用于有效基因递送应用的无毒HSV载体和用于其生产的补充细胞

摘要

本发明提供在非补充细胞中不表达毒性HSV基因并且包含含有一种或多种转基因的基因组的单纯疱疹病毒(HSV)载体，其中所述载体能够在非补充细胞中表达转基因达至少28天。本公开的载体包括在基因ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47中具有缺失，或备选的失活突变的载体，或在动力学改变的情况下表达这些基因中的一种或多种的载体。本发明还涉及本发明载体的病毒贮存物，其适于治疗使用或适于体外应用的组合物，及与其相关的方法。在另一方而，本发明提供补充细胞，尤其是U20S细胞，其被改造成在所述细胞被HSV感染时表达ICP4和ICP27的，以用于产生本发明的载体。所述细胞被公开为天然补充ICP0。

说明书

本申请是申请日为2014年7月17日、申请号为201480051273.7、发 明名称为“用于有效基因递送应用的无毒HSV载体和用于其生产的补充 细胞”的发明专利申请的分案申请。

对相关申请的交叉引用。

本申请要求2013年7月17日提交的美国临时专利申请号61/847,405 的优先权，其整个内容以其整体结合于本文。

关于联邦政府资助的研究和开发的声明

在由国立卫生研究院给予的补助金号PO1DK044935和 5RO1NS064988下利用政府的支持进行本发明。在本发明中，政府具有某 些权利。

发明背景

在很多病毒和非病毒遗传载体系统中，已经研究基于单纯疱疹病毒 (HSV)的载体用作基因转移载体，包括可能在人患者中的治疗用途。HSV 是能够感染非常宽泛的人和动物细胞的复杂的、非整合DNA病毒。病毒 基因组含有超过80个基因并且由两个独特的部分，U

因此，仍然需要能够在不损害细胞或组织的情况下在任何组织或细胞 中，体外或体内表达转基因的HSV载体，和用于增殖这样的载体的系统。

发明概述

本发明涉及HSV载体改造中的突破，其提供了在不表达任何有害病 毒基因的情况下，在多种组织或细胞(特别是哺乳动物的)，在体外或体内 表达转基因的可能。本发明的HSV载体在非补充细胞中不表达任何毒性 病毒基因，但仍然能够强劲地，持续地(例如，达至少14天，如至少28 天，并且优选至少60天)表达转基因。因此，其填补了载体技术方面的极 其重要的孔板，因为HSV是仅有的将携带通过通用或细胞特异性启动子 控制的大的单或多转基因表达盒的能力与在没有载体整合的情况下的高 效感染性质结合的载体。本发明的载体将允许有效将基因递送至组织，如 肝，对于其，目前没有可获得的有效载体。

在一个实施方案中，本发明提供单纯疱疹病毒(HSV)载体，所述单纯 疱疹病毒(HSV)载体在非补充细胞中不表达毒性HSV基因，并且包含基因 组，所述基因组包含一种或多种转基因，其中所述载体能够在非补充细胞 中表达转基因达至少28天。本发明的载体可以包含与一种或多种绝缘子 序列可操作相连地被插入基因组内的转基因，其中所述载体不表达作为立 即早期基因的ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。根据启动子控制转 基因的活性，本发明的载体可以在其可以感染的任何类型的哺乳动物(尤其 是人)细胞表达转基因而没有病毒基因表达相关的细胞毒性。

在另一方而，本发明提供用于产生本发明的载体的补充细胞。本发明 的细胞系源自U2OS细胞，其被改造成在所述细胞被HSV感染时表达ICP4 和ICP27。

附图简述

图1A是显示报告基因表达的载体示意图。顶部的线表示用于产生本 发明的JΔNI载体的全长野生型HSV-1株KOS BAC克隆(Gierash，J.Virol. Meth.，135：197-206(2006))。第二条线表示JΔNI5，即JΔNI7-GFP的主链。 第三条线是JΔNI5的LAT至UL4区的放大。第4条线的左侧 (LAT：CAG-GFP)显示JΔNI7-GFP中的报告子表达盒的位置。第4条线的右 侧(UL3/4：CAG-GFP)显示源自JΔNI5的对照载体(JΔNI6-CAGGFP)中的相 同表达盒的位置。图1A符号表：TR，末端重复；IR，内部重复；UL，独 特的长区域；US，独特的短；编号显示不同IE基因的位置；Δ，缺失；β， 早期启动子；CTRL，绝缘子；LAT P2，长期表达元件；CAG，CMV/肌动 蛋白/球蛋白增强子/启动子/内含子盒。图1B是一组显示报告基因表达的 照片。图1B符号表：HDF，人真皮成纤维细胞；hpi，感染后小时数；dpi， 感染后天数；MOI，感染复数。

图2A-2B是一组比较JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7-GFP感染的细胞中转 基因表达的照片。图2A显示以指定的MOI感染的HDF和U2OS细胞中 的GFP(“EGFP”)和mCherry表达。感染后3天获得荧光显微镜图像。图 2B显示感染的HDF(MOI＝0.5)中转基因表达的持续时间。在感染后1-14 天获得图像。

图3是一组显示JΔNI7-miR302GFP病毒在补充(U2OS-ICP4/ICP27)细 胞上扩张的照片。在感染后3天拍摄照片。

图4是用于将四环素诱导型启动子和Gateway重组盒插入HSV载体 的LAT基因座的靶向质粒的构建的示意图。图4符号表：Zeo，博莱霉素 -抗性基因；Cm，氯霉素-抗性基因；ccdB，用于负选择的毒素基因；LATP2， LAT长期表达元件；CTRL2，LAT基因座的染色质边界/绝缘子元件2。

图5是用于在U2OS-ICP4细胞系中表达ICP27的慢病毒质粒的构建 的示意图。图5符号表：p，启动子；bla，杀稻瘟菌素抗性基因。

图6A是一组显示用QOZHG病毒(ICP4-空；ICP27-空)感染的 U2OS-ICP4细胞和不同克隆U2OS-ICP4/ICP27细胞的ICP27免疫荧光染 色的照片。图6B是一组显示QOZHG病毒(在病毒基因组中从HCMV启 动子-GFP盒的GFP表达)在U2OS-ICP4和U2OS-ICP4/ICP27细胞中的生 长的照片。

图7是本发明的HSV载体(JΔNI7-GFP，中间)，JΔNI7-GFP的LAT区 (顶部)，和野生型HSV的LAT区(底部)的示意图。

图8是本发明的JΔNI7-GFP HSV载体的LAT区的序列。

图9A-9C.载体基因组结构和用于病毒生产的补充细胞。(图9A) KOS-37BAC(24)中的野生型HSV-1KOS基因组和IE基因缺失的衍生物 JΔNI2，JΔNI3和JΔNI5的基因组的示意性表示。UL，独特的长区段；US， 独特的短区段。开放框：末端和内部的反相重复。BAC元件，包括氯霉素 -抗性基因和β-半乳糖苷酶表达盒，位于UL37-UL38基因间的区域中的loxP位点之间(Gierasch等人，J.Virol.Methods 135，197-206(2006))。将 KOS-37BAC及其衍生物中的US区与HSV基因组的标准表示反向比较。 JΔNI构建体中的缺失由黑色框和Δ符号表示；将ICP47启动子和翻译起始 密码子移除作为接合处(joint)缺失的部分。通过启动子替换(ICP0，ICP27) 或TAATGARAT缺失(ICP22)转变为早期表达动力学的IE基因由阴影框和 ICP编号之前的β符号表示。所有JΔNI重组子在gB基因中含有高度激活 N/T突变(Uchida等人，J.Virol.84，12200-09(2010))和在ICP4基因座中 的泛素C启动子(UbCp)-mCherry盒；mCherry盒的SV40 polyA区由小的 图案框表示。(图9B)补充细胞的蛋白质印迹分析。在24hpi收获未感染的 细胞和以1的MOI用QOZHG(左)或JΔNI5病毒(右)感染的细胞，并且制 备提取物用于凝胶电泳。印迹用针对ICP4，ICP27，或作为上样对照的α- 微管蛋白的抗体探测。(图9C)JΔNI2和JΔNI5病毒在U2OS，U2OS-ICP4， U2OS-ICP4/27，和Vero-7b细胞中的生长。以0.001的MOI感染细胞并且 每天从一式三份的孔中收获细胞外病毒，并在U2OS-ICP4/27细胞上测定 滴度。

图10A-10B.用等量gc或PFU感染后的相对核病毒DNA水平。将 HDF用指定的JΔNI载体以5,000gc/细胞(图10A)或1PFU/细胞(图10B) 感染。在2hpi，分离核DNA并且通过用于相对细胞18S rRNA基因归一 化的gD基因的qPCR确定相对病毒gc数量。

图11A-11D.在非补充细胞中的JΔNI细胞毒性和病毒基因表达。(图 11A)体外细胞毒性测定。以25,000gc/细胞感染HDF和Vero细胞并且在 5dpi在一式三份的孔中通过MTT测定测量细胞存活力。绘制的值表示病 毒-感染相对空白感染的细胞的平均比例。带有星号的括号表示JΔNI2和 JΔNI3感染的Vero细胞之间和JΔNI3和JΔNI5感染的Vero细胞之间的统 计学显著的差异(p＜0.05)。(图11B).HDF中的IE基因产物的蛋白质印迹 分析。以1PFU/细胞用KOS，QOZHG或JΔNI病毒感染细胞并且在24hpi 制备提取物。将印迹用针对指定的IE基因产物或作为上样对照的α-微管 蛋白的抗体探测。(图11C)通过qRT-PCR测量的JΔNI IE基因表达。用指 定的病毒以1,000gc/细胞感染HDF。在12hpi分离mRNA并反转录用于 qPCR确定顶部列出的基因的cDNA水平。将表达相对18S rRNA水平归 一化并且相对JΔNI2感染的细胞显示。(图11D)对早期(上图)和晚期基因(下 图)的表达的qRT-PCR分析。感染HDF并如(图11C)中那样进行处理。ICP6 可以被认为是延迟的IE基因并且在本文中被归类为早期基因，因为据报 道，与VP16或ICP4相比，其表达更依赖于ICP0(Desai等人，J.Virol.67， 6125-35(1993)；Sze等人，Virus Res.26，141-52(1992)；Harkness等人，J.Virol.88(12)6847-61(2014))。

图12A-12D.JΔNI感染的HDF中的报告基因表达。(图12A)mCherry 荧光。以指定的gc/细胞感染细胞并且在24hpi拍照。(图12B)相对mCherry mRNA水平。以5,000gc/细胞感染HDF并且在6hpi收获用于mRNA分 离，逆转录和qPCR，如图11C中。(图12C)U2OS细胞中的mCherry荧 光。以1,000gc/细胞感染细胞并在24hpi拍照。(图12D)在JΔNI5感染的 HDF中诱导mCherry表达。以指定的gc/细胞感染细胞，在24h用QOZHG 以5,000gc/细胞进行超感染，并在24h后拍照。

图13A-13D.JΔNI6GFP和JΔNI7GFP基因组结构和报告基因表达。(图 13A) JΔNI7GFP含有在LATP2长期表达/增强子区域之间的2-kb LAT内含 子区域内的CAG启动子-EGFP表达盒和在内含子中的下游CTCF-结合基 序(CTRL2)。LATP2从LAT转录起始位点延伸至2-kb内含子内。JΔNI6GFP 在UL3和UL4基因之间含有相同的CAG启动子-EGFP表达盒。CAGp-EGFP盒的兔β-球蛋白polyA区域由小的图案框表示。(B-D)感染 的HDF中的EGFP和mCherry表达。(图13B)用JΔNI6GFP或JΔNI7GFP 病毒以不同gc/细胞感染细胞并且在3dpi使荧光可视化。(图13C)用 JΔNI6GFP或JΔNI7GFP载体以12,500gc/细胞感染HDF并且3或5d后收 获用于2个报告基因的mRNA提取和qRT-PCR分析。在第3天显示相对 于JΔNI6GFP感染的细胞的相对于18S rRNA归一化的表达。(图13D)用 JΔNI6GFP或JΔNI7GFP病毒以25,000gc/细胞感染HDF并且在7，14和28dpi将EGFP荧光拍照。

图14A-14C.LAT基因座元件对来自JΔNI7GFP的EGFP表达的影响。 (图14A)CTRL1(ΔC1)，CTRL2(ΔC2)或LATP2(ΔLP2)分别或组合缺失的 JΔNI7GFP和衍生物的基因组表示。JQ673480中的位置8978-9161的缺失 包括CTRL1，并且JQ673480中的位置5694-5857的缺失包括CTRL2。这 些缺失包括一些CTCF结合基序外的碱基。(图14B)感染的HDF中的报告基因表达。用指定的病毒以12,500gc/细胞感染细胞，并且在3dpi记录荧 光。(图14C)用JΔNI7GFP，LAT元件缺失的衍生物，或JΔNI6GFP感染 的HDF中的相对EGFP mRNA水平；通过缩写名称鉴别病毒。以12,500gc/ 细胞感染细胞并且在3dpi处理以用于qRT-PCR分析。相对18S rRNA将 表达水平归一化，并且相对于JΔNI7GFP感染的细胞的水平显示。

