid)组成。在其组成上，海藻酸钠通过随机形成β-1,4键而形成，并且菌株或酶被稳定地固定化，因此它对于获得优异的阿洛酮糖产量来说是有益的。作为实例，为了进一步提高阿洛酮糖的产量，浓度为1.5-4.0％(w/v)的海藻酸钠溶液(例如海藻酸钠水溶液)，优选浓度为大约2.5％(w/v)的海藻酸钠溶液可用于固定重组菌株。进一步，在从果糖生产阿洛酮糖的方法中，当考虑酶变体的稳定性和最大活性时，反应温度在60℃至70℃，优选60℃至67℃，更优选62℃至65℃的范围内，并且反应pH值在6.5至8，优选6.5至7.5，更优选6.5至7的范围内。进一步，在从果糖生产阿洛酮糖的方法中，果糖的浓度并不特别限于此，但考虑到生产率和经济性时，优选是按全部反应物计1％至75％(w/w)，更优选为4至35％(w/w)。进一步，在从果糖生产阿洛酮糖的方法中，所使用的酶变体的浓度可以是按全部反应物计0.001mg/ml至0.1mg/ml，优选为0.01mg/ml至0.1mg/ml，更优选为0.02mg/ml至0.05mg/ml。进一步，在使用重组菌株从果糖生产阿洛酮糖的情况下，重组菌株的宿主菌株优选是细胞学上安全的菌株。细胞学上安全的菌株是指公认安全(generally accepted as safe,GRAS)的一类菌株，它被公认是安全的，例如可以选自酵母菌属(Saccharomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株等。这些菌株是工业微生物，其生产在饲料、药品等领域有各种用途的化学物质。这些菌株具有易于基因操作和大规模培养的菌株特性，并且在各种处理条件下都具有较高的稳定性。进一步，与其它细菌相比，这些菌株具有相对坚实的细胞膜结构，因而具有这样的生物学特性：即使在由高糖浓度等引起的高渗透压下，这些菌株也能以稳定状态存在。公认安全(GRAS)的这类菌株的具体实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。

下面，将通过实施例对本发明做更详细的描述。但是，下述实施例仅仅旨在清楚说明本发明的技术特征，并不限制本发明的保护范围。

实施例1：寻找提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的转化率和热稳定性的氨基酸取代位置

为了提高来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性，基于蛋白质结构预测选择氨基酸取代位置。在本发明的申请人之前提交并注册的韩国注册专利号10-1473918(2014.12.11)中公开了来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(或D-psicose 3-epimerase)。来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，在中性pH值条件下具有将果糖转化为阿洛酮糖的最大活性，并且能够在短时间内以高产率从果糖大规模生产阿洛酮糖，但有一个问题在于，当在高温条件下进行酶反应以防止污染等时，活性迅速下降。为了提高来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性，本发明的发明人基于来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列，利用同源建模技术预测了蛋白质结构，以寻找氨基酸取代位置。利用Robetta服务器进行同源性建模，利用软件程序例如Coot、PyMol和UCSF Chimera进行蛋白质结构预测和分析。对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的三维结构模型进行分析，选择总共5个氨基酸残基位置，当化学键改变并且氨基酸残基在该位置被取代时，这5个氨基酸残基预期与提高转化率和热稳定性相关。图1显示了本发明的发明人为了提高果糖向阿洛酮糖的转化率和来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性而选择的作为候选者用于取代的总共五个氨基酸残基的位置。在图1中，“I21”表示异亮氨酸(Ile)出现在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置21处，“A82”表示丙氨酸(Ala)出现在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置82处，“L133”表示亮氨酸(Leu)出现在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置133处，“G216”表示甘氨酸(Gly)出现在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置216处，而“A276”表示丙氨酸(Ala)出现在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置276处。此外，如下文所述，通过用半胱氨酸(Cys)取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置21处出现的异亮氨酸(Ile)，制备了由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的酶变体I21C。通过用精氨酸(Arg)取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置82处出现的丙氨酸(Ala)，制备了由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的酶变体A82R。通过用天冬氨酸(Asp)取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置133处出现的亮氨酸(Leu)，制备了由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的酶变体L133D。通过用丝氨酸(Ser)取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置216处出现的甘氨酸(Gly)，制备了由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的酶变体G216S。通过用精氨酸(Arg)取代SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的位置276处出现的丙氨酸(Ala)，制备了由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的酶变体A276R。

