一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物

摘要

本发明提供一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物，属于微生物制剂领域，包括复合培养基、益生菌活菌与载体，所述益生菌活菌包括乳杆菌和/或双歧杆菌；其制备方法是以第一培养基对乳杆菌和/或双歧杆菌进行活化并扩大培养，再将培养后的菌种接种到第二培养基中发酵培养得到发酵液，加入冻干保护剂和载体后再冷冻干燥制得；其中，所述第二培养基包括所述第一培养基和大豆多肽粉；本发明通过前期培养并直接冻干以最大程度保留菌种的活力，同时引入多种活性物质于载体之上，使其可以快速刺激免疫系统维持微生态平衡，减少用药时间，提高用药效率。

说明书

技术领域

本发明涉及功能性微生物制剂领域，具体涉及一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物。

背景技术

女性妇科炎症的范畴较广，一般地，女性的生殖器官，包括外阴、前庭大腺、阴道、宫颈、子宫体、输卵管、卵巢及盆腔腹膜等受到各种致病菌侵感染后发生的炎症，统称女性妇科炎症或生殖道感染；现有研究表明，妇科炎症的发生与阴道菌群失调有关，特别是与阴道有益菌的改变有关，因此，恢复阴道菌群环境、重建微生态环境是治疗该疾病的关键方向。

抗生素的使用对女性妇科炎症的控制具有积极作用，但由抗生素的大量使用导致的耐药性不容忽视，且抗生素在抑制致病菌的同时破坏了阴道正常菌群，现有技术也有通过引入外源益生菌重建微生态环境的方法，但用药时间长，疗效不够稳定持久，复发率较高。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物，所述益生菌复合物包括复合培养基、益生菌活菌与载体，所述益生菌活菌包括乳杆菌和/或双歧杆菌；

所述益生菌复合物的制备方法为：

以第一培养基对乳杆菌和/或双歧杆菌进行活化并扩大培养，再将培养后的菌种接种到第二培养基中，发酵培养12-16h，得到发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得所述益生菌复合物；其中，

所述第一培养基的组成为大豆蛋白胨、牛肉蛋白粉、酵母膏、醋酸钠、葡萄糖、吐温80、柠檬酸铵、硫酸镁和水；

所述第二培养基包括所述第一培养基和大豆多肽粉。

优选的，所述乳杆菌为卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌、唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的至少一种。

优选的，所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述发酵液质量的0.1-1％。

优选的，所述大豆多肽粉的制备方法为：

s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80-90℃保温5-30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；

s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/L、pH为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆蛋白粉的含水率提高到50-60％，再在120℃下加热10-20min灭菌，得到培养基；将活化好的黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于10

s3、称取3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在DMSO或DMF中，配制为质量分数10％的溶液，制得溶液A；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在DMSO或DMF中，得到悬液A，在室温和搅拌条件下，将所述悬液A缓慢滴加到等体积的所述溶液A中，添加完毕后继续搅拌反应24-28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以DMF、二氯甲烷和冷的乙醚洗涤后冻干制得。

优选的，所述载体为改性蒙脱石。

优选的，所述改性蒙脱石的制备方法为：

将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500-1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料液比1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液B，加入所述悬液B体积1-2％的3-(三乙氧基硅基)丙基琥珀酸酐或3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在60-70℃下搅拌回流12-24h，回流完成后滤出沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得。

进一步优选的，所述改性蒙脱石的制备方法还包括以下步骤：

(1)烯丙基改性6-氨基嘌呤制备

称取溴乙醇，在冰水浴条件下溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺和甲基丙烯酰氯，在室温条件下搅拌反应12-14h，反应完成后分离滤液，所述滤液依次经冰水洗涤、无水硫酸镁干燥后蒸去二氯甲烷，得到酯化产物；称取6-氨基嘌呤和氢化钠并溶解在无水DMF中，充分搅拌均匀后，加入所述酯化产物，在室温条件下搅拌反应12-14h，反应完成后分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥；其中，

所述溴乙醇与所述二氯甲烷、所述三乙胺、所述甲基丙烯酰氯的质量比例为1：(6-7)：(0.1-0.15)：(0.9-0.95)；所述6-氨基嘌呤与所述氢化钠、所述无水DMF、所述酯化产物的质量比例为1：(0.2-0.22)：(10-12)：(2.4-2.5)；