图15A-15D.位于病毒基因组中其他地方的LAT序列的抗沉默活性。 (图15A)JΔNI9和JΔNI10载体的构建。将包括CTRL1，LATP2和CTRL2 的XhoI片段从JΔNI5基因组中去除，并且在UL45和UL46之间引入GW 重组盒以产生JΔNI9GW或在UL50和UL51之间引入GW重组盒以产生 JΔNI10GW(上部)。相同的XhoI位点用于从JΔNI7GFP分离含CAGp-GFP 的LAT片段(下部左侧)。将XhoI片段克隆入pENTR1A(下部右侧)并且通 过attL/attR重组利用各自的GW盒(LR反应)转至JΔNI9GW或JΔNI10GW 中，以分别产生JΔNI9LAT-GFP和JΔNI10LAT-GFP。作为对照，没有LAT 序列的CAGp-GFP盒经由pENTR1A中间体重组入JΔNI9GW或 JΔNI10GW的GW基因座，产生JΔNI9GFP和JΔNI10GFP。(图15B)用JΔNI9 或JΔNI10病毒感染的HDF中的报告基因表达。用指定的病毒以12,500gc/ 细胞感染HDF。在3dpi记录EGFP和mCherry荧光。(图15C)如在之前 的附图中，通过qRT-PCR确定的在感染的HDF中的EGFP mRNA水平。 显示相对于JΔNI9GFP或JΔNI10GFP感染的细胞的水平。与上述 JΔNI10LAT-GFP的构建类似，通过将来自JΔNI7ΔC12LP2-GFP的XhoI LAT 片段转至JΔNI10GW的GW位点中，构建JΔNI10ΔC12LP2-GFP。(图15D) CTRL和LATP2二者从JΔNI10LAT-GFP缺失对转基因表达的影响。以 12,500gc/细胞感染HDF并且在3dpi记录EGFP和mCherry荧光。

图16A-16D.在其他非补充细胞中的自JΔNI载体的报告基因表达。(图16A)将顶部列出的细胞用JΔNI6GFP或JΔNI7GFP以图下方指定的gc/细胞 感染。在3dpi记录EGFP和mCherry荧光。(图16B)在3dpi通过qRT-PCR 分析测量如在(图16A)中那样感染的细胞中的EGFP基因表达。相对于 JΔNI6GFP感染的细胞，显示相对于18S rRNA归一化的结果。(图16C)用 JΔNI6GFP或JΔNI7GFP病毒以50,000gc/细胞感染hMDSC并且在14和 28dpi将EGFP荧光拍照。(图16D)在用JΔNI10GFP或JΔNI10：LAT-GFP 以12,500gc/细胞感染3d后hEK，hPAD和hHEP细胞中的EGFP mRNA 水平的qRT-PCR测定。相对于JΔNI10GFP感染的细胞，显示归一化的表 达。

图17通过图表显示从JΔNI5构建JΔNI8。

图18显示关于以1基因组拷贝(gc)/细胞感染后，JΔNI8相对于JΔNI5 在补充细胞(U2OS-ICP4/27)中的生长的数据。上图显示报告基因表达 (mCherry)，而下而的左图以噬斑形成单位(PFU)报告病毒产量，并且下而 的右图以基因组拷贝(gc)报告病毒产量。

图19显示证明与从JΔNI5相比，在补充细胞中病毒基因更早从JΔNI8 表达的数据。在每个图中，下部线条表示JΔNI5的数据，而上部线条表示 JΔNI8的数据。通过qRT-PCR收集数据并且表达为在感染后6小时(hpi) 相对于JΔNI5数据点的倍数差异。

图20通过图表显示JDNI7GFP(也称为JΔNI7GFP)和JDNI8GFP(也称 为JΔNI8GFP)的基因组结构。

图21显示证明用等量的JΔNI8和JΔNI5(表示为gc)感染人真皮成纤 维细胞(HDF)细胞导致核中等量的病毒DNA的数据。数据代表感染后两小 时(hpi)。

图22显示比较用不同HSV载体以两个M.O.I.感染的HDF的细胞存 活力(MTT)的数据。每个图中下部的-X-线表示JΔNI5的结果，而每个图中 上部-X-线表示JΔNI8的结果。

图23显示比较用不同HSV载体以不同数量的病毒基因组拷贝/细胞感 染的HDF的细胞存活力分析(MTT)的数据。对于左图(12500gc/细胞)， JΔNI5的M.O.I.是5PFU/细胞，而JΔNI8的M.O.I.是18PFU/细胞。对于 右图(25000gc/细胞)，JΔNI5的M.O.I.是11，而JΔNI8的M.O.I.是33。每 个图中的下部-X-线表示JΔNI5的结果，而每个图中的上部-X-线表示JΔNI8 的结果。

图24表示比较在六种细胞类型(HDF，人新生儿角质形成细胞，人神 经干细胞，Vero，人前脂肪细胞，和人肝细胞)中用KOS，JΔNI5和JΔNI8 感染的细胞的存活力的数据。使用25,000gc/细胞进行MTT测定，在感染 后5天(dpi)报告数据。

图25显示在感染后三天比较以指定的gc/细胞用JΔNI7GFP和 JΔNI8GFP感染的人真皮成纤维细胞(HDF)之间的报告基因表达(mCherry 或增强型绿色荧光蛋白(EGFP))的剂量响应数据。

图26显示比较以25,000gc/细胞用JΔNI7GFP和JΔNI8GFP感染的人 真皮成纤维细胞(HDF)之间的报告基因表达(mCherry或EGFP)的时间进程 数据。

图27显示比较用12,500gc/细胞或25,000gc/细胞的JΔNI7GFP或 JΔNI8GFP感染后三天人新生儿角质形成细胞的报告基因表达(mCherry或 EGFP)的实验结果。

图28显示比较用6250gc/细胞的JΔNI7GFP或JΔNI8GFP感染后三天 大鼠背根节(DRG)神经元的报告基因表达(mCherry或EGFP)的实验结果。

图29显示研究用JΔNI7GFP感染的神经细胞中的转基因表达(mCherry 或EGFP)的实验结果。顶部，在指定的感染后天数(dpi)的EGFP和mCherry 荧光的分开的(左侧；40x)或合并的(中间，右侧；20x)图像；底部，在15dpi 分开的和合并的图像(10x)。

图30是pCX4Hyg-Cre的示意图

图31是产生pCX4Hyg-Cre的示意性表示。

图32显示比较如通过定量逆转录(RT)-PCR确定的JΔNI7GFP和 JΔNI6GFP感染的HDF细胞之间的EGFP mRNA水平的数据。

发明详述

以下与各种HSV载体技术相关的专利和出版物通过引用结合于本文。 美国专利号5,658,724涉及ICP4和ICP27缺陷的HSV株和它们的生产、 生长和使用方法。美国专利号5,804,413涉及包含编码ICP4，ICP27和ICP0 的DNA的细胞系。美国专利号5,849,571涉及潜伏活性疱疹病毒启动子和 它们的用途。美国专利号5,849,572涉及含有LAT启动子的HSV-1载体。 美国专利号5,879,934涉及在ICP4和ICP27基因内包含基因组突变以致 ICP4和ICP27基因产物缺陷的重组HSV载体。美国专利号5,998,174涉 及制备HSV载体的方法。美国专利号6,261,552涉及包含在天然 TAATGARAT序列内具有缺失或突变的HSV基因组的HSV载体，其中所 述缺失或突变导致当所述基因组在含有HSV ICP4基因产物的细胞内时， 所述基因组内的天然立即早期基因的表达动力学延迟。美国专利号 7,078,029涉及具有TAATGARAT序列的突变的基因组的HSV，以致，在 ICP4基因产物存在下，天然立即早期基因以延迟的动力学从基因组表达。 美国专利号7,531,167涉及仅在ICP4，ICP27，和UL55基因中包含缺失的 HSV载体。美国专利申请公开号2013/0096186涉及包含突变体gB和/或 突变体gH糖蛋白的HSV载体。国际专利申请公开号WO 1999/06583涉 及包含包括非天然配体的被膜的HSV。

在一个实施方案中，本发明提供在非补充细胞中不表达毒性的天然 HSV基因并且能够持续表达转基因的单纯疱疹病毒(HSV)载体。例如，本 发明的HSV载体可以在培养的人真皮成纤维细胞(HDF)细胞中表达转基 因达至少14天，如至少28天，并且优选至少60天。希望的是，这样从 本发明的载体表达转基因在此种细胞内不存在可测量的ICP0基因产物，如在此种细胞内不存在任何ICP0基因产物的情况下发生。在特别的实施 方案中，根据本发明的具有被插入到LAT P2元件和CTRL2元件之间并且 具有CTRL1和CTRL2二者的LAT区中的转基因(例如，编码增强型绿色 荧光蛋白(EGFP)或其他标志物)的载体，可以以如感染后七天通过定量 RT-PCR确定的，具有另外的相同的遗传突变但其中该转基因插在U

例如，本发明的HSV载体可以包含基因组，所述基因组包含转基因， 所述转基因被插入(a)在潜伏相关转录体(LAT)基因区内，(b)在ICP4基因座 (并且优选地仅一个，其中接合处缺失，如本文讨论的)内和/或(c)在载体的 基因组内，与基因组内的一种或多种绝缘子序列可操作相连。优选地，所 述载体不表达ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47作为立即早期基因(尽 管在一些实施方案中，ICP47的表达可以是希望的)。不希望受理论限制， 据信，根据转基因内启动子的活性，本发明的载体可以在其可以感染的任 何类型的哺乳动物(特别是人)细胞中表达转基因而没有与病毒基因表达相 关的细胞毒性。本发明的载体可以以分离的DNA，细胞内DNA，或包装 在病毒被膜内存在。

可以使用使得本发明的载体在非补充细胞内不能表达ICP0、ICP4、 ICP22、ICP27和ICP47作为立即早期基因的任何合适的方法。例如，可 以将本发明的载体的基因组改造为包含这些基因中的一种或全部的失活 突变(例如，缺失)(例如，ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47基因中的 一种或多种的编码序列内的或整个编码序列的缺失(优选包含至少ICP0， ICP4和ICP27的失活缺失，更优选地包含ICP0，ICP4，ICP27和ICP47 的失活缺失)，或还备选地包括所述基因的启动子或其他调节序列)。备选 地，可以将这些HSV基因中的一种或多种改造成被作为早期或晚期基因 表达。例如，可以将本发明的载体的某些实施方案的基因组改造成保留这 些基因中的一种或多种的编码序列，但用使得所述基因作为早期(β)或晚期 (γ)而非立即早期(α)基因表达的启动子替代其启动子。例如，这样的基因 可以被置于响应于ICP4的启动子的控制下(优选至少关于ICP22的方法， 以致表达ICP22为早期基因，而不是立即早期基因)。以早期(β)动力学表 达这样的基因的合适的启动子是HSV tk启动子。ICP22启动子可以通过截 短，即缺失调节序列(包括TAATGARAT)，转化为早期动力学。可以缺失 整个ICP47启动子和起始密码子。备选地，在一些实施方案中，ICP47基 因可以作为立即早期基因表达以保护感染的细胞免于免疫识别(Hill等人， Nature 1995，375(6530)：411-415；Goldsmith等人，J Exp Med.1998；187(3)：341-348)。

除了ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47表达的干扰，希望的是， 本发明的载体也不表达UL41(即，宿主关闭(vhs)基因)。UL41是RNA酶， 其降解很多宿主和病毒mRNA，引起宿主细胞蛋白合成的快速关闭，并且 作为病毒粒子被膜成分进入细胞。因此，例如，编码UL41的基因可以从 本发明的载体的基因组缺失。不希望受理论限制，据信，该操作通过节约 补充的ICP4和ICP27 mRNA另外增强本发明的载体在补充细胞中生长的 能力，并且通过节约转基因mRNA增强转基因在非补充细胞中的表达。

应该认识到，本领域技术人员已知若干HSV株的基因组序列(例如， MacDonald，J.Virol，86(11)：6371(2012)；McGeoch，J.Gen.Virol.，69： 1531-1574(1988)；GenBank登陆号JQ673480；NCBI参考序列： NC_001806.1；MacDonald，J.Virol.86(17)：9540(2012)；GenBank登陆号 JX142173，其通过引用结合于本文中)。因此，HSV基因和基因座的序列 的操作在普通技术水平内。还应该注意，这些公开的序列仅仅是示例性的， 并且其他HSV株或变体可以用作在改造本发明的载体方而的来源基因组。

此外，本发明的载体的基因组可以包含细菌人工染色体(BAC)盒。包 括所述BAC盒促进本发明的载体的基因组在细菌内的增殖和操作。BAC 盒可以包括有助于使用细菌菌株的细菌表达的序列，例如，可选基因，如 赋予细菌对抗生素或毒素的抗性的基因(例如，优选氯霉素，但也可以使用 其他抗性基因(例如，四环素，氨苄青霉素，博莱霉素等的抗性基因))。BAC 盒还可以包括在真核启动子，如组成型哺乳动物启动子(例如，SV40，RSV， CMV，泛素C(UbC)，CAG，或β-肌动蛋白启动子等)的控制下的报告基 因(例如，LacZ(编码β-半乳糖苷酶)，或编码荧光蛋白的基因(例如，g中(编 码绿色荧光蛋白)，y中(编码黄色荧光蛋白)，r中(编码红色荧光蛋白)，及 其类似物(例如，编码iRFP，EGFP等))。

