一种异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂、方法及应用

摘要

本发明公开了一种异硫氰酸烯丙酯的CD‑MOF制剂、方法及其应用，所述制剂以γ‑CD‑MOF为载体载入异硫氰酸烯丙酯，所述制剂的制备方法包括以下步骤：选用β‑CD、γ‑CD为有机配体合成β‑CD‑MOF、γ‑CD‑MOF晶体；调节β‑CD‑MOF、γ‑CD‑MOF晶体至中性；以中性的β‑CD‑MOF、γ‑CD‑MOF为载体对异硫氰酸烯丙酯进行载药得到β‑CD‑MOF‑AITC和γ‑CD‑MOF‑AITC；所述制剂质量评价方法从粉体学性质、体外释放、细胞毒性和肺局部耐受性逐一评价，本发明的制剂可应用于制备治疗COPD的药物或试剂盒中，也可作为用于制备治疗COPD药物制剂、医疗器械或消毒用品中。

说明书

技术领域

本发明领域属于干粉吸入剂领域，特别涉及一种异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂、方法及其应用。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统中常见病和多发病，以持续存在的呼吸道症状和气流受限为主要特征，发病率和致死率居高不下。目前，临床上存在多种可用于缓解或减轻COPD症状的药物，大多数药物的给药方式均为肺部吸入给药，支气管扩张剂仍然是COPD治疗的基石。肺部给药是治疗肺部疾病最有效的给药方式，然而，肺部吞噬细胞和粘液纤毛对暴露于气道中异物的清除功能，成为肺部药物输送最大的障碍。因此，为了实现有效的雾化，最大限度地增加肺沉积、减少巨噬细胞的清除，通常需要对颗粒进行复杂的处理与修饰。干粉吸入剂(DPI)指固体微粉化原料药物单独或与合适载体混合后，以胶囊、泡囊或多剂量贮库形式，采用特制的干粉吸入装置，由患者吸入雾化药物至肺部的制剂，干粉的雾化性能主要取决于颗粒的空气动力学直径、表面形貌和吸湿性，当微粒的空气动力学直径(Da)小于1μm时，容易被肺泡做气体交换时呼出，基本不能在呼吸道沉积；而当微粒的Da大于10μm时，大部分以惯性嵌入的方式沉积于口咽部及气管分支处等气流速度快的部位，易被呼吸道粘膜排出或被巨噬细胞吞噬清除。

异硫氰酸烯丙酯(AITC)具有广泛的药理作用，对多种肿瘤均有较好的抑制作用，与莱菔硫烷对非小细胞肺癌具有协同预防作用，给药后可以增加A549肺癌细胞内活性氧的产生，协同抑制癌细胞生长的作用。

金属有机骨架(MOF)作为一种有前途的药物输送系统，在生物医学领域一直备受关注，但目前大多数MOF由重金属和不可降解的配体组装而成，存在一定的毒性，使其在生物医学中的应用受到限制。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF干粉制剂。

一种异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂，所述制剂以γ-CD-MOF为载体载入异硫氰酸烯丙酯。

一种异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂的制备方法，

所述方法包括以下步骤：

选用β-CD、γ-CD为有机配体合成β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体；

对得到的碱性β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体采用pH调节溶液调节pH至中性，得到中性β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体粉末；

以中性的β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体粉末为载体对异硫氰酸烯丙酯进行载药得到β-CD-MOF-AITC和γ-CD-MOF-AITC。

进一步地，合成β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体的过程中加入聚乙二醇20000作为粒径调节剂。

进一步地，所述pH调节溶液是体积比为10:1的乙醇和冰醋酸的混合溶液。

进一步地，所述方法还包括对载药条件进行筛选：通过对β-CD-MOF和γ-CD-MOF进行载药性能考察；对β-CD-MOF、β-CD-MOF-AITC、γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC进行表征考察；根据载药性能考察结果和表征考察结果筛选最佳载药条件。

进一步地，所述载药性能考察包括对载体、载药方法、载药时间、载药温度、投药摩尔比和载药量的考察，采用单因素法进行考察；所述表征考察包括形态学、晶体结构、物理状态和分子结构的考察。

