一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用

摘要

本发明属于线粒体控制区研究领域，涉及一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。扩增引物由两条单链寡核苷酸组成，其中上游引物CGU‑dlp‑S有25个碱基：AAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGA，下游引物CGU‑dlp‑A有21个碱基：CTCACGGGGTTGCGGAGACTT。本发明的扩增引物可以高效特异性地扩增圆口铜鱼线粒体基因组控制区，可用于不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列的遗传信息分析，为快速有效地进行种类鉴定、遗传分化、控制区进化研究提供了一个有力工具。

说明书

技术领域

本发明涉及圆口铜鱼遗传信息分析技术领域，具体的说，涉及一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。

背景技术

动物线粒体基因组DNA是细胞核外呈共价闭合结构，拷贝数高、分子量小而稳定、无组织特异性、一级结构进化速度快等，具有自主复制、转录和翻译能力，并严格进行母系遗传的遗传因子，已成为鱼类生态学和进化生物学研究的有力工具。线粒体基因组由37个编码基因及一段主要的非编码区，即控制区组成，不同区域进化速率不同。一般认为，控制区是线粒体基因组上进化最快的区域，其变异速率约为线粒体DNA上其他区域的5-10倍，适于亲缘关系较近的群体间进行比较研究，是进行鱼类群体遗传结构分析、种类鉴定及濒危物种遗传多样性检测等方面研究的重要遗传标记。

圆口铜鱼(Coreius guichenoti)，隶属鲤形目Cypriniformes，鮈亚科Gobioninae，铜鱼属Coreius，是一种主要分布于长江上游、金沙江中下游及其部分支流如雅砻江下游的特有鱼类，根据2021年1月4日公布并实施的《国家重点保护野生动物名录》，圆口铜鱼被增补为国家二级重点保护野生动物。圆口铜鱼属于典型的河道洄游性鱼类，成熟亲鱼向上溯游到金沙江中下游产卵，受精卵在天然河道中漂流发育、完成孵化过程并具有主动游泳能力，整个生活史均需在河道中完成。随着长江上游干支流梯级电站建设的逐步实施，圆口铜鱼栖息地面积日益缩小，且生境相互隔离，已建成的水利工程阻隔了圆口铜鱼补充群体的洄游通道。因此，对圆口铜鱼的研究和保护工作迫在眉睫。目前已报道的鱼类线粒体DNA控制区扩增引物(黄志坚等)和鲤科鱼类线粒体DNA控制区扩增引物(刘焕章)，均不能有效扩增不同地区圆口铜鱼样品，大部分没有扩增产物。因此针对圆口铜鱼线粒体DNA控制区序列设计特异性引物，为有效获得不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列、进行不同地区群体间遗传结构比较研究、多样性检测及有效避免人工增殖放流造成的遗传污染是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物，上游引物CGU-dlp-S有25个碱基，如SEQ ID NO:1所示，下游引物CGU-dlp-A有21个碱基，如SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:1：AAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGA；

SEQ ID NO:2：CTCACGGGGTTGCGGAGACTT。

提供一种上述圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物的应用，用于不同地区圆口铜鱼线粒体控制区序列的遗传信息分析。

按上述方案，所述应用包括以下步骤：

(1)提取圆口铜鱼基因组DNA；

(2)在上游引物CGU-dlp-S和下游引物CGU-dlp-A的作用下进行PCR反应；

(3)琼脂糖凝胶电泳；

(4)对扩增的mt DNA控制区基因片段进行测序，对测序结果进行手动校正后，计算单倍型多样性和核苷酸多样性，用来衡量圆口铜鱼遗传多样性水平；计算群体间的分化指数(Fst)值并进行分子方差分析(AMOVA)，用来判断各圆口铜鱼不同地区群体间遗传分化情况。

按上述方案，所述步骤(1)中，圆口铜鱼基因组DNA提取采用酚-氯仿法或DNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)法。