BAC盒可以在任何合适的位置，如载体基因组内的UL37-UL38基因 间区域，置于本发明的载体的基因组中(例如，Gierash，J.Virol.Meth.，135： 197-206(2006)和Morimoto，Microbiol.Immunol.，53：155-161(2009))。此 外，希望的是，BAC盒的旁侧是如通过位点特异性重组酶识别位点/共有 序列(例如，由酶如cre，dre，flp，KD，B2，B3，R等识别的那些)促进去 除BAC盒的序列。因为BAC序列被证明减少在培养的细胞中的病毒生长 (例如，Gierash，J.Virol.Meth.，135：197-206(2006))，所以如果需要，包括 所述位点有助于BAC盒的切除。此外，切除BAC盒可以增加载体整合一 种或多种转基因的能力，因为BAC盒为约11kb。将理解的是，本发明的 载体还可以具有重组酶的共有序列(例如，loxP)，特别是对于HSV基因组 不是天然的共有序列，例如作为使用表达用于切除BAC盒的适当的位点 特异性重组酶的细胞除去BAC盒的结果，由此在HSV基因组内(例如， 在UL37-UL38基因间的区域内，如果这是BAC盒插入的位置)留下重组 酶共有序列的单个拷贝。

如上文所述，本发明的载体可以包括至少一种转基因，其被插入在 HSV载体基因组内，与一种或多种绝缘子序列可操作相连。通过“可操作 相连”，要理解，一种或多种绝缘子序列允许转基因在HSV基因组内另外 存在的遗传元件(即，“基因”)转录沉默的细胞环境内表达。不希望受任何 特别理论限制，据信，这样绝缘子序列防止在这样的绝缘子序列的位点处 和在其约1kb至约5kb内形成异染色质(其如果形成则使基因表达沉默)。 因此，用于本发明的载体的绝缘子序列通常是干扰异染色质的结合或形成 的序列，否则所述异染色质会沉默转基因的表达。合适的绝缘子序列的非 限制实例包括HSV染色质边界(CTRL/CTCF-结合/绝缘子)元件CTRL1和 CTRL2(其对于LAT基因座可以是天然的，如本文所述，或移至基因组内 的异位位置)，鸡超敏位点4绝缘子(cHS4)，人HNRPA2B1--CBX3泛染色 质开放元件(UCOE)，和来自人干扰素β基因(IFNB1)的支架/基质附着区 (S/MAR)(Emery，Hum.Gene Ther.22，761-74(2011)；Antoniou等人，Hum. Gene Ther.24，363-74(2013))。

除了将转基因插入在对于HSV基因组来说是天然的绝缘子序列(如 LAT区内的CTRL1和CTRL2序列)附近之外，绝缘子序列可以在任何合 适的位点插入载体基因组中。这些绝缘子/边界元件可以通过标准方法引入 到本发明的载体的基因组中，并且可以被包括在与转基因相同的盒内，或 分别引入基因组中，以致旁侧或以其他方式与给定的转基因盒可操作相连。 因此，可能的是插入这样的基因盒，所述基因盒包括，例如，一种或多种 在功能上与在LAT区中在转基因旁侧天然发现的那些类似的或以其他方 式与转基因可操作相连的异位绝缘子序列。将理解，本发明的载体可以包 括与多个绝缘子序列(包括在相对于LAT的异常位点处的)可操作相连的多 个转基因。在其中一种或多种转基因被插入在不同于LAT的位点处，并且 与CTRL1和/或CTRL2可操作相连的实施方案中，理想的是使在LAT内的CTRL1和/或CTRL2序列从LAT缺失或使其突变，以最小化或消除本 发明的载体的LAT内的天然序列和被改造成与异位(非-LAT)位点内的转 基因可操作相连的那些之间的重组事件。当CTRL1和CTRL2保留在LAT 内或被异位移动时，用于将转基因插入在本发明的载体的基因组中的优选 位点在CTRLl和CTRL2之间(例如，在CTRL1和CTRL2各自的约1-4kb 内，其中CTRL1和CTRL2在转基因旁侧)。

在本发明的载体内，所述绝缘子序列中的一种或多种与转基因可操作 相连，以致转基因与基因沉默隔离并且被表达。通常，在基因组内转基因 和绝缘子序列应该紧邻，如分隔以小于约5kb，或小于约4kb，或小于约 3kb，或小于约2kb，或小于约1kb。还可能需要表达盒(包括转基因)在 功能上在两个绝缘子序列之间，以致所述绝缘子序列在研究的转基因的旁 侧(参见，例如，Emery，Hum.Gene Ther.22，761-74(2011)；Antoniou等 人，Hum.Gene Ther.24，363-74(2013))。

用于在本发明的载体中插入转基因(例如，第一转基因)的一个优选的 位点在载体基因组的LAT基因区内的绝缘子序列之间-具体地插入在分 别位于LAT启动子LAP1的上游(CTRL1)和LAT 2-kb内含子内(CTRL2) 的染色质边界(CTRL/CTCF-结合/绝缘子)元件之间(Amelio等人，J Virol 2006，80(5)：2358-2368；Bloom，Biochim.Biophys.Acta，1799：246-256 (2010))。该区域在本文被称为LAT(基因)区或基因座。因此，希望的是， 本发明的载体的基因组包含(例如，保留)CTRL1和CTRL2(参见图7，顶 部)。不希望受理论限制，据信，CTRL1和CTRL2的存在保护所述区域免 于形成异染色质，并且因此有助于LAT基因区成为表达转基因的特殊位点。 因此，所述载体在非补充细胞中表达插入在LAT基因区中的转基因。在优 选的实施方案中，所述载体包含在LAT基因区内的多个转基因盒，其各自 包含分开的启动子和编码区，并且其中其各自可以是单或多顺反子的。

此外，对于本发明的载体的LAT区(其包含至少一种转基因，如本文 所述)来说优选的是还包含(例如，保留)LATP2或LAP2增强子元件。再次 不希望受理论限制，据信，LATP2或LAP2增强子元件的存在有助于LAT 基因区内的转基因长期表达编码序列的能力(Goins，J.Virol.，73：519-532 (1999)；Lilley，J.Virol.，75：4343-4356(2001))。在特别优选的实施方案中， LAT基因区内的转基因被插入在在LATP2或LAP2增强子元件的下游。 然而，本发明预期这样的实施方案，其中转基因被插入在LATP2或LAP2 增强子元件的上游(相对于LAT转录的方向)。希望的是，在LAT基因区内 所述转基因远离LATP2或LAP2元件(参见，例如，图7，顶部)。

在本发明的载体中插入转基因(例如，第二转基因)的另一优选的位点 是在ICP4基因座内。例如，插入本发明的载体的此基因座内的UbC启动 子控制的转基因可以在海马神经元中产生长期信号，并且在DRG中至少 短期有活性。

转基因还可以与(例如，接近(＜5kb))其他绝缘子序列可操作相连地插 入本发明的载体的基因组内。除了插入在对于HSV基因组来说是天然的 绝缘子序列附近外，绝缘子序列可以在任何合适的位点被插入载体基因组 中。因此，可能的是插入这样的基因盒，所述基因盒包括，例如，在功能 上与在LAT区中在转基因旁侧天然发现的那些类似的异位绝缘子序列。将 理解，本发明的载体可以包括多个转基因。

在插入在本发明的载体中的转基因内，存在至少一个启动子序列和一 个转录的序列，使得所述转录的序列受所述启动子控制。所述转基因内的 启动子可以是控制/调节转录的序列的表达所需的任何启动子。例如，所述 启动子可以是细胞特异性或组织特异性启动子(例如，EOS，OCT4，Nanog (对于ESC/iPSC)，SOX2(对于神经干细胞)，αMHC，Brachyury，Tau，GFAP， NSE，突触蛋白I(对于神经元)，ApoA-I，清蛋白，ApoE(对于肝)，MCK，SMCα-肌动蛋白，肌球蛋白重链，肌球蛋白轻链(对于肌肉)等)，如特异或 优先在限定的细胞类型中(例如，在肝细胞，肺细胞，上皮细胞，心脏细胞， 神经细胞，骨骼肌细胞，胚胎、诱导多能或其他干细胞，癌细胞等内)表达 基因的启动子。用于感觉神经元的优选的启动子包括TRPV1，CGRP和 NF200。在其他实施方案中，插入在本发明的载体中的转基因内的启动子 可以是诱导型启动子(例如，自LAT中分开的启动子或如本领域已知的其 他诱导型启动子的TRE3G结合rtTA3G表达)。当然，插入在本发明的载 体中的转基因表达盒内的启动子可以是组成型哺乳动物启动子，如本领域 已知的(例如，SV40，CMV，CAG，EF1α，UbC，RSV，β-肌动蛋白，PGK 等)。

除了启动子和编码序列，插入本发明的载体的基因组中的转基因还可 以包含其他调节元件。例如，所述转基因可以包括一个或多个用于结合微 RNA的位点。在优选的实施方案中，转基因包含串联的用于所述微RNA 的结合位点，如2，3，4，5或6个串联的位点(四个是典型的)。所述位点 特别是用于所述微RNA的串联结合位点的存在，促进下调某些细胞类型 中的转基因表达。因此，例如，包含希望在癌症或肿瘤细胞中表达的转基 因(其可以对于很多细胞类型是有毒性的)的载体可以包含用于“正常”(即 非恶性)细胞的微RNA的结合位点，以致所述转基因的表达在非恶性细胞 中被抑制。

应该注意，本发明的载体内的转基因可以是单顺反子的(即，编码单个 蛋白或多肽)或多顺反子的(即，编码多个蛋白或多肽)。此外，例如，所述 转基因的转录部分的全部或部分也可以编码非翻译RNA，如siRNA或 miRNA。此外，本发明的载体可以包含多个分开的单顺反子的或多顺反子 的转基因单元(优选地两个分开的转基因单元，但可能更多(例如，三个， 四个，五个或更多个分开的单元))，其各自具有其自己相应的启动子，翻 译的序列或非翻译的RNA序列，及其他调节元件。

如所述的，转基因包括一种或多种转录的序列，其在转基因内的启动 子和任选地其他调节元件的控制下(包括与绝缘子序列可操作相连)表达。 转录的序列可以是希望在给定细胞(其中引入有所述载体)内表达的任何序 列。可以存在于本发明的载体内的转基因中的转录的序列的非限制实例包 括Oct4，Klf4，Sox2，c-Myc，L-myc，显性负性p53，Nanog，Glis1，Lin28， TFIID，GATA4，Nkx2.5，Tbx5，Mef2C，Myocd，Hand2，SRF，Mesp1，SMARCD3，SERCA2a，Pax3，MyoD，Lhx2，FoxG1，FoxP2，Isl1，Ctip2， Tbr1，Ebf1，Gsx2，Srebp2，因子VIII，因子IX，肌养蛋白(Dystrophin)， CFTR，GlyRα1，脑啡肽，GAD67(或其他GAD同种型，例如，GAD 65)， TNF，IL-4，神经营养因子(例如，NGF，BDNF，GDNF，NT-3)，Ascl1，Nurr1，Lmx1A，Brn2，Mytll，NeuroD1，FoxA2，Hnf4α，Foxa1，Foxa2 或Foxa3，任何微RNA或miRNA的组合(例如，hsa-mir-302/367基因簇； hsa-miR200c；hsa-miR369；hsa-mir-124)和/或一种或多种其他非编码RNA (“ncRNA”)或用于在哺乳动物细胞中表达的报告基因，如LacZ(编码β-半 乳糖苷酶)，CAT(编码氯霉素乙酰转移酶)，或荧光蛋白编码基因(例如， GFP，YFP，RFP，及其类似物如iRFP，EGFP等)。

除了前述的，本发明的载体还可以任选地包含插入在除了LAT区之外 的或除了已知绝缘子序列附近的位点的表达盒。所述表达盒的优选位点是 ICP4。例如，当载体包含ICP4基因的完全或失活缺失时，表达盒可以插 入在ICP4缺失的位点中。希望的是，插入在除LAT区之外的位点中的表 达盒的编码序列受组成型哺乳动物启动子(例如，SV40，CMV，CAG，EF1α UbC，RSV，β-肌动蛋白，PGK等)控制，但如果需要，可以使用其他启动 子(如本文讨论的和本领域另外已知的)。一种示例性的表达盒包括构建入 缺失的ICP4基因座中的mCherry的UbCp驱动的表达。当然，所述转基 因也可以编码有治疗兴趣的因子。

除了上述的，希望的是，本发明的HSV载体还包含内部重复(接合处) 区(其包含IR

HSV能够感染多种哺乳动物细胞；因此，本发明的载体具有宽泛的应 用。然而，为了增强感染性，希望的是，本发明的载体的被膜还可以包含 突变体糖蛋白，所述突变体糖蛋白相对于野生型糖蛋白增强感染和/或横向 扩散。备选地或此外，本发明的载体的被膜还可以包含引导HSV通过非 规范受体(non-canonical receptor)进入细胞的突变体糖蛋白。例如，所述突 变体糖蛋白可以是gB，gC，gD，gH或gK；当然，所述载体可以具有多 于一种所述突变体(增强的穿透或扩散)糖蛋白(例如，其中两种、更多种或 甚至全部的组合)。此外，突变所述糖蛋白以增强HSV感染和/或横向扩 散的技术是已知的，并且在本发明的情况下可以使用任何所述技术(参见， 例如，美国专利申请公开号2013-0096186 A1；国际专利申请公开号 WO/1999/006583，Uchida，J.Virol.，84：12200-12209(2010)，Uchida等人，J.Virol.，87(3).1430-42(2013)，和Uchida，Mol.Ther.，21：561-569(2013)， 其通过引用结合于本文中)。此外，本发明的载体的基因组可以包含编码所 述突变体糖蛋白的突变体基因。

