一种农杆菌侵染银腺杨愈伤组织的遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌侵染银腺杨愈伤组织的遗传转化方法，属于基因工程技术领域，包括如下步骤：(1)愈伤组织诱导；(2)愈伤组织预培养；(3)菌种活化与培养；(4)侵染；(5)共培养；(6)诱导不定芽；(7)芽伸长生长培养；(8)诱导生根及检测。本发明的方法具有转化效率高、周期短、高通量等优点，为杨树转基因提供了一种可行的技术方法，是进行林木的遗传改良的一种强有力的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种银腺杨愈伤组织的遗传转化方法，特别涉及一种农杆菌侵染银腺杨愈伤组织的遗传转化方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

木材既是全球陆地生态系统的主体，又是国民经济建设发展中的重要工业原料。我国是一个木材及木制品消费大国，但由于森林资源匮乏，林木供求关系日益紧张。我国大力发展速生、优质人工林，来满足生态和用材的需求。通过遗传改良主要造林树种，提高木材产量和质量，是我国林木育种的重要方向。

杨树抗逆性强，速生，在木材生产中占有较重要地位。但林木生长周期长、杂合度高等诸多自身生物学特性的限制，传统育种进展相对缓慢，特别是对于材性和抗性的改良遇到很大瓶颈。利用现代生物技术手段如基因工程方法对林木生长与材性进行改良，可加快速生优质林木品种的培育。

良好的木本植物遗传转化体系不仅可为进一步研究发育生理以及形态建成等许多基础理论问题提供研究材料，而且为利用现代生物技术改良杨树品种、加速育种进程、促进优良种苗的快速繁殖等奠定基础。农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它可以将自身的T-DNA序列插入植物基因组，因此，将目的基因插入T-DNA区段可以实现外源目的基因的转移以及在植物细胞中的表达，从而改变植物的遗传性状。根癌农杆菌介导法是目前植物转基因技术中应用最普遍且发展最成熟的转基因方法。

大多数植物遗传转化技术都是建立在转化细胞离体再生的基础上。杨树遗传转化体系常用的外植体多为离体的叶片、茎段等，通过不定芽的再生进而获得转化材料。但该类方法具有培养周期长，再生频率低等缺点。

目前，银腺杨转基因主要有“光诱导法”和“暗诱导法”两种方法。“光诱导法”是指外植体(组织或者器官)不经愈伤组织诱导直接分化出不定芽的直接分化体系；“暗诱导法”是指外植体在黑暗条件下先经脱分化诱导形成愈伤后将其移至光下继续诱导，最终获得再生植株的方法。前者耗时短，但转化效率相对较低，后者虽然转化效率有所提升，但是耗时较长。

因此，提供一种耗时短、转化效率高、稳定遗传的以愈伤组织为受体的由农杆菌介导的银腺杨遗传转化方法就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种耗时短、转化效率高、稳定遗传的农杆菌介导愈伤组织的银腺杨稳定遗传转化方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种农杆菌侵染银腺杨(Populus alba×P.glandulosa cv.‘84K’)愈伤组织的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织诱导

取银腺杨树组培苗叶片，用手术刀片沿叶脉方向横切2-3次，平铺于愈伤组织诱导培养基(Calli Induction Medium，CIM)上，在24±1℃，黑暗条件下诱导培养30-45天；

(2)愈伤组织预培养

将步骤(1)获得的愈伤组织切成小块，置于共培养基(Co-cultivation Medium，CM培养基)中，预培养2-6天，备用；

(3)菌种活化与培养

用无菌牙签蘸取超低温(-80℃)保存的农杆菌菌种，划线于含有抗生素的LB(Luria-Bertani)固体培养基上，28℃下倒置培养3天；挑取单菌落置于无菌试管中，加入3mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，过夜震荡培养；取1.0mL菌液加入50mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，震荡培养至OD

(4)侵染

将步骤(3)获得的菌液置于离心管中，在4℃、3500g条件下离心15分钟，弃去上清液，用重悬液重悬菌体，即为侵染液；将(2)获得的愈伤组织放入侵染液中，室温条件下侵染10-25分钟；

(5)共培养：

取出愈伤组织，置于无菌滤纸上，吸干表面残留的侵染液，置于共培养基(Co-cultivation Medium，CM培养基)上，24±1℃，暗培养2-5天；

(6)诱导不定芽：

取出共培养的愈伤组织，先用无菌去离子水冲洗2-3次，然后，用浓度为200mg/L的特美汀-去离子无菌水溶液洗涤浸泡30-60min，再用无菌滤纸吸干表面水分，并转移至SIM(Shoots Induction Medium)分化培养基中，在24±1℃、日光照长度为16h的条件下培养21天后，愈伤组织开始陆续长出不定芽；

