用于HLA-B1502和HLA-A2402基因型检测的试剂盒

摘要

本发明涉及用于HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因型检测的试剂盒，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，本发明试剂盒在一管中同时检测HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因亚型，提高了多重PCR扩增的效率，检测灵敏度和检测特异性，并且较常规的单链引物多重扩增的荧光定量PCR方法显著性减少了假阳性的结果。

说明书

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02 基因型检测的试剂盒。

背景技术

癫痫是神经科第二常见疾病，我国癫痫患者过千万，每年新增约40万，药物治疗为癫痫的主要治疗方式，多数患者需要长期服药，但大约16％的患者出现皮肤型过敏反应，包括轻度的斑丘疹(maculopapular exanthema,MPE) 及重度的斯蒂文森-强生综合症(Stevens-Johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis，TEN)，明显影响生活质量，严重时出现剥脱性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡，皮肤起水疱，甚至出现全身表皮脱离，如同大面积烫伤，致死性高达40％。这种过敏在南方汉族人群，尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。

卡马西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、苯妥英钠(PHT) 以及妥泰(PB)都具有相似的芳香族结构，是广泛使用的用于控制癫痫、三叉神经痛等的抗癫痫药物(AEDs)。然而，该类药物通常会导致皮肤不良反应(cADRs)，长期困扰着临床医生。cADRs占所有报道的药物不良反应的 10％-30％，包括轻度的斑丘疹(MPE)、药物超敏反应综合症(HSS)到重型的有潜在致命性的Stevens-Johnson综合症(SJS)和/或中毒性表皮坏死松解症(Toxic epidermal necrolysis,TEN)。如能找到与其相关的基因标志，将对临床用药起到很大的指导作用。人类白细胞抗原(HLA)基因与人体免疫相关，包括数千个不同的基因型。HLA-B*15:02为我国南方汉族人群卡马西平导致剥脱性皮炎的遗传标记，HLA-A*24:02是卡马西平导致剥脱性皮炎的新的风险基因，两位点同时检测将卡马西平导致剥脱性皮炎的排除概率从69.6％提高到90％。两位点同时阳性时，芳香族抗癫痫药物引起的严重皮肤过敏风险值增大23倍。因此癫痫患者用药前通过这两个基因型筛查可降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。

HLA基因的不同基因亚型序列同源性高，因此一般多通过测序的方法来区分HLA基因的不同基因亚型；但测序的方法成本较高，实验周期较长，难以满足临床诊断的需求。而基于荧光定量PCR方法来检测HLA基因的不同基因亚型，由于序列同源性高的原因，经常会导致检测的假阳性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02 基因型检测的试剂盒，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA- B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基；和每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基。

在一种实施方式中，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多6个；和，

每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多6个。

在一种实施方式中，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个；和，每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。

在一种实施方式中，每个上游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个；和，每个下游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。

在一种实施方式中，针对HLA-A*24:02基因型的上游引物是SEQ ID NO:2：GAGAC-GGAGTATTGGGACGAG-GAGACAG，上游封闭引物是SEQ ID NO:3：CTCGTCCCAATACTCC-GTCTC，下游引物是SEQ ID NO:5： CAGGT-GAGCGCGATC-CCAGGTT，下游封闭引物是GATCGCGCTC- ACCTG(SEQ ID NO:6)；和，针对HLA-B*15:0基因型的上游引物是SEQ ID NO:9:GATGG-GCGAGTCCG-AGATGGC，上游封闭引物是SEQ ID NO:10:CGGACTCGC-CCATC，下游引物是SEQ ID NO:12:TCTTG- GTAAGTCTGTGTGTTG-GTCTTGG，下游封闭引物SEQ ID NO:13:CAACACACAGACTTAC-CAAGA。

在一种实施方式中，针对HLA-A*24:02基因型的探针序列是SEQ ID NO:7:GACAGGGAAAGTGAAGG-BHQ1，和针对HLA-B*15:0基因型的探针序列是SEQ ID NO:14:AGATCTGTGTGTTCCGGTCCCAA-BHQ1()，上述二个探针5’端标记不同的荧光。

在本发明多重PCR反应中利用具有封闭非特异性反应的封闭引物，降低了非特异反应，从而提高了多重PCR反应的灵敏度和提高了多重PCR扩增反应的扩增效率。相应地，使得本发明的qPCR扩增体系的特异性得到了明显的改善，提高了试剂盒检测的准确率，减少了假阳性发生。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明的试剂盒反应基本原理示意图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例一本发明的试剂盒反应基本原理