实施本发明的示例性的载体“主链(backbone)”在本文中被描述为 “JΔNI5”和“JΔNI8”，理解为，作为“主链”，预期具有或不具有外部控制元 件的转基因可以被插入这些具体载体的LAT区中(参见，例如，图7，顶 部)。

本发明的载体的一个应用是重编程多种细胞类型以产生多能干细胞。 近年来，干细胞已经在生物医药研究的最前沿，并且为理解人发育、遗传 疾病和在再生医疗中产生新的治疗手段提供许多希望。在2006年， Yamanaka和同事发现了通过重编程成人成纤维细胞产生胚胎样干细胞的 方法(Takahashi和Yamanaka，Cell 126：663-76，2006)。命名为诱导多能干 (iPS)细胞的这些新细胞与ES细胞功能相似(Wemig等人，Nature 448： 318-24，2007)，并且当源自人体细胞时(Takahashi等人，细胞131：861-72， 2007；Yu等人，Science318：1917-20，2007)，避开涉及使用人ES细胞的 伦理问题。最初四种重编程基因用于iPS细胞产生(Takahashi和Yamanaka， Cell 126：663-76，2006；Takahashi等人，Cell131：861-72，2007，但用这 些或其他基因重编程的效率仍然有问题，因为低效的基因转移方法。本发 明的载体系统通过将对于很多细胞类型的高转导效率与从单个载体同时 表达多个转基因的能力相结合而解决了该问题。例如，由于五种病毒IE 基因的缺失或改变的表达动力学，本文所述的JΔNI7和JΔNI8载体是复制 缺陷的和无毒性的。因为它们不整合到细胞基因组中，所以所述载体在细 胞分裂期间稀释，提供击中即跑(hit-and-run)的基因递送系统。

为了有助于培养、产生和扩增本发明的载体和产生其贮存物，本发明 的一个方而提供补充细胞系，其补充ICP0和ICP4，希望的是ICP0，ICP4 和ICP27。优选地，ICP0补充在不表达HSV ICP0的情况下实现，以减小 补充细胞内的毒性。因此，根据本发明的优选的补充细胞源自天然补充 HSV ICP0功能的细胞类型，如U2OS细胞(Yao，J.Virol.，69：6249-6258(1995)，其通过引用结合于本文)。可以通过本领域已知方法(例如，通过在 细胞内引入ICP4或ICP4和ICP27表达盒，使得其自基因构建体而非HSV 基因组，如细胞染色体分别表达ICP4和ICP27)将所述细胞改造成表达 ICP4或ICP4和ICP27。希望的是，细胞系分别反式表达ICP4和ICP27。 希望的是，引入的ICP4或ICP4/ICP27编码序列在其同类的病毒启动子的控制下。此外，ICP4和ICP27补充编码序列中的一种或两者可以在所述 细胞内诱导表达以响应于HSV感染。

如上文所述，本发明的载体的实施方案包含BAC，所述BAC的旁侧 是通过位点特异性重组酶识别促进BAC盒的去除的序列。因此，本发明 的补充细胞可以被改造成进一步表达编码适合于载体内的识别序列的位 点特异性重组酶的基因，从而产生重组酶蛋白。因此，本发明的补充细胞 可以酌情表达并产生cre，dre，flp，KD，或B2，B3，R等，或其突变体衍生物。因此，通过所述细胞系使转基因(约11kb)重获空间，并且可以使 病毒生长提高超过10倍，如超过25倍，或超过50倍，如约100倍。与 缺少所述重组酶的细胞相比，提高的病毒生长可以通过标准程序测定(产生 生长曲线)。这涉及以低MOI感染细胞复孔，在感染后不同时间的病毒收 集，和通常通过噬斑测定的产量滴定。

此外，补充细胞系可以被改造成表达编码可选标志物的基因，所述可 选标志物如通常用于改造包装细胞或表达任何其他外源基因的细胞的标 志物。合适的可选择基因包括赋予对新霉素/G418，潮霉素，杀稻瘟菌素， 嘌呤霉素，博莱霉素等的抗性的那些。

将理解，用于将来源细胞类型(例如，U2OS细胞)改造成含有编码HSV ICP4和ICP27蛋白以及其他蛋白(如重组酶和/或可选择基因产物)的表达 构建体的方法对于普通技术人员是已知的。例如，可以将具有可选择标志 物的目的基因亚克隆到慢病毒载体中，用慢病毒载体感染来源细胞，对于 标志物的表达(例如，杀稻瘟菌素抗性)进行选择，并随后确认目的转基因 (例如，HSV ICP27)的表达。

当然，可以增殖和克隆本发明的补充细胞。因此，本发明提供克隆群 体，即，细胞系，其包含如本文中所述的补充细胞系或由如本文中所述的 补充细胞系组成或基本上由如本文中所述的补充细胞系组成。

使用本发明的补充细胞，可以增殖本发明的HSV载体。因此，本发 明提供增殖本发明的HSV载体的方法。根据本发明的方法，将补充细胞 系用载体DNA转染并且随后培养直到噬斑形成。如所述的病毒DNA可以 具有BAC，并且，如果这样，则本发明的细胞可以表达适于从病毒基因组 切除BAC的重组酶(如果希望在包装的载体中不包括BAC)。通过重复地 将感染粒子转移至逐渐增加的大的、新鲜补充细胞群中来扩增病毒群体。 对于这些重复的转移，感染复数(MOI)可以在约0.001pfu/细胞至约0.03 pfu/细胞之间。最后，自90％细胞病变效应的细胞纯化本发明的载体(为包 装的病毒)。

通常，当足够的病毒可以递送至细胞群体以保证细胞而临合适的数量 的病毒时，本发明的HSV载体是最有用的。因此，本发明提供贮存物 (stock)，优选地同源贮存物，其包含本发明的HSV载体。HSV贮存物的 制备和分析是本领域中公知的。例如，可以在含有用HSV载体转导的细 胞的滚筒瓶中制造病毒贮存物。病毒贮存物可以随后在连续的nycodenze梯度上纯化，并分为等分试样并储存直到需要。病毒贮存物在滴度上差异 巨大，这主要取决于病毒基因型以及用于制备它们的方案和细胞系。优选 地，这样的贮存物具有约10

此外，本发明提供包含HSV载体(vector)和载体(carrier)，优选地生理 用载体(carrier)的组合物。所述组合物的载体(carrier)可以是任何适用于所 述载体(vector)的载体(carrier)。所述载体(carrier)通常是液体，但也可以是 固体，或液体和固体成分的组合。理想地，所述载体(carrier)是药用(例如， 生理学或药理学可接受的)载体(carrier)(例如，赋形剂或稀释剂)。药用载 体(carrier)是公知的并且可容易获得。载体(carrier)的选择将至少部分由特 定载体(vector)和用于施用所述组合物的特定方法决定。所述组合物还可以 包含任何其他合适的成分，特别是用于增强组合物的稳定性和/或其最终用 途的成分。因此，存在多种本发明的组合物的合适制剂。以下制剂和方法 仅是示例性的，并且不以任何方式限制。

适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以 含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和使得制剂与预期接受者的血液等渗的 溶质，以及可以包括以下各项的水性和非水性无菌悬浮液：悬浮剂，增溶 剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。制剂可以以单位剂量或多剂量密封的容器， 如安瓿和小瓶存在，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使 用前即刻加入无菌液体赋形剂例如水以用于注射。临时注射溶液和悬浮液可以制备自之前描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂。

此外，组合物可以包含另外的治疗性或生物活性药剂。例如，可以存 在用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子，如布洛芬或类固醇， 可以是组合物的部分以减少与体内施用载体相关的肿胀和炎症以及生理 痛苦。可以与组合物方法一起施用免疫系统抑制剂，以减小对载体自身或 与疾病相关的任何免疫应答。备选地，免疫增强剂可以包括在组合物中以 上调身体对于疾病的天然防御。可以存在抗生素，即，杀微生物剂和杀真菌剂，以减少与基因转移步骤及其他病症相关的感染风险。

使用本发明的载体(以及包含所述载体的贮存物和组合物)，本发明提 供在有核细胞，特别是非补充细胞内表达转基因的方法。根据该方法，本 发明的载体在适于载体感染细胞的条件下暴露于细胞。一旦细胞被感染， 插入在载体的LAT区内的转基因将在细胞内转录(表达)，前提是转基因内 的启动子是在细胞中有活性的启动子，并且转基因不被另一调节机制(例如， 本文中讨论的微RNA)抑制。换句话说，本发明的载体在哺乳动物细胞内充当基因转移和表达载体。

如所需的，本发明的方法可以用于在体内或体外在细胞内表达转基因。 对于体内使用，细胞可以是任何类型的所需细胞，如外分泌的分泌细胞(例 如，腺体细胞，如唾液腺细胞，乳腺细胞，汗腺细胞，消化腺细胞等)，激 素分泌腺细胞(例如，垂体细胞，甲状腺细胞，副甲状腺细胞，肾上腺细胞 等)，外胚层衍生细胞(例如，角质化上皮细胞(例如，构成皮肤和毛发)，湿 分层屏障上皮细胞(例如，角膜，舌头，口腔，胃肠道，尿道，阴道等的)， 神经系统的细胞(例如，外周和中枢神经元，神经胶质等))，中胚层衍生的 细胞，很多内部器官的细胞(如肾，肝，胰腺，心脏，肺)骨髓细胞，和肿 瘤内的或另外的癌细胞。优选的，适于由本发明的载体感染的细胞的非限 制实例包括肝细胞，肺细胞，上皮细胞，心脏细胞，肌肉细胞，干细胞， 和癌细胞。

将观察到，当在体内使用时，当载体内的转基因编码一种或多种预防 或治疗活性蛋白，多肽，或其他因子(例如，非编码RNA(ncRNA)如siRNA 或miRNA)时，本发明的方法可以治疗受试者内的疾病或病症。因此，本 发明提供治疗受试者中疾病或病症的方法，其包括以足以感染受试者的细 胞的量，并且在足以感染受试者的细胞的位置向受试者施用本发明的载体， 以致转基因在受试者的细胞内表达，并且其中所述转基因编码一种或多种 预防或治疗活性蛋白，多肽或ncRNA。例如，所述疾病或病症可以是一种 类型的癌症，其中所述转基因可以编码增强肿瘤杀伤活性的药剂(如 TRAIL或肿瘤坏死因子(TNF))。作为另外的非限制性实例，转基因可以编 码适于治疗如以下的病症的药剂：肌肉萎缩症(合适的转基因编码肌养蛋 白)，心血管疾病(合适的转基因包括，例如，SERCA2a，GATA4，Tbx5，Mef2C，Hand2，Myocd等)，神经退行性疾病(合适的转基因包括，例如， NGF，BDNF，GDNF，NT-3等)，慢性疼痛(合适的转基因编码GlyRα1， 脑啡肽，或谷氨酸脱羧酶(例如，GAD65，GAD67，或另一种同种型)，肺 疾病(例如，CFTR)，或血友病(合适的转基因编码，例如，因子VIII或因 子IX)。

在其他实施方案中，可以体外使用本发明的方法以引起培养物中细胞 内的转基因表达。此外，可以用本发明的方法体外感染任何细胞类型，如 干细胞和成纤维细胞，如人真皮成纤维细胞(HDF)或人肺成纤维细胞(HLF)。其他用于在体外使用的优选的细胞类型包括角质形成细胞，外周 血单核细胞，造血干细胞(CD34+)，或间充质干/前体细胞。在一个实施方 案中，转基因编码一种或多种可以影响细胞的分化的因子。例如，Oct4， Klf4，Sox2，c-Myc，L-Myc，显性负性p53，Nanog，Glis1，Lin28，TFIID， mir-302/367，或其他miRNA中的一种或多种的表达可以引起细胞成为诱 导多能干(iPS)细胞。还参见，Takahashi和Yamanaka，Cell，126：663-676 (2006)；Takahashi，Cell，131：861-872(2007)；Wernig，Nature，448：318-324 (2007)；和Yu，Science，318：1917-1920(2007)，其公开内容通过引用结 合于本文中。备选地，本发明的载体内的转基因可以编码用于转分化细胞 的因子(例如，GATA4，Tbx5，Mef2C，Myocd，Hand2，SRF，Mesp1， SMARCD3(用于心肌细胞)；Ascl1，Nurr1，Lmx1A，Bm2，Myt1l，NeuroD1， FoxA2(用于神经细胞)，Hnf4，Foxa1，Foxa2或Foxa3(用于肝细胞)中的 一种或多种。

在实践涉及用本发明的载体，组合物，或贮存物体内或体外感染细胞 的本发明的方法中，细胞可以是被希望表达转基因的任何哺乳动物有核细 胞。HSV具有广泛的感染性，并且，如本文所述的，本发明的载体可以被 改造成通过突变病毒被膜糖蛋白来改变其天然趋向性(tropism)并且增强感 染性。因此，载体可以用于感染很多哺乳动物物种的细胞。据信，本发明 的方法可以应用于农业，如用于表达外源基因或为动物如牛、马、绵羊、 山羊、猪等中补充缺陷基因。类似地，本发明的方法可以用于兽医的范畴 内，用于伴侣动物，如猫、狗等。