实施例2：过表达来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组载体和重组菌株的制备

基于来源于Flavonifractor plautii的阿洛酮糖差向异构酶的野生型多核苷酸，使用重叠延伸聚合酶链式反应法产生编码5个酶变体(I21C、A82R、L133D、G216S和A276R)的氨基酸序列的多核苷酸片段。

首先，利用如下表1所示的引物进行PCR反应，来制备编码来源于Flavonifractorplautii的阿洛酮糖差向异构酶变体的基因。具体地，1pM表1中的寡核苷酸作为引物，100ng的来源于Flavonifractor plautii的阿洛酮糖差向异构酶变体的野生型多核苷酸(SEQ IDNO：7)用作模板，将这两者混合到加入了100μM的脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的反应溶液中。利用Thermocycler(TP600，TAKARA生物公司，日本)在1单位的pfu-X DNA聚合酶混合物(Binoneer)的存在下进行25个循环至30个循环来进行PCR反应。

表1

通过引物组合扩增变体片段后，使用每一对作为模板并使用引入了NdeI和XhoI限制性内切酶识别位点序列的寡核苷酸作为引物进行重叠延伸PCR，以最终产生编码5个酶变体(I21C、A82R、L133D、G216S和A276R)的氨基酸序列的多核苷酸片段。下表2显示了用于引入限制性内切酶识别位点序列的引物的核苷酸序列。

表2

SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列表示编码酶变体I21C的氨基酸序列的多核苷酸片段，SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列表示编码酶变体A82R的氨基酸序列的多核苷酸片段，SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列表示编码酶变体L133D的氨基酸序列的多核苷酸片段，SEQID NO：11所示的核苷酸序列表示编码酶变体G216S的氨基酸序列的多核苷酸片段，SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列表示编码酶变体A276R的氨基酸序列的多核苷酸片段。SEQ ID NO：8至12的核苷酸序列由与酶变体的氨基酸序列直接对应的核苷酸序列组成，并且为了方便排除限制性内切酶识别位点的序列。

然后用限制性内切酶NdeI和XhoI将制备的多核苷酸片段插入表达载体pET28a(Novagen)的同一限制性内切酶位点，以制备5种重组表达载体。另外，利用热休克法(见Sambrook and Russell:Molecular Cloning.)将重组表达载体引入大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中进行转化，从而获得5种重组大肠杆菌。向获得的重组大肠杆菌中加入60％的甘油溶液，并且在培养用于酶表达之前在-70℃冷冻保存。

实施例3：来源于Flavonifractor plautii的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的表达和纯化

将实施例2中制备的1ml重组大肠杆菌接种到包含150ml蛋白表达培养基的1L摇瓶中，所述培养基具有下表3的成分(基于1L培养基)，并且用振荡培养箱在32℃下培养24小时同时保持32℃和140rpm的振荡条件。在培养基中包含1％乳糖以诱导阿洛酮糖差向异构酶变体的过表达。

表3

然后，通过以下方法分离过表达的阿洛酮糖差向异构酶变体。首先，将重组大肠杆菌的培养液在4100×g和4℃下离心约15分钟以去除上清，并回收重组大肠杆菌的菌株细胞。然后，将回收的重组大肠杆菌细胞的菌株细胞悬浮在裂解缓冲液(含有50mM磷酸二氢钾、300mM氯化钾和5mM咪唑)中，并用超声破碎仪(sonicator)处理以使细胞破裂。随后，将细胞裂解物在15,814×g和4℃下离心约10分钟以去除细胞碎片，仅回收上清液。然后，使用组氨酸标签(His-tag)亲和层析柱和脱盐柱从回收的上清液中分离出含有阿洛酮糖差向异构酶变体的纯化的酶液。

实施例4：D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性的验证

为验证来源于Flavonifractor plautii的阿洛酮糖差向异构酶的野生型和变体的果糖向阿洛酮糖的转化率和热稳定性，将酶暴露在高温下一段时间，然后分析果糖向阿洛酮糖的转化活性降低的程度。具体地，将实施例3中得到的纯化的酶溶液(酶浓度为1mg/ml)在62℃恒温水浴中储存并加热0小时、1小时和2小时。然后，将热处理后纯化的酶溶液加入含有4％(w/w)果糖和1mM硫酸镍(NiSO