如图1所示，本发明利用上游封闭引物和上游引物先形成双链，防止非特异性扩增。只有上游引物和模板DNA完全匹配后，双链引物才能逐步解开，从而降低非特异性扩增。本发明上游引物和上游封闭引物上5’端人工设计的碱基(方框点表示)与模板DNA不匹配的碱基数目为5个碱基；封闭引物3’较上游引物少6个和模板DNA匹配的碱基。上游引物和封闭引物这种5’端5个不匹配碱基和3’端6个减少的匹配碱基的方式我们称为“5+6”模式。

在一管中同时检测HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型，提高了多重PCR扩增的效率，检测灵敏度和检测特异性，并且较常规的单链引物多重扩增的荧光定量PCR方法显著性减少了假阳性的结果。

实施例二本发明用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒

如表1所示，本发明所用的引物和对比普通qPCR引物。下划线斜体碱基是和基因组DNA模板序列完全匹配的碱基。本表格举例的是本发明上游引物、下游引物和各自的封闭引物是“5+7”模式。

表1.检测HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型的引物和探针

表2本发明qPCR反应体系

表3普通qPCR反应体系

表4 qPCR反应程序

在本实验中比较了不同引物的扩增效率，在本发明中首先使用HLA- B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型的普通上游引物和普通下游引物分别进行单独扩增，然后使用HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型的普通上游引物和普通下游引物在一起进行二重PCR扩增，以及HLA-B*15:02和HLA- A*24:02基因亚型的本发明扩增引物对进行二重扩增，具体扩增效率结果如表5所示。

表5 PCR扩增效率结果

根据上述实验结果可知，使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增的效率与单独的PCR扩增相比，扩增效率基本保持不变，而普通引物的二重扩增的扩增效率有了明显降低。

依照上述相同的实验设计，将待测样本、浓度梯度标准品(10copies/μ l，100copies/μl，1000copies/μl，10000copies/μl)、阴性对照分别加入PCR 反应管中，盖好PCR反应管盖，振荡混匀后瞬时离心，进行PCR扩增反应。在本实验中比较了不同引物的扩增灵敏度，具体扩增灵敏度结果如表6所示。

表6 PCR扩增灵敏度结果

根据上述实验结果可知，单独的PCR扩增、使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增和普通引物的二重扩增的扩增灵敏度对于HLA-B*15:02基因型的分别是100、200和500copies/μl，对于HLA-A*24:02基因型的分别是200、250和500copies/μl。

发明人同时使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增和普通引物的二重扩增检测了30例真实样本，具体检测结果如下表所示：

表7 HLA-A*24:02基因型检测结果

在检测HLA-A*24:02基因亚型时，以测序的基因型结果为标准，常规的 qPCR扩增体系的灵敏度为100％，特异性为90％；而本发明的qPCR扩增体系(“5+7”模式)的灵敏度为100％，特异性为100％；可见本发明的qPCR 扩增体系的特异性得到了明显的改善。

表8 HLA-B*15:02基因型检测结果

在检测HLA-B*15:02基因亚型时，以测序的基因型结果为标准，常规的 qPCR扩增体系的灵敏度为100％，特异性为86.7％；而本发明的qPCR扩增体系(“5+7”模式)的灵敏度为100％，特异性为100％；可见本发明的qPCR 扩增体系的特异性得到了明显的改善。

同样我们测试了引物和封闭引物以“4+6”模式、“4+7”模式模，发现检测HLA-A*24:02和HLA-B*15:02基因亚型的特异性都较普通多重引物检测提高了10％～25％，灵敏度和扩增效率结果与上述“5+7”模式结果类似。而在引物和封闭引物以“4+5”模式、“5+6”和“3+4”模式时，检测HLA- A*24:02和HLA-B*15:02基因亚型的特异性、灵敏度和扩增效率与普通引物多重检测结果类似。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 广州医科大学附属第二医院

<120> 用于HLA-B1502和HLA-A2402基因型检测的试剂盒

<130> PF2122

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagtattgg gacgaggaga cag 23

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagacggagt attgggacga ggagacag 28

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgtcccaa tactccgtct c 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcgagtccga ggatggc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 11

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<212> DNA

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<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caacacacag acttaccaag a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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