当然，本发明的方法也可以体内用于人，以在医疗环境中提供预防或 治疗活性药剂或因子的表达。因子(通过表达本发明的载体内的一种或多种 转基因补充的)可以是外源的，或是补充遗传缺陷的因子。

以下实施例进一步描述本发明，但是，当然，不应该被认为以任何方 式限制其范围。

实施例1

本实施例描述了用于复制和产生本发明的HSV载体的补充细胞系的 开发。

HSV的一些立即早期(IE)基因对于病毒复制是关键的，但这些及其他 IE基因在多种细胞类型中具有毒性效应。当移除这些基因阻止载体毒性时， 必须提供关键产物以产生感染性病毒颗粒。改造基于U2OS人骨肉瘤细胞 的新型细胞系，以条件性表达关键IE基因ICP4和ICP27。通过逆转录病 毒介导的插入将这些基因在它们的同源病毒启动子的控制下引入。由此， 这些基因可以保持沉默，直到HSV感染将HSV被膜蛋白VP16递送至 核，在那里其通过激活其启动子促进整合的ICP4和ICP27基因的高水平 表达。因此，在HSV感染前，这些基因可以稳定维持在改造的U2OS细 胞内，而没有不适的毒性。HSV生长还依赖于ICP0的表达，但该蛋白抑 制细胞复制，引起细胞循环捕获和程序性细胞死亡。显著地，U2OS细胞天然补充ICP0功能，并且因此，引入ICP4和ICP27足以为有效产生缺失 所有三个IE基因的载体提供细胞环境。该新型的改造的细胞系是稳定的， 在培养中生长良好，并且可以用于临床产生无毒性HSV载体。

将U2OS-ICP4/27细胞和7b(Vero-ICP4/ICP27)细胞用E1 G6 (ΔICP4：：HCMVp-eGFP/ΔICP27/β22/β47)或JDQOZEH1 (ΔICP4/ΔICP27/ΔICP22/ΔICP0：：HCMV-eGFP)病毒感染。3天后，将细胞 上清中的病毒在U2OS-ICP4/27细胞上测定滴度。

数据显示，E1G6(缺失ICP4和ICP27；无ICP22和ICP47表达)在两 种细胞系上生长，而JDQOZEH1(缺失ICP0，ICP4，ICP27和ICP22)仅能 够在U2OS-ICP4/27细胞上生长。7b上清中的JDQOZEH1滴度可能表示 来自7b感染的残留输入。

实施例2

该实施例描述了HSV载体的实施方案，所述HSV载体包含基因组， 所述基因组包含插入在LAT基因区内的转基因，其中所述载体不表达ICP0， ICP4，ICP22，ICP27和ICP47作为立即早期基因。

载体基因组(图1A)在UL37-UL38基因间的区域中含有可去除Cre的 细菌人工染色体(BAC)盒，允许在细菌中增殖和操作。其删除将U

图1A显示在UL中具有BAC序列的完全HSV-1基因组的结构(顶部)， 和基础载体构建体。LAT和UL3-UL4区域在下方放大，并且指示了 CAG-GFP插入的备选位置。图1B显示自感染的HDF中的载体基因组中 的备选位置的GFP表达。该载体内的GFP基因编码EGFP。

实施例3

该实施例列出不同HSV载体构建体的结构和性质。

*在缺失的ICP4基因座中都具有相同的mCherry表达构建体

**在HDF(人真皮成纤维细胞)中，在3dpi

实施例4

该实施例表明在JΔNI7-GFP和JΔNI6-CAGGFP感染的细胞中的转基 因表达。JΔNI7-GFP中CAG-GFP的位置显示在图1中，为LAT：CAG-GFP； 其在JΔNI6-CAGGFP中的位置显示在图1中，为UL3/4：CAG-GFP。此外， JΔNI7-GFP HSV的LAT区的序列展示在图8中(SEQ IDNO：1)，包括LAT 区内的不同遗传元件的序列。将注意到，这些载体内的GFP编码EGFP。

在U2OS-ICP4/ICP27细胞上测定病毒贮存物的生物滴度，并且基因组 拷贝(gc)滴度通过针对病毒糖蛋白D基因的定量实时PCR测定。对于 JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7-GFP的颗粒(gc)-与-噬斑形成单位(PFU)比率是相 当的。参见实施例8，表2。

将非补充人真皮成纤维细胞(HDF)和ICP0-补充U2OS细胞用每种病毒 感染以比较他们的转基因表达。在LAT基因座中含有CAG-GFP盒的 JΔNI7-GFP，在HDF中显示强的，病毒剂量依赖性GFP表达，而最高剂 量的JΔNI6-CAGGFP仅获得最小GFP表达(图2A，左图，EGFP)。 JΔNI7-GFP感染的HDF中的GFP表达在感染后2周仍然可检测(图2B， EGFP)。然而，从HDF中的任一病毒观察到很少的或观察不到mCherry 表达(图2A，2B，mCherry)，提示，LAT基因座外的基因在HDF中是沉 默的。相比之下，对于U2OS细胞中低MOI的两种病毒观察到大量的GFP 和mCherry表达(图2A，右栏)，与这些细胞的ICP0样活性阻止HDF中存 在的非LAT基因座的沉默的解释一致。总之，这些结果强烈表明，LAT 基因座是用于从复制缺陷的ICP0-缺陷的载体表达转基因的优选的位点。

实施例5

该实施例表明在U2OS-ICP4/ICP27细胞中生产JΔNI7-miR302GFP BAC的两种分离物。

JΔNI7-miR302GFP BAC构建体在LAT基因座中携带miR302s/367簇 的表达盒(Anokye-Danso，Cell Stem Cell，8：376-388(2011))替代典型的 Yamanaka体细胞重编辑基因混合物(OKSM：Oct4，Klf4，Sox2，c-Myc) (Takahashi和Yamanaka，Cell，126：663-676(2006)；Takahashi，Cell，131： 861-872(2007)。miR302s/367基因簇位于连接EF1α启动子与GFP编码序 列的内含子中。纯化JΔNI7-miR302GFP BAC DNA的两种分离物，并且引 入U2OS-ICP4/ICP27细胞中以产生病毒离子，用于检查病毒生长和转基因 表达。在观察到培养物中90％细胞病变效应时，从细胞和上清收集病毒并 且用于感染新鲜U2OS-ICP4/ICP27细胞。随后每日监测转基因表达和病毒 传播。如图3中所示，在感染后三天，两种BAC分离物都产生噬斑形成 病毒并且两种病毒表达EGFP和mCherry。

实施例6

该实施例描述了用于将四环素诱导型启动子和Gateway重组盒插入 HSV载体的LAT基因座的靶向质粒的构建。

不同策略可以用于阻止在病毒扩展期间OKSM表达盒的遗传重排和 失活，其中所述盒插入JΔNI5或JΔNI8的LAT基因座中。这些策略中的 一种是用四环素诱导型启动子替代OKSM盒的组成型活性CAG启动子。 因为四环素诱导型启动子仅在其反式激活子(rtTA)和四环素/强力霉素 (doxyxycline)二者的存在下具有活性，因此转基因表达在病毒扩展期间可 以严格调节(抑制)。

开发了用于将四环素诱导型启动子插入LAT基因座的靶向质粒(图4)。 携带四环素诱导型TRE3G启动子的慢病毒构建体 (pLenti-CMVTRE3G-NeoDEST，Addgene)用作起始构建体。TRE3G启动 子作为DraI-SpeI片段从pLenti-CMVTRE3G-NeoDEST分离并且插入质粒pCMV-GW的NruI和SpeI位点之间，代替固有的CMV启动子。质粒 pCMV-GW含有Gateway(GW)盒中的博莱霉素(Zeo)-选择基因，替代慢 病毒质粒的GW中的氯霉素(Cm)-选择基因。分离TRE3G-GW(Zeo)表达 盒并且克隆在含有LAT基因座的一部分的质粒中的LAT序列中以将“同源臂”添加至用于重组入BAC DNA中的TRE3G-GW(Zeo)盒。

实施例7

该实施例表明对于ICP27的免疫荧光染色和补充测定。

将对获得针对杀稻瘟菌素的抗性进行选择的U2OS-ICP4细胞和ICP27 慢病毒感染的U2OS-ICP4细胞的个体克隆用QOZHG病毒(ΔICP4， ΔICP27：：HCMV IEp-GFP，β-ICP22，β-ICP47，ΔUL41：：ICP0placZ；Chen， J.Virol.，74：10132-10141(2000))以0.5的MOI感染，用于ICP27免疫荧光 染色，并且以0.01的MOI感染，用于补充测定。对于ICP27免疫荧光染 色，将在感染后24小时细胞固定并且染色(图6A)。克隆#1和#8通过ICP27- 缺陷的HSV(QOZHG)感染显示强烈的对于ICP27表达的诱导。对于补充 测定，监测病毒生长，并且在感染后24，48，和72小时拍摄照片(图6B)。 U2OS-ICP4/27克隆#1和#8显示最强的支持QOZHG病毒生长的能力。

实施例8

该实施例表明多种HSV载体的构建和测试

材料和方法

细胞

将人骨肉瘤U2OS细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)在具有10％FBS 和青霉素-链霉素(P/S)的DMEM中生长。将人新生真皮成纤维细胞(HDF) (ATCC，PCS-201-010)和BJ人包皮成纤维细胞(ATCC，CRL-2522)在10％ 胚胎干细胞用FBS(Invitrogen)和P/S的DMEM中生长。将Vero，Vero-7b (Krisky等人，Gene Ther.5，517-30(1998))和293T细胞培养在含有5％FBS和P/S的DMEM中。分离人肝细胞(hHEP)并如所述的培养(Ueki等人， Hepatology 54，216-28(2011)；Yoshida等人，Hepatology 58，163-75(2013))。 将人皮下前脂肪细胞(hPAD)(PT-5020，Lonza)用PBM

通过用纯化的ICP4慢病毒(参见下文)感染U2OS细胞，分离嘌呤霉素 抗性克隆(2mg/ml)，并且在用ICP4-缺陷病毒(QOZHG)以0.5的复数(MOI) 感染后对ICP4表达进行免疫荧光筛选来产生U2OS-ICP4细胞。类似地， 通过用纯化的ICP27慢病毒感染U2OS-ICP4细胞，对嘌呤霉素和杀稻瘟 菌素(10mg/ml)抗性进行选择，并且对QOZHG感染的克隆进行ICP27免 疫荧光和病毒生长的筛选来产生U2OS-ICP4/27细胞(图6)。

慢病毒

慢病毒ICP4表达质粒pCDH-ICP4-puro通过用ICP4启动子和由插入 pUC19的SphI位点的pICP4-lox-pac(Rasty等人，J.Neurovirol.3，247-64 (1997))(GenBankJQ673480.1HSV-1KOS图位131，587-124，379；D.Krisky 和J.C.G.，未发表)的SphI片段组成的质粒S3的编码区替换质粒 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(Systembio)的完全HCMV IE启动子来构建。 首先通过用pcDNA6/BioEase

使用ViraPower

HSV-BAC改造

本研究中产生的并且转变为病毒粒子的所有HSV-BAC构建体列在表 2中并且源自KOS-37BAC(24)，其是来自D.Leib(Dartmouth Medical School，NH)的馈赠。所有BAC改通过利用pRed/ET(Gene Bridges， Heidelberg，Germany)和pBAD-I-sceI质粒(由N.Osterrieder，Free University of Berlin，Germany友好地提供)或如所述的(Tischer等人， Methods Mol.Biol.634，421-30(2010)；Tischer等人，Biotechniques，40， 191-97(2006))在E.coli株GS1783(来自G.Smith，Northwestern University，Chicago，IL)的无痕Red重组，或通过体外Gateway(GW)重组，根据 Gateway Technology Manual(Invitrogen)(http：// tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf)进行。所有构 建体通过PCR分析，限制性酶消化的FIGE分析，以及靶向DNA测序验 证。用于Red重组的靶向质粒如所述的构建(Tischer等人，Biotechniques， 40，191-97(2006))。从pEPkan-S2(来自N.Osterrieder)(Tischer等人， Biotechniques，40，191-97(2006))用下文指定并且在表1中列出的不同靶 向引物PCR扩增旁侧是I-SceI限制性位点(I-SceI-aphAI片段)的卡那霉素- 抗性基因。基于HSV-1株-17(GenBank JN555585.1)的序列设计靶向病毒 基因组的引物部分。通过Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)或SpinSmart核 酸制备和纯化柱(Denville Scientific)纯化所有用于Red重组的靶向片段。下 文提供的核苷酸位置是指HSV-1株KOS的GenBank JQ673480序列。

为了构建JΔNI载体，将在前描述的高活性的N/T双突变引入KOS-37 BAC的gB基因中(Uchida等人，J.Virol.，84，12200-09(2010))并且将内部 重复(接合处)区域缺失。将I-SceI-aphAI片段克隆在质粒 pgB1：D285N/A549T的SnaBI位点(Uchida等人，J.Virol.，84，12200-09 (2010))。将得到的质粒，pgB：N/T-kan，用作用于利用引物61和62(表1) 扩增的模板，并且将产物用KOS-37BAC的天然gB基因重组，接着I-SceI- 增强的缺失pBAD-I-sceI质粒-转化的细菌中的aphAI基因。接着，用巢式 正向引物46，48和反向引物47扩增I-SceI-aphAI，用于Red-介导的缺失 接合区(GenBank JQ673480位置117，080-132，466)连同基因组的相邻独特 短(U