下表4显示了来源于Flavonifractor plautii的阿洛酮糖差向异构酶的野生型和变体在热处理时根据热处理条件的果糖向阿洛酮糖的转化率。

表4

如上述表4中所示，在来源于Flavonifractor plautii的阿洛酮糖差向异构酶变体中，I21C、A82R和L133D的果糖向阿洛酮糖的转化活性不论是否热处理均低于来源于Flavonifractor plautii的野生型的阿洛酮糖差向异构酶。此外，与野生型的阿洛酮糖差向异构酶相比，阿洛酮糖差向异构酶变体A276R未经过热处理时果糖向阿洛酮糖的转化活性略高，但经过热处理后果糖向阿洛酮糖的转化活性显著降低。同时，与野生型的阿洛酮糖差向异构酶相比，阿洛酮糖差向异构酶变体G216S不论是否热处理均显示出更高的果糖向阿洛酮糖的转化活性，特别是热稳定性显著提高。

如上所述，本发明已通过上述实施例进行了描述，但本发明并不一定限于此，可以在不偏离本发明的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本发明的保护范围应解释为包括落入本发明所附权利要求范围内的所有实施例。

序列表

<110> 大象(株)

<120> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产D-阿洛酮糖的方法

<130> ZPCT-20-0110

<150> KR 10-2019-0170993

<151> 2019-12-19

<160> 12

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 294

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶

<400> 1

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体I21C

<400> 2

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Cys Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 3

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体A82R

<400> 3

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Arg Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 4

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体L133D

<400> 4

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Asp Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 5

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体G216S

<400> 5

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Ser Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 6

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体A276R

<400> 6

Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe

20 25 30

Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu

85 90 95

Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala

100 105 110

Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg

115 120 125

Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val

130 135 140

Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys

165 170 175

Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro

195 200 205

Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly

245 250 255

Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly

260 265 270

Ala Gly Glu Arg Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe

275 280 285

Leu Lys Glu Leu Thr Ala

290

<210> 7

<211> 882

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 编码来源于Flavonifractor plautii的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸

<400> 7

atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60

atacccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120

gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180

ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240

ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300

gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360

ggaatcaccc tggacgagaa gcgccgcaag gaggagcttg ccctggagtc catgtcccgg 420

ctcatgaagg tggcggagga ctgcggcgtg ctctactgct gcgaggtggt caaccgcttc 480

gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540

cccaacgccc gggtgctgct ggataccttc cacatgaaca tcgaggagga cagcatggtg 600

gacgccattc tggaggcggg cccctggctg gggcatttcc acgtggggga gaacaaccgc 660

cgccccgccg gctccaccaa ccgcctgccc tggaaggaca tggccgccgc cctcaagcag 720

gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780

tatgatatca aggtctggcg ggatctcagc ggcggggccg gggaggccgg gctggacgag 840

atggcgggcc gggcctgccg gttcctcaag gagctgaccg cg 882

<210> 8

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体I21C的多核苷酸

<400> 8

atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60

tgccccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120

gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180

ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240

ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300

gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360

ggaatcaccc tggacgagaa gcgccgcaag gaggagcttg ccctggagtc catgtcccgg 420

ctcatgaagg tggcggagga ctgcggcgtg ctctactgct gcgaggtggt caaccgcttc 480

gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540

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gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780

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<210> 9

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体A82R的多核苷酸

<400> 9

atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60

atacccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120

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<210> 10

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体L133D的多核苷酸

<400> 10

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<210> 11

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体G216S的多核苷酸

<400> 11

atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60

atacccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120

gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180

ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240

ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300

gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360

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gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540

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gacgccattc tggaggcggg cccctggctg gggcatttcc acgtgagcga gaacaaccgc 660

cgccccgccg gctccaccaa ccgcctgccc tggaaggaca tggccgccgc cctcaagcag 720

gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780

tatgatatca aggtctggcg ggatctcagc ggcggggccg gggaggccgg gctggacgag 840

atggcgggcc gggcctgccg gttcctcaag gagctgaccg cg 882

<210> 12

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体A276R的多核苷酸

<400> 12

atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60

atacccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120

gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180

ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240

ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300

gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360

ggaatcaccc tggacgagaa gcgccgcaag gaggagcttg ccctggagtc catgtcccgg 420

ctcatgaagg tggcggagga ctgcggcgtg ctctactgct gcgaggtggt caaccgcttc 480

gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540

cccaacgccc gggtgctgct ggataccttc cacatgaaca tcgaggagga cagcatggtg 600

gacgccattc tggaggcggg cccctggctg gggcatttcc acgtggggga gaacaaccgc 660

cgccccgccg gctccaccaa ccgcctgccc tggaaggaca tggccgccgc cctcaagcag 720

gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780

tatgatatca aggtctggcg ggatctcagc ggcggggccg gggagcgcgg gctggacgag 840

atggcgggcc gggcctgccg gttcctcaag gagctgaccg cg 882