进一步地，所述最佳载药条件为：载体选用γ-CD-MOF、载药温度为50℃、投药摩尔比nCD-MOF：nAITC为1:7、载药时间7h、采用磁力搅拌加热法载药。

一种对异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂质量进行评价的方法，

所述方法从异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂的粉体学性质、体外释放、细胞毒性和肺局部耐受性逐一评价。

一种制备治疗COPD的药物或试剂盒，所述药物或试剂盒中包括异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂。

一种药物制剂、医疗器械或消毒品，所述药物制剂、医疗器械或消毒用品中包括异硫氰酸烯丙酯的CD-MOF制剂。

本发明中γ-CD-MOF制备简单，具有生物相容性，其结构为特殊的分子网络，实现了纳米团簇、分子包合的双重机制载药，通过以γ-CD-MOF为载体进行异硫氰酸烯丙酯的载药，在高效率增加药物溶解度的同时，药物的生物利用度也得到有效提升。采用γ-CD-MOF-AITC干粉进行肺部给药，治疗肺部疾病，可以靶向递送药物至肺部病灶，减小药物的全身作用。采用气-液界面培养方式建立16HBE细胞模型，作为药物肺部吸收研究的体外模型，可以快速预测药物在肺部的吸收情况。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明实施例载药前后的两种CD-MOF粉末示意图；

图2示出了本发明实施例中时间对载药量的影响的柱状图；

图3示出了本发明实施例中温度对载药量的影响的柱状图；

图4示出了本发明实施例中投药摩尔比对载药量的影响的柱状图；

图5示出了本发明实施例中AITC浓度和吸光度值的标准曲线；

图6示出了本发明实施例中γ-CD-MOF(A)，γ-CD-MOF-AITC(B)，β-CD-MOF(C)和β-CD-MOF-AITC(D)扫描电镜图；

图7示出了本发明实施例中β-CD-MOF，β-CD-MOF-AITC，γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC的粉末X-射线衍射图；

图8示出了本发明实施例中AITC、β-CD-MOF,β-CD-MOF-AITC,γ-CD-MOF、γ-CD-MOF-AITC、AITC与β-CD-MOF物理混合和AITC与γ-CD-MOF物理混合后的差示扫描量热法图；

图9示出了本发明实施例中AITC、CD及各CD-MOF载药前后的样品的红外谱图；

图10示出了本发明实施例中γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂的粒径扫描电镜图(左)及粒径分布图(右)；

图11示出了本发明实施例中新一代药用撞击器测定各部位沉积百分数的柱状图；

图12示出了本发明实施例中γ-CD-MOF-AITC在模拟肺液中释放度研究折线图；

图13示出了本发明实施例中AITC、γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC对16HBE细胞存活率的影响的柱状图；

图14示出了本发明实施例中支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子IL-1β(A)和TNF-α(B)水平的柱状示意图；

图15示出了本发明实施例中16HBE细胞模型正常组(左)和模型组(右)显微镜图；

图16示出了本发明实施例中细胞层跨膜电阻的折线图；

图17示出了本发明实施例中不同时间点AITC在正常组、模型组的累积转运量折线图；

图18示出了本发明实施例中不同时间点γ-CD-MOF-AITC在正常组、模型组的累积转运量折线图；

图19示出了本发明实施例中不同时间点高、低剂量γ-CD-MOF-AITC在模型组的累积转运量折线图；

图20示出了本发明实施例中BCA法测定蛋白浓度标准曲线图；

图21示出了本发明实施例中AITC在16HBE上皮细胞层中的摄取量的柱状示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明首先采用β-CD、γ-CD为有机配体合成β-CD-MOF、γ-CD-MOF；然后对两种CD-MOF进行载药及表征，筛选出更适合的干粉吸入剂载体进行载药。并从粉末颗粒是否符合肺部吸入给药要求及生物安全性等方面对干粉吸入剂进行质量评价；最后，通过建立16HBE细胞模型，考察干粉吸入剂在体外细胞模型上的渗透性，体外评估制剂在肺部的吸收。