(7)芽伸长生长培养：

将带有不定芽的愈伤组织转移到SEM(Shoots Elongation Medium)芽伸长生长培养基中，培养2周后，不定芽可生长至1-2厘米；

(8)诱导生根及检测：

切去不定芽底部膨大部位，转入RM生根培养基(Rooting Medium)中诱导生根，剪取叶片并提取DNA，进行PCR检测和GUS染色验证。

优选地，步骤(1)中，所述银腺杨树组培苗叶片为3周龄。

优选地，步骤(1)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：WPM(Lloyd&McCown WoodyPlant Basal Medium w/Vitamins)盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES(4-morpholineethanesulfonic acid)0.5g/L，2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)1.0mg/L，KT(6-furfurylaminopurine)0.1mg/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9。

优选地，步骤(2)中，所述预培养时间为6天。

优选地，步骤(2)中，共培养基的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES 0.5g/L，乙酰丁香酮AS100μM/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9。

优选地，步骤(3)中，农杆菌为GV3101，含有表达载体pCAMBIA1301，抗生素及其工作浓度分别为：利福平(34mg/L)、庆大霉素(50mg/L)和卡纳霉素(50mg/L)。

优选地，步骤(3)中，OD

优选地，步骤(4)中，重悬液的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，2,4-D 1.0mg/L，KT 0.1mg/L，乙酰丁香酮100μM，pH＝5.6。

优选地，步骤(4)中，侵染15min。

优选地，步骤(6)中，SIM分化培养基的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，NAA(naphthylacetic acid)0.05mg/L，6-BA(6-benzylaminopurine)0.5mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9。

优选地，步骤(7)中，SEM芽伸长生长培养基的组成为：MS盐4.43g/L，蔗糖30g/L，NAA 0.02mg/L，6-BA 0.05mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，琼脂5g/L，pH＝5.9。

优选地，步骤(8)中，RM生根培养基的组成为：MS盐2.22g/L，蔗糖30g/L，NAA0.02mg/L，IBA(indolebutyric acid)0.05mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，琼脂5g/L，pH＝5.9。

有益效果：

本发明提供了一种以愈伤组织为受体的农杆菌转化银腺杨的方法，2,4-D和KT联合作用下诱导叶片脱分化产生愈伤组织，经过农杆菌侵染后，在6-BA和NAA作用下，愈伤组织再分化形成不定芽，然后将不定芽置于低浓度激素下诱导伸长生长，待不定芽长到合适长度后，移入生根培养基中生根。

本发明的方法先将杨树叶片诱导成愈伤组织，再进行侵染，每一块愈伤组织均可以发育出多个独立的转化子，从而提高了农杆菌侵染效率；愈伤组织一次继代后，可以诱导出5-10倍的愈伤组织，为大批量转基因提供了基础；用愈伤组织直接侵染，与传统先侵染外植体后诱导愈伤组织相比，节省了大量时间。综上所述，本方法具有转化效率高、高通量、周期短等优点，为大批量的杨树转基因提供了一种可行的技术方法。

本发明的农杆菌侵染银腺杨愈伤组织的遗传转化方法，以愈伤组织作为遗传转化的受体材料，利用培养条件将脱分化与再分化过程分开，外植体的细胞在经历了完整的脱分化后回到分生细胞水平，更易接受外源基因，转化效率相对更高，可获得较多的转化子，具有离体再生频率高、获得转化植株周期短等优点。多数植物组织、器官均能产生愈伤组织，该培养方式普遍适用于通过离体培养途径能再生的植物。同时，愈伤组织经继代培养在较短时间内即可大量繁殖，因此极大的减少了叶片的使用量，能节省大量培养空间及人力物力。因此，本发明以银腺杨叶片诱导的愈伤组织为外植体，利用农杆菌介导法，建立了一种高效快速且高通量的遗传转化体系。

本发明采用的农杆菌为GV3101，含有表达载体pCAMBIA1301，GV3101具有利福平抗性，该菌株携带的Ti质粒pMP90具有庆大霉素抗性；表达载体pCAMBIA1301具有卡纳霉素抗性，编码的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因是植物转基因中常用的一个报告基因。其T-DNA上的潮霉素磷酸转移酶基因作为转基因杨树的选择标记基因，编码蛋白具有潮霉素抗性。具有潮霉素抗性的再生苗用特异性引物进行PCR检测，产物大小为653bp，同时进行GUS染色，以验证目的片段转入银腺杨中。