用mCherry表达盒替代接合处缺失的gB：N/T BAC中的ICP4基因座如 下实现。通过将来自pBluescriptUB-Flag-mArt(H.Nakai，Oregon Health& Science University，Portland，OR赠送)的人泛素C启动子(UbCp)，来自 pEP-miR(Cell Biolabs，San Diego，CA)的mCherry基因，和来自pEP4-EO2SCK2M-EN2L(Addgene质粒20924)(Yu等人，Science 324，797-801(2009))的SV40多腺苷酸化(polyA或pA)区域克隆入pBluescript KS+(Stratagene)，构建质粒pUbC-mCherry-SV40pA。随后将I-SceI-aphAI 片段克隆入pUbC-mCherry-SV40pA在UbCp和mCherry之间的边界的 BamHI位点以产生pUbC-mCherry-SV40pA-KAN。插入物用引物51和52 (表1)PCR扩增，用于利用ICP4靶点基因座的Red-介导的重组。将得到 的构建体对于GenBank JQ673480序列的HSV-1KOS位置 146，113-151，581缺失，包括ICP22启动子的TAATGARAT基序。

用早期(β)HSV-1胸苷激酶(TK)启动子替代ICP0和ICP27 IE启动子 以产生JΔNI2，通过分别利用巢式引物对81/82和83/84经JΔββ病毒基因 组中的ICP0和ICP27编码区二者之前的TK启动子(Craft等人，Stem Cells 26，3119-29(2008))PCR，将各个反应的产物克隆入pCRblunt(Invitrogen) 以分别产生pCRBlunt-β0和pCRBlunt-β27，将I-SceI-aphAI插入 pCRBlunt-β0的BglII位点和pCRBlunt-β27的HpaI位点得到 pCRBlunt-β0-KAN和pCRBlunt-β27-KAN，并且分别利用引物对85/86和 87/88的插入物的PCR扩增进行，用于利用接合处缺失的UbCp-mCherry gB：N/T BAC的Red重组。然后通过使用巢式靶向正向引物41，42和反向 引物43，Red-介导地完全缺失ICP0编码序列从JΔNI2衍生JΔNI3，用于 I-SceI-aphAI扩增。同样，通过使用引物对44/45完全缺失ICP27编码序 列从JΔNI3衍生JΔNI5，产生靶向I-SceI-aphAI片段。

通过在JΔNI5的UL3和UL4基因之间插入EGFP表达盒产生 JΔNI6-CAGGFP。首先，通过用来自pEGFP-C1(Clontech)的EGFP基因替 代质粒pPEP100(P.Spear，NorthwesternUniversity赠送)(Pertel等人， Virology 279(1)，313-24(2001))中的CAG启动子(CMV增强子/鸡β-肌动蛋 白启动子/嵌合的内含子)和兔β-球蛋白polyA区域之间的gH基因，构建质 粒pCAG-GFP。然后将I-SceI-aphAI插入pCAG-GFP的SnaBI位点以产生 质粒pCAG-GFPKAN。分别地，进行使用KOS-37BAC DNA作为起始模 板的多步骤PCR以产生在UL3和UL4polyA区域之间含有新克隆位点 (MCS)的片段，如下。首先，进行延伸PCR以分别用引物对57/58和59/60 扩增UL3和UL4的3’UTR，其向各个3’UTR片段添加重叠MCS区域。 凝胶纯化2种PCR产物并且各自的100ng用于利用引物57和59的重叠 PCR以产生连续片段。将该产物克隆在pCRBlunt(Invitrogen)中，获得质 粒pCRBluntUL3-4linker。然后将pCAG-GFPKAN的插入物克隆在 pCRBluntUL3-4linker的MCS的AccI和PsiI位点之间。将得到的质粒用 MfeI和PpuMI消化，并且将UL3-CAG-GFPKAN-UL4片段分离，用于与 JΔNI5的UL3-UL4基因间的区域重组，接着aphAI基因移除。

为了产生JΔNI7GFP，将含有HSV-1LAT基因座的2个CTRL，LAP1 和LATP2的XhoI片段(～6.2kb)从KOS-37BAC DNA分离并克隆入 pBluescript KS+。从该重组子分离从接近LATP2的末端延伸至CTRL2下 游～250bp的内部KpnI-SalI片段，并且克隆在pSP72(Promega)的KpnI和 SalI位点之间以产生pSP72KOS-LAT。然后将多克隆位点引入至位于KpnI 位点下游～240至～430bp的2个BstXI位点之间，得到pSP72KOS-LATlinker。 分别地，质粒pCAG-GW通过用PCR扩增修饰的GW重组盒[GW-Zeo； 博莱霉素抗性替代氯霉素抗性(Wolfe等人，J.Virol.84，7360-68(2010))] 替代pPEP100(Pertel等人，Virology 279(1)，313-24(2001))的gH基因来构 建。然后将pCAG-GW的插入物克隆入pSP72KOS-LATlinker的MCS以产 生pSP72KOS-LATlinker-GW。将质粒用KpnI和HpaI消化以分离具有旁 侧的LAT序列的CAG-GW区域，用于与ccdB-抗性HerpesHogs细菌中的 JΔNI5的LAT基因座进行Red-介导的重组(Wolfe等人，J.Virol.84，7360-68 (2010))。最后，将得到的JΔNI5重组BAC中的GW盒通过利用AatII-PsiI 片段的Red-介导的重组用EGFP基因替代，包括质粒pCAG-GFPKAN的 CAG和polyA序列。用通过利用表1中列出的分别的F1，F2和R引物(分 别为63-65，66-68，和69-71)的PCR产生的靶向的I-SceI-aphAI盒Red- 介导地重组JΔNI7GFP DNA产生对于EGFP盒外的特定LAT区元件 (CTRL1，CTRL2，LATP2)缺失的JΔNI7GFP衍生物。

对于不同JΔNI9和JΔNI10载体的构建，通过与利用通过利用引物78， 79和80的PCR产生的LAT-靶向的I-SceI-aphAI重组，从JΔNI5基因组缺 失上文所述的～6.2-kb LATXhoI片段，产生JΔNI5ΔL。然后利用对于UL45 和UL46(74/75)之间或UL50和UL51(76/77)之间的基因间的区域的靶向 引物扩增GW-Zeo，并且将各个反应的产物与JΔNI5ΔL BACDNA重组， 产生JΔNI9GW和JΔNI10GW。将JΔNI7GFP BAC DNA用XhoI消化，并 且分离来自LAT基因座的～7.2-kb含有CAG-GFP的片段，并克隆入 pENTR1A(pENTR-LAT-XhoI)。类似分离JΔNI7GFPΔC12LP2的相应 ～5.3-kb XhoI片段并克隆入pENTR1A(pENTR-LATΔ-XhoI)，并且最后，将 pCAG-GFP的插入物(参见上文)转移至pENTR1A(pENTR-CAG-GFP)中。 然后进行体外LR Clonase(Invitrogen)反应以将不同pENTR构建体与 JΔNI10GW BAC DNA重组，分别产生JΔNI10LAT-GFP， JΔNI10C12LP2-GFP和JΔNI10GFP，并且pENTR-LAT-XhoI和pENTR-CAG-GFP与JΔNI9GW BAC DNA重组产生JΔNI9LAT-GFP和 JΔNI9GFP。

通过与用引物53和54扩增靶向的I-SceI-aphAIRed重组，通过如上文 所述将gB：N/T突变引入KOS-37BAC和将UbCp-mCherry盒引入 KOS-BAC的UL3和UL4基因座之间的基因间的区域来构建KNTc。

病毒

通过转染基于U2OS的补充细胞将JΔNI BAC DNA转化为感染性病毒。 将500μlOptiMEM(Invitrogen)中的DNA与1μl Lipofectamine Plus试剂 (Invitrogen)在室温孵育5min，加入6.25μl Lipofectamine LTX(Invitrogen)， 将混合物在室温孵育30min并且加至细胞。在37℃孵育6h后，移除转 染混合物并且利用无血清DMEM将细胞在37℃培养过夜，转移至33℃ 温箱中，并监测100％细胞病变效应(CPE)。将上清测定滴度并且随后通过 以0.001PFU/细胞的复数(MOI)感染后续的较大规模培养物扩增。通过使 用3μlLipofectamine Plus试剂和9μl Lipofectamine LTX在37℃转染Vero 细胞4h产生KNTc感染性病毒；0.01PFU/细胞的MOI用于在Vero细胞 上的KNTc病毒扩增。用于转染和/或病毒生长的补充细胞如下：U2OS-ICP4 (JΔNI2，JΔNI3)，U2OS-ICP4/27(JΔNI5和衍生物)，以及Vero-7b[QOZHG 病毒(ΔICP4，ΔICP27：：HCMV IEp-GFPβ-ICP22，β-ICP47和 ΔUL41：：ICP0p-lacZ)(Chen等人，J.Virol.74，10132-41(2000))]。在 U2OS-ICP4/27细胞上测定所有病毒贮存物的滴度(表2)。通过下文所述的 定量实时PCR确定物理滴度[基因组拷贝(gc)/ml]。利用Nikon Diaphot荧 光显微镜(Nikon，Melville，PA)以40x放大率获得感染的细胞的荧光成像。

病毒生长曲线

将24-孔板中的Vero-7b，U2OS，U2OS-ICP4和U2OS-ICP4/27细胞的 复孔以0.001的复数(MOI)感染2h，用0.1M甘氨酸(pH 3.0)处理1min以 将细胞外病毒失活，并在37℃和5％CO

细胞毒性测定

将5x10

蛋白质印迹和免疫荧光

细胞裂解物制备和蛋白质印迹如所述的进行(Miyagawa等人，PLoS One 4，e4634(2009))。在我们实验室中生产多克隆兔抗-ICP0抗体，抗 -ICP27(10-H44)来自FitzgeraldIndustries International(Concord，MA)，抗 -ICP22由John Blaho(Mt Sinai School ofMedicine，NY)赠送，抗-ICP4(10F1) 来自Santa Cruz Biotechnology，并且抗-α-微管蛋白(T6793)来自Sigma。使 用相同ICP4和ICP27抗体的免疫荧光基本上如所述的进行(Uchida等人， J.Virol.83，2951-61(2009))并且在Nikon荧光显微镜下检查。

定量反转录-PCR(qRT-PCR)和基因组PCR

对于qRT-PCR，总RNA通常通过RNeasy试剂盒(Qiagen)提取。利用

为了确定病毒贮存物的物理(基因组拷贝)滴度，在2mM MgCl

统计学

所有值以平均值+/-SD呈现。对之间的差异通过Student’s t检验，使 用Microsoft Excel 14.4.1分析。低于0.05的P值(P＜0.05)被认为是统计学 显著的。

结果

载体改造和病毒生长

已经报道了利用缺陷HSV载体，JDββ，有效转导小鼠胚胎干细胞 (mESC)(Craft等人，Stem Cells 26，3119-25(2008))，而没有可检测的对细 胞的损伤。使JDββ缺失HSV基因组的内部重复区(“结合处”)和两个IE基 因(ICP4和ICP22)。此外，将两个其他IE基因(ICP0和ICP27)的启动子用 病毒胸苷激酶(TK)早期(E或β)基因启动子的拷贝替代。JDββ感染的非补 充细胞显示最小的IE基因表达，但载体能够在mESC中有效表达转基因 而不干扰拟胚体形成或发育转录程序。为了促进利用该载体主链用于多种 基因转移应用，在细菌中进行Red-介导的重组(Tischer等人，Biotechniques 40，191-97(2006))以从KOS-37BAC(含有HSV-1株KOS的全部基因组的 细菌人工染色体(BAC))(Gierasch等人，Virol.Methods 135：197-206(2006)) 衍生主链，JΔNI2(图9A)。使JΔNI2缺失ICP4和结合处，包括ICP47启 动子，含有与JDββ相同的ICP0和ICP27启动子替代方案，并且缺失ICP22 调节区中的共有VP16-结合(TAATGARAT)基序以将ICP22表达的动力学 改变至早期基因的动力学。为了可视化感染和监测病毒转录活性，将 mCherry报告基因表达盒引入至缺失的ICP4基因座的位置。此外，将糖 蛋白B基因用高活性等位基因，gB：N/T(Uchida等人，J.Virol 84：12200-9(2010))替代以增强病毒进入细胞。为了消除在非补充细胞中低水平生产毒 性ICP0和ICP27蛋白的可能，还通过缺失ICP0(JΔNI3)或ICP0和ICP27 (JΔNI5)的全部编码序列来构建JΔNI2的两种衍生物(图9A)。