(2)共聚产物制备

称取所述烯丙基改性6-氨基嘌呤和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯并溶解在无水DMSO中，充分溶解后加入引发剂，经氮吹除氧后封闭反应体系，将反应体系置于70-75℃下恒温反应3-4d，反应完成后冷却，分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥制得共聚产物；其中，

所述烯丙基改性6-氨基嘌呤与所述磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、所述无水DMSO、所述引发剂的质量比例为1：(1.0-1.1)：(50-100)：(0.07-0.09)；

(3)包覆产物制备

称取所述共聚产物并溶解在热的蒸馏水中，加入经乙醇和蒸馏水洗涤后制得的沉淀，充分分散后边搅拌边滴加与所述蒸馏水等体积的丙酮，过滤，滤饼真空干燥后制得，其中，

所述共聚产物与所述沉淀、所述蒸馏水的质量比例为1：1：1000。

本发明的另一目的在于提供一种前述益生菌复合物的应用方法，具体是：所述益生菌复合物包覆于膨胀载体表面；

优选的，所述膨胀载体为棉条、无纺布或弹性纤维。

本发明的有益效果为：

(1)相比现有技术以抗生素或广谱抗菌剂进行杀菌的方式相比，本申请通过外源性的补充具有优势地位的乳杆菌等益生菌，形成优势菌群，可以同时通过竞争粘附机制阻止致病微生物粘附于阴道上皮细胞，抑制多种病原微生物的生长，并刺激免疫系统维持阴道微生态平衡，从而达到治疗炎症性妇科疾病的效果。

(2)本发明通过先对益生菌进行高密度的前期培养，直接冻干后可以最大程度保留菌种的活力，同时可以与培养基、益生菌代谢产物以及细菌细胞素或类细胞素等活性物质一同负载于载体之上，使得冻干后的益生菌在使用环境中可以很快活化并继续生长，快速刺激免疫系统维持微生态平衡，减少用药时间，提高用药效率；所述冻干保护剂不仅保护益生菌菌体的冻干活力，本发明所述冻干保护剂还添加有低聚木糖，可通过释放而增加有益的乳杆菌的丰度，促进生长。

(3)本发明以大豆为底物，以黑曲霉为发酵菌发酵制备了大豆多肽粉，一方面，大豆多肽粉作为培养基组分，为益生菌活菌提供氨基酸源，另一方面可以作为益生菌活菌的发酵促进剂，提高活化速度，通过氨基N末端偶联硫代异氰酸酯提高多肽粉的疏水性，提高与菌体的亲和性及其利用度，同时提高稳定性。

(4)蒙脱石不仅作为菌种载体，其还对乳杆菌形成的生物膜具有支持作用，可以促进包括乳杆菌在内的益生菌在粘膜上的定植，促进益生菌种群的快速生长，同时抑制致病菌活性；本发明还以具有良好生物亲和性的6-氨基嘌呤和超亲水性的磺酸甜菜碱两性表面活性剂为单体，通过烯丙基单体的引发共聚制备得到具有两亲性的类膜聚合物载体，用作包覆载体，可实现在温度和酸性pH环境下释放负载以降低外界环境因素对负载菌种的活性影响，进一步提高稳定性。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步描述，本发明所用菌种均为商业菌种。

实施例1

一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物，所述益生菌复合物包括复合培养基、益生菌活菌与载体，所述益生菌活菌包括乳杆菌和双歧杆菌；

所述益生菌复合物的制备方法为：

以第一培养基对乳杆菌和双歧杆菌进行活化并扩大培养，再将培养后的菌种接种到第二培养基中，发酵培养12-16h，得到发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得所述益生菌复合物；其中，

按质量份数计，所述第一培养基的组成为：大豆蛋白胨10份、牛肉蛋白粉10份、酵母膏5份、醋酸钠5份、葡萄糖20份、吐温800.1份、柠檬酸铵2份、硫酸镁0.58份、水1000份；