实施例1

采用β-CD、γ-CD为有机配体合成β-CD-MOF、γ-CD-MOF，并以β-CD-MOF、γ-CD-MOF为载体进行AITC的载药。

一、CD-MOF-AITC的制备

①β-CD-MOF的制备

分别称取β-CD(4.54g，4mmol)、KOH(1.80g，32mmol)于250mL烧杯中，加入超纯水46mL，溶解后溶液经0.45μm有机滤膜滤过，向滤液中加入等体积的甲醇，置于50℃水浴中加热20min。将上清液转移至干净烧杯中，立即加入PEG 20000(12mg·mL

②γ-CD-MOF的制备

分别称取γ-CD(2.59g，2mmol)、KOH(0.90g，16mmol)于另一250mL烧杯中，加入超纯水80mL，溶解后溶液经0.45μm有机滤膜滤过，按甲醇：滤液体积比3:5加入甲醇。50℃水浴中加热20min后将上清液转移至干净烧杯中，立即加入PEG 20000(8mg·mL

③pH调节(调节pH为6～7)

将上述得到的碱性β-CD-MOF、γ-CD-MOF晶体悬浮分散于乙醇和冰醋酸(v/v为10:1)的混合溶液中，置于摇床上150rpm，3h，离心收集晶体(4000rpm，5min)，用无水乙醇洗涤3遍，40℃真空干燥12h，得到中性β-CD-MOF、γ-CD-MOF。分别称取pH调节前后的两种晶体粉末10mg，超声溶解于1mL超纯水中，测定溶液pH值。

④CD-MOF-AITC的制备

共结晶法：称取β-CD(0.4mmol)、KOH(3.2mmol)、AITC(1.65mmol)；γ-CD(0.125mmol)、KOH(1mmol)、AITC(0.76mmol)于两个烧杯中，分别加入超纯水4.6mL、5mL，溶解后溶液经0.45μm有机滤膜滤过，β-CD-MOF-AITC其余制备过程同β-CD-MOF的制备，γ-CD-MOF-AITC其余制备过程同γ-CD-MOF的制备，制备得到β-CD-MOF-AITC和γ-CD-MOF-AITC晶体。

磁力搅拌加热法：分别称取β-CD-MOF、γ-CD-MOF粉末200mg置于圆底烧瓶中，加入5mL乙醇溶液，分别将两种CD-MOF与药物摩尔比为1:7加入AITC，接冷凝管于磁力搅拌加热器中40℃，500rpm进行载药，结束载药后离心收集晶体(4000rpm，5min)，乙醇洗涤3次后40℃真空干燥12h，得到β-CD-MOF-AITC和γ-CD-MOF-AITC晶体。

以中性β-CD-MOF、γ-CD-MOF进行载药，制备得到β-CD-MOF-AITC和γ-CD-MOF-AITC。载药前后的两种CD-MOF粉末如图1所示，外观性状无明显差异，均为白色疏松粉末。

实施例2

对得到的两种β-CD-MOF-AITC和γ-CD-MOF-AITC晶体进行载药条件的考察(采用单因素考察)；采用紫外分光光度法初步测定各CD-MOF-AITC样品中AITC的含量，考察载药方法、载药时间、载药温度、投药摩尔比等因素对载药量的影响。

①载药方法考察：采用紫外分光光度法初步测定采用共结晶法和磁力搅拌加热法得到的各样品的载药量，得出磁力搅拌加热法载药优于共结晶法，共结晶法制备的CD-MOF-AITC不仅载药量低(<5％)，得到的晶体产率也大大降低，且磁力搅拌加热法相较于共结晶法较为可控，可以避免AITC与碱性水溶液接触发生降解，药物与载体充分接触混合，使药物进入CD-MOF孔隙中，从而达到理想的载药效果更加适合AITC载药。

②载药时间考察：分别称取β-CD-MOF、γ-CD-MOF粉末200mg置于圆底烧瓶中，加入5mL乙醇溶液，分别将两种CD-MOF与药物摩尔比为1:7加入AITC，接冷凝管于磁力搅拌加热器中40℃，500rpm进行载药，分别于0.5、1、3、5、7h时间点结束载药，离心收集晶体(4000rpm，5min)，乙醇洗涤晶体3次后40℃真空干燥12h。