为了将不同JΔNI载体构建体转化为感染性病毒粒子，产生能够补充 ICP0，ICP4和ICP27的细胞系。人骨肉瘤U2OS细胞天然补充ICP0(Yao 等人，J.Virol.69，6249-58(1995))，消除了对表达该毒性蛋白的需要。将 U2OS细胞用携带在其自己的调节序列的控制下的ICP4基因的慢病毒转 导，并且分离永久表达ICP4的克隆系(U2OS-ICP4；图9B)。然后将用携 带ICP27基因和控制区的第二慢病毒对这些细胞的转导(图6)用于选择细 胞系，U2OS-ICP4/27，其在被ICP4/ICP27-缺失的病毒感染时，另外表达 ICP27(图9B和图6)。当U2OS细胞在缺少病毒VP16蛋白的情况下激活 ICP4启动子并且耐受持续的ICP4表达的能力是意料之外的同时，未知这 些特征是否与这些细胞的天然ICP0补充活性相关。来自BAC构建体JΔNI2 和JΔNI3的DNA可以通过转染U2OS-ICP4细胞转化为感染性病毒，同时 来自JΔNI5构建体的DNA仅在转染入U2OS-ICP4/27细胞时获得感染性 粒子(数据未显示)。图9C示出了通过分别用JΔNI2或JΔNI5 BAC DNA转 染U2OS-ICP4或U2OS-ICP4/27细胞初步产生的JΔNI2和JΔNI5病毒的生 长。两种病毒在未修饰的U2OS细胞或补充ICP4和ICP27但不补充ICP0 的Vero-7b细胞上不能生长。JΔNI2能够在无ICP27补充的U2OS-ICP4细 胞上生长，而JΔNI5生长需要该另外的补充活性。U2OS-ICP4/27细胞的 JΔNI5补充性质的稳定性通过在不同细胞代的噬斑测定来测试并且经至少 20代未观察到成斑效率的显著趋势(表3)。这些结果与这些病毒中的改造 的IE基因修饰一致并且允许比较它们的生物性质。

病毒投入量的标准化

评价将等量的病毒DNA递送至感染的细胞核所需得各个病毒的相对 量。分别通过在U2OS-ICP4/27细胞上的标准成斑测定和对于病毒糖蛋白 D基因的qPCR确定各种病毒贮存物的生物和物理滴度；在JΔNI2，JΔNI3 和JΔNI5病毒贮存物之间观察到约3倍的基因组拷贝(gc)与噬斑形成单位(PFU)的比例的差异(表2)。用等PFU或等gc的3种病毒感染HDF并且感 染后(pi)2小时(h)通过qPCR确定细胞核中HSV基因组的数量。当等gc 用于感染时，在JΔNI2-，JΔNI3-和JΔNI5感染的细胞之间，在2hpi核中 病毒基因组的数量类似(图10A)。相比之下，与JΔNI2或JΔNI3基因组相 比，用等PFU感染导致核中更大数量的JΔNI5基因组(图10B)。因此，在 本研究的其余部分，gc数用于标准化病毒投入量。

非补充细胞中载体性质的表征

首先检查了与野生型KOS病毒和之前IE基因缺失的载体，QOZHG (ICP4-/ICP27-/β-ICP22/β-ICP47；(Chen等人，J.Virol.74，10132-41(2000)) 相比较，JΔNI2，JΔNI3和JΔNI5感染对非补充HDF和Vero细胞的存活力 的影响。在用25,000gc/细胞感染后5天(d)，与在KOS-或QOZHG感染的 培养物中相比，大约4-5倍多的存活细胞保留在JΔNI感染的HDF培养物 中，而在JΔNI-和QOZHG感染的Vero细胞之间看到较小的差异(图11A)。 在JΔNI病毒中，JΔNI2某种程度上比JΔNI3(p＝0.0017)和5(p＝0.0430) 对HDF毒性更大，而对于Vero细胞的毒性从JΔNI2至JΔNI3(p＜0.001) 至JΔNI5(p＜0.001)减小。为了将这些发现与IE基因表达关联，在24hpi 感染的HDF的蛋白质印迹用针对5种IE蛋白中的4种的抗体进行探测(图 11B)。JΔNI2和JΔNI3二者显示残留的ICP27表达，表明两种载体中ICP27 基因之前的TK启动子在这些细胞中不沉默，但在JΔNI5感染的细胞中未 检测到IE蛋白，尽管使用2-3倍多的gc/细胞(等PFU/细胞，参加表2)。 KOS和QOZHG模式与报道的由ICP4导致的ICP0表达的下调一致 (Douville等人，Virology 207，107-16(1995)；Resnick等人，J.Virol.63， 2497-503(1989))。使用定量反转录-PCR(qRT-PCR)分析，在JΔNI2感染的HDF中检测ICP0 mRNA并且在用等gc/细胞感染后12h的JΔNI2-，JΔNI3- 和JΔNI5感染的细胞之间的ICP22和ICP27mRNA的水平减少(图11C)。 这些结果提示，JΔNI2产生足够水平的ICP0以增强ICP22和ICP27表达 并且确认逐步缺失IE基因减少HSV载体细胞毒性(Krisky等人，Gene Ther. 5，1593-603(1998)；Samaniego等人，J.Virol.72，3307-20(1998)；Samaniego 等人，J.Virol.71，4614-25(1997))。

qRT-PCR用于检查选择的早期和晚期病毒基因的表达(图11D)。在感 染后12h，JΔNI2通常表达最高水平的这些基因并且JΔNI5最低，类似于 对于IE基因所观察到的模式。这些结果显示，用早期启动子替代天然ICP0 和ICP27启动子在不存在ICP4的情况下不足以沉默病毒基因组，而缺失 两种基因大大减少残余的基因表达。

JΔNI报告基因表达

为了确与mCherry报告基因一起引入JΔNI载体的缺失的ICP4基因座 的外源人泛素C(UbC)启动子(p)的活性与JΔNI2感染的细胞比较，在 JΔNI3-和JΔNI5感染的细胞中是否也被下调，检测感染的HDF中的 mCherry表达。在用5,000gc/细胞感染后24h，在JΔNI2感染的细胞中容 易检测到mCherry荧光，但在JΔNI3-或JΔNI5感染的细胞中检测不到(图12A)。通过qRT-PCR测量在6hpi的mCherry mRNA水平显示在JΔNI2- 和JΔNI3感染的细胞之间来自UbC启动子的约100-倍的转录活性的减少， 和在JΔNI5感染的细胞中大约5-倍的另外的减少(图12B)；用于该实验的 KNTc对照病毒是可复制的并且在UL3和UL4之间的基因间的区域含有 UbCp-mCherry盒。这些数据与以下解释一致，即自JΔNI2的残余ICP0和ICP27表达(图11C)足以阻止病毒基因组的全而转录沉默，同时缺失这两 种基因基本上消除所有天然(图11D)以及外源(图12A，12B)启动子活性。 与HDF相反，用JΔNI3或JΔNI5感染的标准U2OS细胞显示强的mCherry 表达(图12C)，提示U2OS细胞的ICP0补充活性足以激活这些另外的沉默 的基因组。为了证实病毒ICP0蛋白具有相同活性，将JΔNI5感染的HDF用ICP0+QOZHG病毒重复感染(参见图11B)。如图12D中所示，重复感 染诱导mCherry表达，同时空白对照重复感染则不。综上，这些结果表明， 至少在足够ICPO表达或补充活性的存在下，不需要ICP27将沉默的JΔNI5 基因组去抑制，并且提示，JΔNI2感染的HDF中表达的ICP0的最小量足 以维持整个病毒基因组的有限转录活性。

来自沉默的JΔNI5基因组的高水平转基因表达

在感染神经元细胞时，HSV进入潜伏状态，其中除了LAT基因座， 病毒基因组转录沉默。研究了在非神经元细胞中在其他沉默的病毒基因组 的情况下，LAT基因座是否会类似地保持活性。为此，将由CAG增强子/ 启动子和EGFP基因(CAGp-GFP)组成的表达盒引入JΔNI5的LAT 2-kb内 含子区域中，产生载体构建体，称为JΔNI7GFP(图13A)。作为对照，将相同CAGp-GFP盒引入JΔNI5的UL3-UL4基因间区域，产生载体 JΔNI6GFP(图13A)；UL3-UL4基因间区域已经用于非破坏性插入转基因 盒(Baines等人，J.Virol.65，938-44(1991)；Menotti等人，J.Virol.76，5463-71 (2002))并且接近LAT基因座但在LAT基因座外部。在本文的其他地方， “JΔNI6GFP”被称为“JΔNI6-CAGGFP”(还参见图1A)。在U2OS-ICP4/27细胞上产生感染性病毒并且新病毒贮存物的gc：PFU比率与JΔNI5的类似(表 2)。在U2OS-ICP4/27细胞中扩增期间，JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7GFP二 者产生足够的绿色和红色荧光，证明它们的转基因表达盒的完整性。为了 检查这些病毒在非补充细胞中表达EGFP转基因的能力，用增加的gc/细 胞感染HDF并且在3dpi记录EGFP荧光(图13B)。JΔNI7GFP感染的细胞 显示足够的，病毒剂量依赖性EGFP表达，而JΔNI6-CAGGFP感染甚至在 最高剂量产生有限的表达。尽管与较早期JΔNI5感染相比，在这里用到较 高的病毒输入，但mCherry表达仍为最小。这些结果由在3和5dpi的EGFP 和mCherry mRNA水平的qRT-PCR测量证实(图13C)并且与以下提示一致， 即JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7GFP病毒基因组，像JΔNI5基因组一样，在感 染的HDF中沉默同时LAT基因座保持转录活性。因为JΔNI7GFP感染的 细胞中EGFP mRNA水平在5dpi至少与在3dpi一样高(图13C)，所以研 究表达是否可以在细胞被完全接触抑制的较晚期时间被检测到。结果显示， 在一些细胞中表达将持续至少4周(图13D)。综上，这些观察结果表明LAT 基因座是用于自由于功能缺失所有IE基因表达而无毒的HSV基因组的持久转基因表达的优选位点。

CTRL和LATP2支持自LAT基因座的转基因表达

已经证明，潜伏期间的LAT表达受潜伏相关启动子(LAP) 1和2控制 (Goins等人，J.Virol.68，2239-52(1994)；Zwaagstra等人，Virology 182， 287-97(1991))。LAP1位于被加工为稳定2-kb LAT内含子的～8.7-kb不稳 定初级LAT转录体的转录起始位点的上游，而LAP2位于第一外显子中的 LAP1的下游并且延伸至2-kb内含子区域中。某种程度上进一步延伸到内 含子中的含有LAP2的区域被称为LATP2。除了用作启动子，已经显示 LAP2/LATP2区可以充当不依赖于位置的长期表达/增强子元件以用于在 神经元中的转基因表达(Berthomme等人，J.Virol.74，3613-22(2000)； Palmer等人，J.Virol.74，5604-18(2000))。然而，还已经报道了，在潜伏 期间，LAT基因座受富含CTCF结合位点的区域保护，免于病毒基因组的 全面沉默，所述富含CTCF结合位点的区域称为CTRL，一个位于LAP1 的上游(CTRL1)并且另一个在2-kb内含子中，就在LATP2的下游(CTRL2) (Blooom等人，Biochim.Biophys.Acta 1799，246-56(2010))。因此，探索 LATP2和CTRL元件在使在JΔNI7GFP感染的HDF中观察到EGFP表达 成为可能的可能作用。三个元件分开和组合地从JΔNI7GFP基因组缺失(图 14A)并且检查在感染的HDF中的报告基因表达(图14B，14C)。CTRL1的 缺失(ΔC1)或LATP2的缺失(ΔLP2)导致绿色荧光和EGFP mRNA水平的显 著减少，而CTRL2的缺失(ΔC2)仅具有小的影响。缺失两种CTRL(ΔC12) 具有与单独缺失CTRL1相同的影响，而缺失所有三种元件(ΔC12LP2)进一 步将表达减少至在JΔNI6-CAGGFP感染的细胞中观察到的水平。在任何感 染的细胞中都检测不到mCherry荧光(图14B)，提示不同缺失不引起病毒 基因组中其他位点的去抑制。这些结果表明，在功能性缺乏所有IE基因 的病毒基因组的情况下，CTRL1和LATP2区域二者在保护连接的转基因 免受转录沉默方面，发挥显著作用。

转基因表达的LAT基因座保护不依赖于位置

为了确定在缺少IE基因产物的情况下与LAT基因座相关的序列是否 足以保护嵌入的转基因表达盒免于沉默，将对应于JΔNI7GFP的 LAT：CAGp-GFP区(包括两个CTRL，LAP1和LATP2)的限制性片段插入在 缺失相同LAT区以避免天然和新位点之间的重组的JΔNI5衍生物的两个 异位位置中的一个处。首先，将Gateway(GW)重组盒引入LAT-缺失的 JΔNI5基因组的UL45和46之间(JΔNI9GW)或UL50和UL51之间 (JΔNI10GW)的基因间区域中，并且随后通过与GW盒重组将LAT：CAGp-GFP片段或没有LAT序列的CAGp-GFP引入(图15A)。在U2OS-ICP4/27细胞上产生病毒(表2)后，在感染的HDF中测试载体的报告 基因表达。在3dpi，在报告盒周围缺少LAT序列的载体(JΔNI9GFP和 JΔNI10GFP)在感染的细胞中显示低水平的EGFP荧光(图15B)和mRNA (图15C)，与JΔNI6-CAGGFP对照载体类似，提示两个基因间插入位点被 转录抑制，与UL3和UL4之间的基因间区域类似(图13)。然而，当报告 盒在两个旁侧都有LAT序列时(载体JΔNI9LAT-GFP和JΔNI10LAT-GFP)， EGFP表达增加至在JΔNI7GFP感染的细胞中观察到的水平(图15B)，表明 LAT-衍生的区域的抗沉默活性以不依赖于位置的方式行使功能。为了确认 该活性对LATP2以及两种CTRL之一或二者的依赖性，通过GW重组将 LAT：CAGp-GFP片段的LATP2-和CTRL-缺失的版本引入JΔNI10GW基因 组中；缺失与早期JΔNI7GFPΔC12LP2载体的LAT区中的那些相同(图14A)。 该缺失在感染的HDF中减少EGFP表达，尽管未完全降低至用无LAT JΔNI10GFP载体观察到的水平(图15C，15D)；不清楚为何ΔC12LP2缺失 表现为在这里具有比在JΔNI7GFP(～50-倍，图14C)中更小的效果(～3.5-倍)。 然而，这些结果明确表明包括2种CTRL，LAP1和LATP2的LAT基因座 的部分可以在缺少IE基因表达的情况下以不依赖于位置的方式保护嵌入 的转基因表达盒免于病毒基因组的全面沉默，并且表明至少CTRL1和 LATP2在该活性中发挥作用。