所述第二培养基在所述第一培养基的组成基础上还包括大豆多肽粉12份；

所述乳杆菌包括卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌；

所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述发酵液质量的1％。

所述大豆多肽粉的制备方法为：

s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80-90℃保温5-30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；

s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/L、pH为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆蛋白粉的含水率提高到50-60％，再在120℃下加热10-20min灭菌，得到培养基；将活化好的黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于10

s3、称取3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在DMSO或DMF中，配制为质量分数10％的溶液，制得溶液A；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在DMSO或DMF中，得到悬液A，在室温和搅拌条件下，将所述悬液A缓慢滴加到等体积的所述溶液A中，添加完毕后继续搅拌反应24-28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以DMF、二氯甲烷和冷的乙醚洗涤后冻干制得；

所述载体为蒙脱石微粉。

实施例2

一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物，所述益生菌复合物包括复合培养基、益生菌活菌与载体，所述益生菌活菌包括乳杆菌和双歧杆菌；

所述益生菌复合物的制备方法为：

以第一培养基对乳杆菌和双歧杆菌进行活化并扩大培养，再将培养后的菌种接种到第二培养基中，发酵培养12-16h，得到发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得所述益生菌复合物；其中，

按质量份数计，所述第一培养基的组成为：大豆蛋白胨10份、牛肉蛋白粉10份、酵母膏5份、醋酸钠5份、葡萄糖20份、吐温800.1份、柠檬酸铵2份、硫酸镁0.58份、水1000份；

所述第二培养基在所述第一培养基的组成基础上还包括大豆多肽粉12份；

所述乳杆菌包括卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌；

所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述发酵液质量的1％。

所述大豆多肽粉的制备方法为：

s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80-90℃保温5-30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；

s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/L、pH为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆蛋白粉的含水率提高到50-60％，再在120℃下加热10-20min灭菌，得到培养基；将活化好的黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于10

s3、称取3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在DMSO或DMF中，配制为质量分数10％的溶液，制得溶液A；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在DMSO或DMF中，得到悬液A，在室温和搅拌条件下，将所述悬液A缓慢滴加到等体积的所述溶液A中，添加完毕后继续搅拌反应24-28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以DMF、二氯甲烷和冷的乙醚洗涤后冻干制得；

所述载体为述改性蒙脱石，所述改性蒙脱石的制备方法为：

将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500-1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料液比1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液B，加入所述悬液B体积1％的3-(三乙氧基硅基)丙基琥珀酸酐或加入所述悬液B体积1.6％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在60-70℃下搅拌回流12-24h，回流完成后滤出沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得。

实施例3

一种治疗炎症性妇科疾病的益生菌复合物，所述益生菌复合物包括复合培养基、益生菌活菌与载体，所述益生菌活菌包括乳杆菌和双歧杆菌；

所述益生菌复合物的制备方法为：

以第一培养基对乳杆菌和双歧杆菌进行活化并扩大培养，再将培养后的菌种接种到第二培养基中，发酵培养12-16h，得到发酵液，加入冻干保护剂，混合均匀后再加入所述载体，所述载体经浸泡后滤出，冷冻干燥制得所述益生菌复合物；其中，

按质量份数计，所述第一培养基的组成为：大豆蛋白胨10份、牛肉蛋白粉10份、酵母膏5份、醋酸钠5份、葡萄糖20份、吐温800.1份、柠檬酸铵2份、硫酸镁0.58份、水1000份；

所述第二培养基在所述第一培养基的组成基础上还包括大豆多肽粉12份；

所述乳杆菌包括卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌；

所述冻干保护剂为甘油和低聚木糖，添加量分别为所述发酵液质量的1％。

所述大豆多肽粉的制备方法为：

s1、将经过清洗的大豆破碎粉磨，制得大豆匀浆，将所述大豆匀浆升温至80-90℃保温5-30min，经高速冷冻离心后除去上层油层，干燥后制得大豆蛋白粉；

s2、在所述大豆蛋白粉中滴加浓度为0.2mol/L、pH为7.5的磷酸盐缓冲液，使所述大豆蛋白粉的含水率提高到50-60％，再在120℃下加热10-20min灭菌，得到培养基；将活化好的黑曲霉菌液接种至所述培养基中，所述黑曲霉菌液的浓度不小于10

s3、称取3-(二乙基氨基)丙基硫代异氰酸酯并溶解在DMSO或DMF中，配制为质量分数10％的溶液，制得溶液A；将所述多肽粉以料液比1g/100ml超声分散在DMSO或DMF中，得到悬液A，在室温和搅拌条件下，将所述悬液A缓慢滴加到等体积的所述溶液A中，添加完毕后继续搅拌反应24-28h，反应完成后分离沉淀，沉淀依次以DMF、二氯甲烷和冷的乙醚洗涤后冻干制得；