下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1为本发明实施例1中DNA水平PCR检测结果。

图2为本发明实施例1中GUS染色结果。

具体实施方式

除非特别说明，下面实施例中所用的原料均为市场上可购的常规原料，所用的方法均为本技术领域常用的方法。

实施例1

一种农杆菌侵染银腺杨(Populus alba×P.glandulosa cv.‘84K’)愈伤组织的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织诱导

取3周龄银腺杨树组培苗叶片，用手术刀片沿叶脉方向横切2-3次，置于愈伤组织诱导培养基CIM中诱导愈伤组织，于24±1℃，黑暗条件下，培养37天，即可获得愈伤组织；

(2)愈伤组织预培养

将愈伤组织切成1cm

(3)菌种活化与培养

用无菌牙签蘸取超低温(-80℃)保存的农杆菌菌种，划线于含有抗生素(卡纳霉素、利福平和庆大霉素)的LB固体培养基上，28℃下倒置培养3天；挑取单菌落置于无菌试管中，加入3mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，过夜震荡培养；吸取1.0mL菌液加入50mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，震荡培养至OD

(4)侵染

取(3)中50mL菌液置于离心管中，在4℃、3500g条件下离心15分钟，弃去上清液，用100mL重悬液重悬菌体，即为侵染液，将(2)中愈伤组织放入侵染液中，室温条件下侵染15分钟；

(5)共培养：

从侵染液中取出愈伤组织，置于无菌滤纸上，吸干表面残留的侵染液，放在CM共培养基上，24±1℃，暗条件下，共培养3天；

(6)诱导不定芽：

取出共培养的愈伤组织，先用无菌去离子水冲洗2-3次，然后用浓度为200mg/L的特美汀-去离子无菌水溶液洗涤、浸泡30-60分钟，再用无菌滤纸上吸干表面水分，并转移至SIM分化培养基中，在24±1℃、日光照长度为16小时的条件下培养21天后，愈伤组织开始陆续长出不定芽；

(7)芽伸长生长培养：

将带有不定芽的愈伤组织转移到SEM芽伸长生长培养基中，培养两周后，不定芽可生长至1-2厘米；

(8)诱导生根及检测：

切去不定芽底部膨大部位，转入RM生根培养基中诱导生根，剪取叶片，进行DNA水平PCR检测以及GUS染色观察，对转基因植株进行验证。

如图1所示，为本发明实施例1中DNA水平PCR检测结果：用GUS基因特异性引物进行DNA水平PCR检测，产物大小为653bp。

如图2所示，为本发明实施例1中GUS染色结果：染色后叶片变蓝，说明GUS基因重组在植物基因组中。

其中，步骤(1)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，2,4-D 1.0mg/L，KT 0.1mg/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9；

步骤(2)中，共培养培养基的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，乙酰丁香酮AS100μM/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9；

步骤(3)中，农杆菌为GV3101，含有表达载体pCAMBIA1301，抗生素及其工作浓度分别为：利福平(34mg/L)、庆大霉素(50mg/L)和卡纳霉素(50mg/L)；

步骤(4)中，重悬液的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，2,4-D1.0mg/L，KT 0.1mg/L，乙酰丁香酮100μM，pH＝5.6；

步骤(6)中，SIM分化培养基的组成为：WPM盐2.41g/L，蔗糖20g/L，MES0.5g/L，NAA0.05mg/L，6-BA 0.5mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，植物凝胶5g/L，pH＝5.9；

步骤(7)中，SEM芽伸长生长培养基的组成为：MS盐4.43g/L，蔗糖30g/L，NAA0.02mg/L，6-BA 0.05mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，琼脂5g/L，pH＝5.9；

步骤(8)中，RM生根培养基的组成为：MS盐2.22g/L，蔗糖30g/L，NAA0.02mg/L，IBA0.05mg/L，特美汀200mg/L，潮霉素B1.5mg/L，琼脂5g/L，pH＝5.9。

实施例2

其它与实施例1相同，不同之处在于：

(3)菌种活化与培养

用无菌牙签蘸取超低温(-80℃)保存的农杆菌菌种，划线于含有抗生素(卡纳霉素、利福平和庆大霉素)的LB固体培养基上，28℃下倒置培养3天；挑取单菌落置于无菌试管中，加入3mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，过夜震荡培养；吸取1.0mL菌液加入50mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，震荡培养至OD

实施例3

其它与实施例1相同，不同之处在于：

(3)菌种活化与培养

用无菌牙签蘸取超低温(-80℃)保存的农杆菌菌种，划线于含有抗生素(卡纳霉素、利福平和庆大霉素)的LB固体培养基上，28℃下倒置培养3天；挑取单菌落置于无菌试管中，加入3mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，过夜震荡培养；吸取1.0mL菌液加入50mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，震荡培养至OD