采用紫外分光光度法初步测定不同载药时间下各CD-MOF-AITC样品中AITC的含量，结果如图2所示：载药时间对两种CD-MOF的载药量均有较大影响。当温度设为40℃时，β-CD-MOF在各时间点的载药量均高于γ-CD-MOF。随着载药时间的延长，载药量增加，在3h时β-CD-MOF、γ-CD-MOF载药量显著增加。但是，3h后β-CD-MOF载药量增加不明显，说明大部分AITC分子可在3h内进入β-CD-MOF；当载药时间达到7h，γ-CD-MOF载药量又明显增加，表明两种CD-MOF的载药机制可能不同。

③载药温度考察：分别称取两种CD-MOF粉末200mg，各取3份置于圆底烧瓶中，按照载药时间考察条件加入乙醇和AITC，选择最佳载药时间点，分别于30℃、40℃、50℃磁力搅拌加热器中500rpm进行载药，载药结束后4000rpm，5min离心收集沉淀，乙醇洗涤沉淀3次后40℃真空干燥12h。

采用紫外分光光度计法初步测定不同载药时间下各CD-MOF-AITC样品中AITC的含量，结果如图3所示：随着温度的升高，载药量逐渐增加。当载药温度由40℃升高到50℃时，γ-CD-MOF的载药量高于β-CD-MOF。可能是温度升高使溶液中分子活性增强，导致更多的药物分子进入γ-CD空腔中，相比于β-CD-MOF来说，γ-CD-MOF具有更大的空腔和外部比表面积，使载药量大大增加；而β-CD-MOF为层状结构，阻塞了β-CD空腔，药物分子进入β-CD-MOF难度增加，因此，温度升高时载药量增加不明显。

④投药摩尔比考察：分别称取200mgβ-CD-MOF、γ-CD-MOF粉末各3份，置于圆底烧瓶中，加入5mL乙醇溶液，按投药摩尔比1:5、1:7、1:9加入相应体积的AITC，选择最佳载药时间点、最佳载药温度，与上述考察相同条件下进行载药，载药结束后离心收集沉淀(4000rpm，5min)，乙醇洗涤3次后40℃真空干燥12h。

投药摩尔比对β-CD-MOF、γ-CD-MOF载药AITC量的影响如图4所示：投药摩尔比(n

⑤载药量测定

用移液枪精密移取100μL(1.013mg·μL

取载药后的CD-MOF粉末约20.0mg于2mLEP管中，加入1mL超纯水溶解转移至25mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀后用紫外分光光度计在248nm波长下测定各样品的吸光度值A，带入标准曲线方程中，各样品重复测定3次，计算平均值。载药量计算公式如下：

实施例3

分别对β-CD-MOF、β-CD-MOF-AITC、γ-CD-MOF、γ-CD-MOF-AITC进行表征考察。

①扫描电子显微镜(SEM)

采用扫描电子显微镜对CD-MOF进行形态学表征，分别将载药前后的两种CD-MOF粉末在扫描电镜下进行观察。

结果如图6所示，β-CD-MOF、γ-CD-MOF形貌差异较大。γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC均为规则的立方体结构晶体，表明磁力搅拌加热法负载AITC并未引起γ-CD-MOF的形貌发生变化；相反，β-CD-MOF载药后微观形貌发生较大改变，可能是由于β-CD-MOF的层状结构导致其侧面未与K

②粉末X-射线衍射(PXRD)

为确定所合成材料的结构以及载药后是否会破坏晶体结构，分别对β-CD-MOF，β-CD-MOF-AITC，γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC的晶体结构进行PXRD表征(使用CuKα辐射

表征结果如图7所示，各样品的x-射线衍射图谱在CD-MOF典型结晶图谱的衍射角上均出现其固有峰。β-CD-MOF的衍射峰出现在4.7°，9.4°，18.6°和32.7°左右，可能是β-CD的C

③差示扫描量热法(DSC)

采用差示扫描量热法对AITC、两种载药前后的CD-MOF以及AITC与CD-MOF的物理混合物的物理状态进行表征。将样品(5～15mg)置于铝坩埚中称量，温度范围25～280℃，升温速率为10℃·min

表征结果如图8所示，AITC在158℃出现吸热峰，但是该吸热峰在β-CD-MOF-AITC、γ-CD-MOF-AITC的DSC曲线中完全消失，表明AITC进入β-CD-MOF、γ-CD-MOF骨架中。相比之下，AITC与两种CD-MOF的物理混合物均出现小的吸热峰，但峰位均发生微小移动，由158℃分别移动至134℃、145℃，表明AITC与β-CD-MOF、γ-CD-MOF物理混合后(记为β-CD-MOF-AITC(PM)、γ-CD-MOF-AITC(PM))发生微弱的相互作用。