在其他细胞类型中LAT基因座元件保护转基因表达

为了评估这些研究结果在除HDF之外的应用，在其他细胞类型中测试 自选择的载体的EGFP和mCherry表达。通过qRT-PCR，与JΔNI6-CAGGFP 感染的人细胞相比，在3dpi，在JΔNI7GFP感染的人细胞中观察到较高 EGFP mRNA水平(图16B)。在BJ人包皮成纤维细胞中观察到最大差异 (～35-倍)，类似于在HDF中(～30-倍，图13C)，和在人肝细胞(hHEP)中(～40- 倍)的差异。人新生儿角质形成细胞(hEK)显示出最小的差异(～4.5-倍)，在 来源于肌肉的干细胞(hMDSC)(～10-倍)和前脂肪细胞(hPAD)(～7-倍)中观 察到中间值。胎儿大鼠背根节(rDRG)神经元中的2种载体的比较仅显示 ～2.5-倍的差异。图16A显示在3dpi来自在相同感染条件下进行的独立实 验的代表性荧光图像。除了hHEP来自与图16B中不同的供体以外，结果 与qRT-PCR数据大体上一致。有趣的是，当没有一种人细胞显示显著的mCherry荧光，在JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7GFP感染的大鼠DRG培养物 中都观察到足够的mCherry表达。尚不知该结果是否是神经细胞独有的并 且可以是mCherry基因之前的启动子，病毒基因组中表达盒的位置，和/ 或细胞的大鼠来源的功能。将hMDSC维持延长的时间，允许监测 JΔNI7GFP感染的细胞中随时间的EGFP表达。如图16C中所示，在 JΔNI7GFP感染的细胞中可以(在JΔNI6GFP感染的细胞中不能)容易地检测 到EGFP达感染后至少4周，这类似于利用JΔNI7GFP感染的HDF进行的 观察(图13D)。

最后，对于一些细胞，确定UL50/51基因间区域中的CAGp-GFP活性 是否如在HDF那样被旁侧的LAT序列增强。图16D中的结果显示在所有 三种细胞类型中相当程度的增强，由于未知原因，其超过相同细胞中 JΔNI6-CAGGFP和JΔNI7GFP之间的差异。总之，这些结果表明LAT基因 座中的遗传元件的不依赖于位置的抗沉默活性不限于HDF，而且在多种非 神经人细胞类型中也可操作。

实施例9

该实施例显示JΔNI8的构建和性质。

通过从上述JΔNI5载体缺失UL41构建JΔNI8。这由图17中的图显示。 JΔNI7GFP基本上是在LATP2和CTRL2之间的LAT基因座中插入有 CAGp-EGFP-polyA的JΔNI5。JΔNI8GFP与JΔNI7GFP相同，除了缺失 UL41。还参见图20。

相对于JΔNI5评价JΔNI8在补充细胞中的生长，如上所述，所述补充 细胞是被改造成表达ICP4和ICP27的U2OS细胞。将补充细胞用各个载 体以1个病毒基因组拷贝(gc)/细胞感染。如图18中所示，如通过噬斑形 成单位(PFU)，基因组拷贝(gc)和mCherry转基因的表达测量的，JΔNI8呈 现比JΔNI5更强的生长。此外，观察到，相对于JΔNI5，天然HSV基因在补充细胞中在感染期间更早地自JΔNI8表达(图19，表示相对于被任意 指定为1的值的在6hpi的各JDNI5基因的倍数表达)。

如表9-1中所示，与JΔNI5和JΔNI7GFP相比，JΔNI8和JΔNI8GFP 每基因组拷贝(gc)分别产生更多噬斑(在补充细胞上)。这表明，JΔNI8和 JΔNI8GFP制备物中的功能型与缺陷性粒子的比例(质量的测量)比在 JΔNI5和JΔNI7GFP制备物中更高。

表9-1

此外，观察到，以等gc水平感染导致人真皮成纤维细胞的核中的等量 病毒DNA。然而，使用结合图10讨论的方案，对于与JΔNI5相比的JΔNI8， 这通过低很多的PFU实现。(图21)这些数据表明，以等gc进行的感染应 该用于比较JΔNI8与JΔNI5(或JΔNI7GFP相对JΔNI8GFP)的研究。MTT 细胞存活力分析(参见图22)表明，以5或10PFU/细胞(M.O.I.＝5或＝10)，JΔNI8(各图中的上部-X-线)比任何其他载体具有可测量的较低毒性(接近 或超过未感染对照细胞的存活力)。各图中的下部-X-线表示JΔNI5的结果。 这些数据也表明，具有完整ICP0基因的载体，即使在β启动子下(JΔBBB3 (也称为JDBBB3或JΔβββ3或JDβββ3))或在没有UL41的情况下(QOZHG)， 也比JΔNI5或JΔNI8更具毒性。如预期的，复制病毒(KOS)杀伤细胞。另 外的使用HDF的MTT实验表明，尽管JΔNI8在较高MOI稍微显示毒性， 但其远小于在3-倍低的MOI(等gc/细胞)情况下的JΔNI5(图23)。其他MTT 数据表明，在一些(HDF，人新生儿角质形成细胞，和人神经干细胞)，但 不是所有(Vero，人前脂肪细胞，和人肝细胞)细胞类型中，JΔNI8比JΔNI5 毒性低(参见图24)。

在3dpi，在HDF细胞中比较自分别存在于JΔNI7GFP和JΔNI8GFP 内的两种转基因(即，EGFP和mCherry)的报告基因表达。结果显示在图 25和26中。观察到，通过JΔNI8GFP的GFP表达随剂量(从5000至50,000 gc/细胞，图25)增加，但对于JΔNI7GFP趋向平稳。不希望受理论限制， 据信，观察到的自JΔNI7GFP的趋于平稳的表达可能归因于HDF细胞中 载体的高剂量毒性，其暗示，这样的毒性在JΔNI8GFP中较低。此外，自 用JΔNI8GFP感染的HDF细胞观察到显著的mCherry，但用JΔNI7GFP感 染的HDF细胞则没有。用不变剂量的JΔNI7GFP或JΔNI8GFP(25,000gc/ 细胞)进行类似实验，随时间测定EGFP或mCherry荧光的水平(感染后2， 4和6天(图26))。JΔNI8GFP感染的培养物中的报告信号在4至6dpi之间 减少，可能是通过未受损细胞分裂的病毒基因组稀释的结果。信号在 JΔNI7GFP感染的培养物中更稳定，可能是由于减少的细胞分裂。

还研究了自用JΔNI7GFP相对于JΔNI8GFP感染的其他细胞的转基因 (EGFP或mCherry)表达。如图27中所描述，在两个测量的剂量(12,500gc/ 细胞和25,000gc/细胞)，JΔNISGFP比JΔNI7GFP在人新生儿角质形成细 胞中表达更多的GFP。

此外，测定自用JΔNI7GFP或JΔNI8GFP(以6250gc/细胞)感染的大鼠 背根节(DRG)细胞的转基因表达。如图28中所描述，与非神经细胞比较， 相对于GFP，自JΔNI7GFP的mCherry(插入两种载体的ICP4缺失的基因 座中)表达在大鼠DRG神经元中增强，并且在JΔNI8GFP感染的细胞中比 在JΔNI7GFP感染的细胞中相对更多。这些结果表明，JΔNI8是无毒性的， 并且在神经元中提供自LAT和ICP4基因座二者的转基因表达。

实施例10

该实施例显示长期实验中自JΔNI7-GFP载体的体内表达。

以0.1μl/min的速率将JDNI7-GFP(8.0x10

实施例11

该实施例涉及mCherry转基因自感染的原代星形胶质细胞内的 JΔNI7-GFP载体的表达。

感染(M.O.I.＝5)小鼠星形胶质细胞并培养。在感染后25天后，将细胞 固定并且暴露于对神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)特异的抗体，其阳性结 合鉴定星形胶质细胞。免疫荧光成像表明，JΔNI7-GFP是无毒性的，并且 在星形胶质细胞中提供持久表达。

实施例12

该实施例显示用于补充本发明的HSV载体并且还在病毒增殖期间促 进旁侧是loxP的BAC盒的切除的细胞系的产生。

将上文讨论的U2OS-ICP4/27细胞系改造成表达Cre重组酶。得到的 细胞系，U2OS-ICP4/27/Cre，补充载体JDNI5、7、8及其衍生物中的除了 非必需的ICP47基因以外的所有缺陷HSV IE基因的功能，并且在病毒生 长期间移除BAC盒。

通过用表达Cre的逆转录病毒载体感染U2OS-ICP4/27细胞来产生 U2OS-ICP4/27/Cre细胞。对于逆转录病毒载体的构建，通过将Gateway重 组盒插入多克隆位点来修饰质粒pCX4Hyg(PNAS 2003，100：13567-13572； GenBank登陆号AB086387)以产生pCX4Hyg-GW。将来自质粒pTurbo-Cre (GenBank登陆号AF334827.1)的完整NLS-Cre编码序列插在pENTR1A(Invitrogen)的attL1和attL2位点之间并且随后通过LR Clonase介导的 Gateway重组转移至pCX4Hyg-GW中以产生pCX4Hyg-Cre。该质粒及其 构建示意性地在图30和31中描述。如Makino等人所述的那样(Exp Cell Res 2009，315：2727-2740)产生逆转录病毒颗粒。简言之，将pCX4Hyg-Cre 与Gag-Pol和VSV-G表达质粒共转染入293T细胞中，并且在48小时后 收集上清，经0.45微来滤器过滤，并且通过离心浓缩。合适的Gag-Pol和 VSV-G质粒是可商购的(例如，来自Cell Biolabs的pCMV-Gag-Pol(目录号 RV-111)和来自Addgene的pCMV-VSV-G)。

将U2OS-ICP4/27细胞用纯化的Cre逆转录病毒感染，并且将细胞针 对嘌呤霉素，杀稻瘟菌素和潮霉素进行抗性选择。分离抗性克隆，扩增， 用JΔNI7-GFP以0.001-1PFU/细胞感染，并且在感染后2天(dpi)对β-半乳 糖苷酶活性进行染色。发现显示很少蓝色细胞的克隆经历快速细胞病变效 应(在以MOI＝0.01感染后4天100％CPE)，而亲本U2OS-ICP4/27细胞在 9dpi显示蓝色细胞的噬斑形成簇和大约25％CPE。这些结果表明，Cre介 导的BAC元件的去除连同JΔNI7-GFP中连接的LacZ表达盒促进病毒生 长。准确移除JΔNI7-GFP的loxP位点之间的BAC和LacZ序列已经通过 来自选择的U2OS-ICP4

因此，已经观察到经此U2OS-ICP4/27/Cre细胞系传代，移除大约11KB BAC序列，这为转基因恢复空间，并且显著加速病毒生长。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请、和专利在此通过 引用到好像分别和具体指定每个参考文献通过引用结合并且以其整体在 本文中陈述的程度。

术讯“一个(a)”和“一个(an)”以及“那个(the)”和“至少一个”以及类似所 指，在描述本发明的情况下(特别是在以下权利要求的情况下)的使用被理 解为覆盖单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。术讯“至 少一个”接着一列一种或多种项目(例如，“A和B中的至少一个”)的使用 被理解为意为选自所列项目的一个项目(A或B)或所列项目的两个或以上 的组合(A和B)，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。术讯“包含 (comprising)”，“具有(having)”，“包括(including)”和“含有(containing)”被理 解为开放式术讯(即，意为“包括，但不限于”)，除非另有说明。本文中的 值的范围的陈述仅以在用作分别涉及落在该范围内的各个分开的值的速 记方法，除非本文中另有指示，并且各个分开的值结合入说明书中，就像 其分别在本文中陈述。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行， 除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例， 或示例性的术讯(例如，“如”)的使用，仅意在更好地说明本发明并且不引 起对本发明范围的限制，除非另外要求。说明书中没有术讯应该被认为表 示任何未要求的对于本发明的实践是关键的要素。

在本文中描述了本发明的优选的实施方案，包括发明人已知的进行本 发明的最佳方式。在阅读前述的描述后，那些优选的实施方案的改变对于 本领域普通人员可能变得显而易见。本发明人预期技术人员酌情利用这些 改变，并且本发明人希望本发明以如本文具体所述之外的实践。因此，根 据适用的法律所允许的，本发明包括附于此的权利要求中所述的主题的所 有改变和等效物。此外，上述要素以其所有可能变化形式的任意组合由本发明包括，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。