所述载体为述改性蒙脱石，所述改性蒙脱石的制备方法为：

(1)将蒙脱石粉碎并筛分，得到粒径在500-1000筛目之间的微粉，将蒙脱石微粉按料液比1g/100ml悬浮分散在蒸馏水中，得到悬液B，加入所述悬液B体积1％的3-(三乙氧基硅基)丙基琥珀酸酐或加入所述悬液B体积1.6％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在60-70℃下搅拌回流12-24h，回流完成后滤出沉淀，沉淀依次以乙醇和蒸馏水洗涤制得初产物；

(2)烯丙基改性6-氨基嘌呤制备

称取溴乙醇4g，在冰水浴条件下溶解在20ml的二氯甲烷中，加入0.4g三乙胺和3.7g甲基丙烯酰氯，在室温条件下搅拌反应12-14h，反应完成后分离滤液，所述滤液依次经冰水洗涤、无水硫酸镁干燥后蒸去二氯甲烷，得到酯化产物；称取6-氨基嘌呤2g和氢化钠0.4g，并溶解在50ml无水DMF中，充分搅拌均匀后，加入5g所述酯化产物，在室温条件下搅拌反应12-14h，反应完成后分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥制得烯丙基改性6-氨基嘌呤；

(3)共聚产物制备

称取0.8g所述烯丙基改性6-氨基嘌呤和0.85g磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯并溶解在40ml无水DMSO中，充分溶解后加入0.06g的偶氮二异丁腈，经氮吹除氧后封闭反应体系，将反应体系置于75℃下恒温反应3d，反应完成后冷却，分离滤液，并用丙酮沉淀数次，真空干燥制得共聚产物；

(4)包覆产物制备

称取所述共聚产物并溶解在热的蒸馏水中，加入所述初产物，充分分散后边搅拌边滴加与所述蒸馏水等体积的丙酮，过滤，滤饼真空干燥后制得，其中，所述共聚产物与所述沉淀、所述蒸馏水的质量比例为1：1：1000。

实验例

1、对致病菌的抑菌效果实验

i、将实施例1-3制备的益生菌复合物置于相应的液体培养基中，37℃、5％CO

ii、将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和白色念珠菌分别涂布于LB固体培养基中，将牛津杯置于平板上，吸取步骤i得到的上清液250μl于牛津杯中，37℃恒温培养，8h后测量抑菌圈直径。

按照上述方法分别测试实施例1～3对致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和白色念珠菌)的体外抑制效果，抑菌圈直径具体数据如表1所示；

表1

2、对阴道炎治疗效果的动物实验

a.受试动物建模

取月龄5个月左右，体重2.5kg左右健康成熟的新西兰雌性大白兔24只，检查确认动物阴道口无分泌物、充血、水肿和其他受损情况，进行益生菌阴道抑菌实验。将阴道常见致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的24h培养物等比例混合，每只家兔用注射器往阴道灌注菌液1mL(注液后要保持灌注时的姿势15min，然后放回笼中，以防菌液马上流出)，每天1次，待出现相应临床症状即可。建模成功的兔子阴道黏膜肿胀、充血，外阴周围粘附有粘液性分泌物，食欲减少，涂片镜检有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。

b.治疗效果

建模成功后将24只家兔随机分为4组，每组6只，分别为对照组和3个实验组。将实施例1-3的益生菌复合物包覆于无菌棉条上，3组实验组每组家兔用涂覆有益生菌复合物的棉条置于阴道，其中对照组仅放置无菌棉条，每天1次，每次20min，持续7天。每天观察实验组和对照组的体温、精神状态、活动情况、进食情况等临床变化。停药观察5天后处死动物，取出完整的阴道，纵向切开，观察阴道黏膜是否光滑，并取样培养测定阴道内是否有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌。

试验结果显示在连续注射7天后中剂量治疗组家兔的阴道炎临床症状全部消失，停药5天后培养家兔阴道采集物未发现致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。本发明可以调控微生物菌群结构异常，补充优势乳杆菌，促进菌群平衡，抑制病原菌群的繁殖和炎症，同时安全可靠，弥补抗生素治疗微生物感染疗效的不足。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。