④傅里叶红外光谱(FTIR)

将待测样品与溴化钾按照1:10的比例研磨混合均匀后进行压片，采用傅里叶红外光谱仪测定各样品在400～4000cm

结果如图9所示：AITC主要特征峰是2097cm

结合实施例1、2、3可知，最佳的载药条件为温度50℃、投药摩尔比(n

实施例4

对γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂质量进行评价，具体地，采用高效液相色谱法确立AITC体外分析方法。通过对γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂从粉体学性质、体外释放、细胞毒性和肺局部耐受性几个方面考察。

1、粉体学性质考察

①粒径及分布

将实施例3中得到的γ-CD-MOF-AITC扫描电镜图，通过ImageJ软件进行分析和计算，根据频率分布和累积分布来体现不同粒径粒子的分布情况，绘制粒径分布图，如图10所示，经PEG 20000控制粒径后载药，γ-CD-MOF-AITC粉末粒径均在1～5μm范围内，约60％的粒子粒径在2～3μm之间，符合干粉吸入剂的粒径要求。

②粉末流动性

取10ml量筒，记录量筒的质量为m

堆密度(ρ

振实密度(ρ

Carr's指数＝(ρ

tanθ＝h/r×100％

结果如表1所示：γ-CD-MOF-AITC粉末的休止角为50.33±0.67°。由于CD-MOF为多孔结构，密度相对较低，测得样品堆密度为0.26±0.01g·mL

表1γ-CD-MOF-AITC的粉体流动性参数(n＝3)

③引湿性

将干燥的扁形称量瓶置于放有硫酸铵过饱和溶液的干燥器中，25℃放置24h后加盖精密称定重量(m1)。取γ-CD-MOF-AITC样品粉末适量平铺于上述称量瓶中，厚度约为1mm，加盖精密称定重量(m2)，将瓶口敞开放入上述干燥器中，24h后盖好盖子取出，称定重量记为m3，平行测定3次，计算样品粉末的吸湿増重，n表示实验次数。

硫酸铵过饱和溶液的配制：25℃下100％硫酸铵是1L水中约加780g硫酸铵。取适量硫酸铵加入水中，加热至50～60℃使固体溶解，放置过夜有晶体析出即达到100％饱和度，再用氨水调节pH至7.0。

增重百分率(％)＝(m3-m2)/(m2-m1)×100％

结果如表2所示:

表2γ-CD-MOF-AITC粉体吸湿性考察(n＝3)

γ-CD-MOF-AITC粉末在24h后部分粉体发生轻微的聚集和结块，由表2可知，吸湿增重为5.74±0.24％，根据2015版药典，引湿增重在2％～15％之间，可判定粉末有引湿性，可能是γ-CD-MOF的孔隙率和比表面积比较大。

④体外肺部沉积考察

采用新一代药用撞击器(NGI)测定干粉吸入剂体外肺部沉积率，取γ-CD-MOF-AITC粉末(约10mg)装入羟丙甲纤维素胶囊中，制备10粒。按NGI仪器操作方法进行，操作前需用甲基硅油正己烷溶液(1％，W/V)对8个收集杯进行涂层处理来捕获粒子，调节空气流速为60L·min

递送率(RA)，微细粒子分数(FPF)，计算公式如下：

式中，排出量(ED)，表示存储在适配器、模拟喉部、预分离器和所有冲击级上的粉末量；总剂量(TD)为胶囊内粉末的充填量；微细粒子剂量(FPD)指S2～S7级收集杯及MOC部分粉末量之和，即空气动力学直径小于4.46μm的粉末。以累积分布百分率的对数对截断直径的对数作图，累积分布百分率达到50％时的粒径为质量中值空气动力学直径(MMAD)；累积分布率分别为84.13％和15.87％时对应的空气动力学直径之比的平方根为几何标准差(GSD)。