实施例4

其它与实施例1相同，不同之处在于：

(3)菌种活化与培养

用无菌牙签蘸取超低温(-80℃)保存的农杆菌菌种，划线于含有抗生素(卡纳霉素、利福平和庆大霉素)的LB固体培养基上，28℃下倒置培养3天；挑取单菌落置于无菌试管中，加入3mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，过夜震荡培养；吸取1.0mL菌液加入50mL含有抗生素的LB液体培养基，200rpm、28℃下，震荡培养至OD

实施例5-7

其它步骤与实施例1完全相同，区别在于：侵染时间分别为10分钟(实施例5)、20分钟(实施例6)和25分钟(实施例7)。

实施例8-10

其它步骤与实施例1完全相同，区别在于：共培养时间分别为2天(实施例8)、4天(实施例9)和5天(实施例10)。

实施例11-13

其它步骤与实施例1完全相同，区别在于：预培养时间分别为0天(实施例11)、2天(实施例12)和4天(实施例13)。

实施例14-16

其它步骤与实施例1完全相同，区别在于：侵染时分别加入0(实施例14)、50(实施例15)和150μM(实施例16)乙酰丁香酮。

结果分析：

一、菌液OD

统计实施例1-4中所制备的诱导生根的杨树的外植体数和产生抗性芽外植体数，计算其转化率，结果如表1所示。

OD

表1 OD

二、侵染时间对银腺杨遗传转化的影响

本发明实施例1中，步骤(4)中的侵染时间是15min，在其它步骤完全相同的情况下，侵染时间分别为10分钟、20分钟和25分钟；观察所制备的诱导分化的杨树的外植体数和产生抗性芽外植体数，计算其转化率，结果如表2所示。

侵染时间对转化效率具有重要影响，时间过短不利于遗传转化，时间过长容易导致外植体褐化死亡；本发明选取的侵染时间为10分钟、15分钟、20分钟和25分钟，结果表明：侵染时间为15分钟时，转化效率最高，25分钟时转化效率最低。

表2侵染时间对转化效率的影响

三、共培养时间对银腺杨遗传转化的影响

侵染后的共培养过程会影响T-DNA转移以及转化细胞的数量，因此，合适的共培养时间对提高转化效率具有重要作用。本发明实施例1中选取共培养时间为3天；其它完全相同，不同的是共培养时间分别为2天、4天和5天；观察所制备的诱导分化的杨树的外植体数和产生抗性芽外植体数，计算其转化率，结果如表3所示；结果表明：共培养时间为2天-3天时，转化效率相对较高，最后获得的潮霉素抗性芽的频率高达60％。

表3共培养时间对转化效率的影响

四、预培养时间对银腺杨遗传转化的影响

预培养可以使植物细胞更容易整合外源DNA，同时能促进培养基中的乙酰丁香酮渗入到外植体中，在侵染时提高转化效率；本发明实施例1中选取预培养时间为6天；其它完全相同，不同的是预培养时间分别为0天、2天和4天；观察所制备的诱导分化的杨树的外植体数和产生抗性芽外植体数，计算其转化率，结果如表4所示；实验结果表明在一定时间段内，预培养6天时的转化效率高达69％，而预培养0天、2天和4天转化效率差异不显著。

表4预培养时间对转化效率的影响

五、乙酰丁香酮对银腺杨遗传转化的影响

乙酰丁香酮AS等酚类物质是农杆菌侵染植物细胞所必需的诱导物，能活化vir基因，引导T-DNA的转移，从而提高转化效率。在侵染时，加入一定浓度的乙酰丁香酮(AS)，可以有效提高遗传转化效率。本发明实施例1中，在侵染时加入100μM的乙酰丁香酮；其它完全相同，不同的是在侵染时分别加入0、50和150μM乙酰丁香酮；观察所制备的诱导分化的杨树的外植体数和产生抗性芽外植体数，计算其转化率，结果如表5所示；结果表明：加入100μM乙酰丁香酮时，转化效率高达64％。

表5乙酰丁香酮(AS)浓度对转化效率的影响

本发明的方法相较于其它遗传转化体系，转化效率相对较高，且能用较少组培苗叶片获得大量转基因苗，节省大量人力物力，整体过程耗时较少，可为构建突变体库或大批量转基因提供便利。

本发明的方法具有转化效率高、周期短、高通量等优点，为杨树转基因提供了一种可行的技术方法，是进行林木的遗传改良的一种强有力的技术手段。