结果如图11所示，只有不到10％的粉末滞留在胶囊中，表明干粉制剂容易雾化并通过设备。由于粉末流动性较低，大部分颗粒沉积在喉部，FPF(微细粒子分数)为17.81±0.69％，用来表示体外沉积率。MMAD(质量中值空气动力学直径)是表征可吸入颗粒物空气动力学特性的重要参数，控制颗粒在肺部沉积位置的最重要变量，由表3可知，γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂MMAD为4.72±0.06μm，GSD为1.31±0.02。GSD描述的是粉末粒径分布曲线的形状，一般认为，该参数值越接近于1，干粉吸入剂的粒度分布越窄。

表3γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂空气动力学参数(n＝3)

通过对γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂粉体学性质的考察，以上结果表明，该制剂基本符合肺部吸入给药要求，γ-CD-MOF可以作为肺部给药载体将AITC递送至肺部。

2、体外释放的考察

称取3份25.0mg的γ-CD-MOF-AITC粉末，精密称定，置于3个50mL离心管中，分别加入10mL新鲜配制的模拟肺液，再加入0.02％的吐温80助悬。置于摇床中，100rpm，37℃，分别于2，5，10，15，30，60min取释放介质200μL，然后用等体积新鲜模拟肺液填补于原释放介质中。将取出的释放液用甲醇-水(60:40)定容至1mL，摇匀后离心(5000rpm，10min)，吸取上清液过0.22μm有机滤膜，采用高效液相色谱法测定各样品溶液中AITC的含量。

模拟肺液的制备：将表4中各组分溶质按顺序添加至超纯水中，溶解后定容于1L容量瓶中，待一种溶质完全溶解后方可加入下一溶质，以避免盐的析出。所有化学试剂均为分析级。

表4模拟肺液的组成(SLF,pH＝7.4)

使用模拟肺液作为释放介质来模拟肺部的内环境，考察γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂粉在肺部的释放情况。由于γ-CD-MOF在水溶液中迅速崩解，制备的γ-CD-MOF-AITC为速释型干粉吸入剂，与该考察结果一致，药物在模拟肺液中迅速释放，如图12所示，AITC在5min内释放完全，释放度达到90％左右。

3、细胞毒性实验

取对数生长期的16HBE细胞(人支气管上皮细胞)，通过细胞计数板计数后，以5×10

细胞给药溶液的制备：取AITC 2.5325mg(2.5μL)溶解于少量二甲基亚砜(DMSO)中，再用DMEM培养基定容至8mL，配制成浓度为316.56μg·mL

细胞存活率与AITC浓度的关系如图13所示，在0.990～31.656μg·mL

4、肺局部耐受性

脂多糖(LPS)、AITC和γ-CD-MOF-AITC干粉制剂均通过DP-4装置气管内雾化给药。将25只雄性小鼠按照随机分组原则，A.未处理小鼠为阴性对照组(N-Ctrl)、B.LPS给药组、C.AITC给药组、D.γ-CD-MOF给药组、E.γ-CD-MOF-AITC给药组，每组各5只。制剂按照AITC20mg·kg

实验结果如图14所示，γ-CD-MOF和γ-CD-MOF-AITC给药组，BALFs中检测到的细胞因子水平与阴性对照组水平无明显差异。LPS给药组作为阳性对照组，与阴性对照组相比，IL-1β和TNF-α水平显著增加。实验结果表明在重复、长时间给药后，以γ-CD-MOF为载体的干粉吸入剂具有良好的肺部耐受性，对肺组织无明显刺激。

粉体学性质考察结果表明γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂粉末粒径符合肺部给药的空气动力学特征，基本满足肺部吸入给药要求。体外释放结果表明，γ-CD-MOF能使AITC在模拟肺液中5min内达到最大释放度(90％左右)，释药迅速完全。通过细胞毒性实验和肺局部耐受性考察，结果表明γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂生物安全性良好。以上结果表明，γ-CD-MOF可作为速释型干粉吸入剂载体成功将AITC递送至肺部。

实施例5

采用16HBE细胞构建了体外气道上皮细胞模型，考察AITC及其干粉吸入制剂在细胞模型中的渗透性，体外评估γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂在肺部的吸收。

具体方法包括以下步骤：

①建立16HBE细胞模型并评价

培养16HBE细胞：将种有16HBE细胞的培养瓶置于37℃，5％CO

16HBE细胞模型的建立：将无支原体的16HBE细胞以2.5×10

细胞模型形态学检查：建模完成后，将Transwell小室在倒置显微镜下进行观察。

细胞模型形态如图15所示，正常组与模型组细胞均在聚碳酸酯膜上形成致密细胞层，细胞间形成紧密连接。

跨膜电阻的测定：通过测量跨膜电阻(TEER)来确定细胞层达到融合的培养天数，监测具有紧密连接的融合细胞层的生长。使用EVOM上皮跨膜电阻仪和STX2电极测量上皮细胞层的TEER。在测量之前，将0.5mL、1.5mL预热至37℃的新鲜培养基分别添加到顶端室和基底外侧室，37℃下平衡30min后进行测量。用测得的每一细胞层的TEER减去空白渗透性滤膜的电阻，得到上皮细胞层的TEER(n＝6)。

结果如图16所示，气-液界面培养7天细胞层TEER。培养6天后TEER达到最大值(242±16Ω·cm

②分别从转运和摄取两个方面来进行AITC及其干粉吸入剂在16HBE细胞模型中的渗透性的实验。

对实验进行分组：

(1)体外细胞模型预测AITC的肺部吸收：A.正常组+480μMAITC(AITC-N-H)、B.模型组+480μM AITC(AITC-M-H)；

(2)体外细胞模型评价γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂在肺部的吸收：

A.正常组+4mgγ-CD-MOF-AITC(DPI-N-L)

B.模型组+4mgγ-CD-MOF-AITC(DPI-M-L)

C.模型组+8mgγ-CD-MOF-AITC(DPI-M-H)

转运实验：实验中使用的所有溶液都预热至37℃。进行转运实验前，将培养基从Transwell小室的基底外侧腔中吸出，细胞层用HBSS溶液(汉克平衡盐溶液)洗涤两次。顶端室加入HBSS溶液0.5mL、基底外侧腔加入1.5mL，在37℃下平衡30min。平衡结束后，将供体腔内的溶液替换为含药HBSS溶液0.5mL；将4个建模完成的Transwell小室放置在距干燥器中心等距的位置，采用动物肺部喷雾给药装置喷洒干粉吸入剂，之后基底外侧腔加入1.5mLHBSS溶液，以提供相当于顶端室的溶液水平，避免腔室之间的静水压力梯度。在37℃，100rpm·min

药物在细胞层上的累积转运量

AITC在16HBE细胞模型中转运结果如图17所示，3h内AITC在细胞模型上的转运呈时间依赖性，正常组在各时间点的累计转运量均高于模型组，AITC在正常组和模型组的Papp分别为3.37±0.34×10

γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂在16HBE细胞模型中转运结果如图18所示，3h内正常组细胞模型中AITC累计转运量高于模型组，与AITC给药结果一致，但累积转运量差异明显减小。

不同时间点γ-CD-MOF-AITC在正常组、模型组的累积转运量(n＝3)如图19所示，表明AITC在细胞模型中的转运呈时间和浓度依赖性，随着干粉吸入剂给药剂量的增加，各时间点累积转运量也随之增加。

摄取实验：转运实验结束后，将Transwell小室夹出，弃去药液，加入4℃的HBBS溶液终止摄取，再用预冷的HBSS溶液洗涤两次，置入新的12孔板中，向小室内加入300μL裂解液，恒温摇床(37℃，50rpm·min

BCA蛋白定量：将BCA试剂盒内的试剂A与试剂B，按体积比50:1充分混合配制成BCA工作液(24h内使用)；取10μL蛋白标准溶液(25mg·mL

AITC、γ-CD-MOF-AITC干粉吸入剂给药后在正常组和模型组中的药物浓度如图21所示，模型组细胞中药物浓度均显著高于正常组。随着干粉吸入剂给药剂量的增加，细胞模型中药物浓度显著增加，且制剂组细胞模型中药物摄取量高于AITC组。

由以上结果可知，载入γ-CD-MOF的药物在细胞模型中的渗透速率更快，累积转运量显著增加，同时药物摄取量也高于AITC给药，干粉吸入剂给药在肺部吸收更好，表明γ-CD-MOF会促进AITC在肺部的吸收。

对尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。