按上述方案，所述步骤(2)中，PCR反应的体系和条件如下：

40μL的PCR反应体系由如下组分构成：模板DNA(20～50ng/μL)，引物CGU-dlp-S(10μM)和引物CGU-dlp-A(10μM)，Ex-Taq酶(5U/μL)，10×Ex-Taq Buffer(Mg

PCR条件为：95℃预变性5min，随后94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃充分延伸10min。

按上述方案，所述步骤(4)所述测序为采用PCR扩增产物直接测序，测序引物为扩增引物CGU-dlp-S和CGU-dlp-A，测序分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。

与现有报道相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物，特异性强，并且能稳定地扩增不同区域圆口铜鱼个体，获得有效产物，从而避免了采用鲤科鱼类线粒体通用引物所存在的扩增无产物的缺点。鉴于线粒体DNA控制区变异速度快的特点，利用圆口铜鱼线粒体DNA控制区进行鱼类遗传信息分析的方法能更有效地检测不同地区圆口铜鱼群体遗传信息、分析遗传多样性，分析群体的遗传结构和遗传分化水平，快速准确且简单实用。

附图说明

图1为不同方法提取圆口铜鱼基因组DNA的凝胶电泳图；其中，1、2、3为酚-氯仿法提取法，4、5、6为试剂盒提取法，7为空白对照，M为DNA分子量标准DL-2000。

图2为PCR扩增不同地区圆口铜鱼mt DNA控制区的电泳图，其中，1为雅砻江金河的样本，2为金沙江下游皎平渡的样本，3为金沙江下游永善的样本，4为金沙江下游绥江的样本，5为长江上游宜宾的样本，6为长江上游江津的样本；7为空白对照；M为DNA分子量标准DL-2000。

图3为2014年采自金沙江下游皎平渡的圆口铜鱼样本PCR扩增mt DNA控制区所得产物的部分序列。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

1.圆口铜鱼鱼类基因组DNA提取方法

1.1.酚-氯仿法：

取0.1g样品，置于1.5ml离心管中剪碎。加入700μl细胞裂解液，再加10％SDS 50μl和蛋白酶K 6μl(20mg/ml)，颠倒混匀，55℃过夜水浴。加等体积PIC(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)到样品处理液中，混匀。10000rpm室温离心10min，收集上清液，加入氯仿异戊醇，反复抽提2-3次，至水相澄澈。加入冰冻无水乙醇500μl，颠倒混匀以沉淀DNA，放入冰箱(-20℃)冷冻2小时候取出，吸出DNA放入新离心管，用70％乙醇清洗3遍，再用无水乙醇清洗1遍，置于超净工作台中，待乙醇挥发完毕，加入50μl TE溶解，分装后保存。

1.2.DNA提取试剂盒法：

取25mg组织，切成小块，放入1.5ml的离心管中，加入180μl的Buffer ATL。加入20μl的蛋白酶K，涡旋震荡(5-10s)，56℃孵育直至组织消化完全，一般为1-3小时，偶尔间断的拿出震荡。涡旋震荡15s，加入200μl的Buffer AL，涡旋充分混匀，加入200μl的(96％-100％)的酒精，涡旋充分混匀(注：样多时可将AL和酒精预混以节省时间)。转移所有混合液至DNeasy Mini spin离心柱，柱子放在2ml的收集管上(已提供)，≧6000g(8000rpm)离心1分钟，弃收集管/液。将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)加500μl缓冲液AW1，≧6000g(8000rpm)离心1分钟，弃收集管/液。将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)，加500μl缓冲液AW2，20000g(14000rpm)离心3分钟，弃收集管/液。将离心柱放在一个新的1.5或2ml离心管(自备)上，吸200μl的缓冲液AE在吸附膜上，室温1分钟，≧6000g(8000rpm)离心1分钟，重复一次。

2.引物设计

扩增引物由两条单链寡核苷酸组成：

上游引物CGU-dlp-S有25个碱基：AAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGA；

下游引物CGU-dlp-A有21个碱基：CTCACGGGGTTGCGGAGACTT。

3.在引物的作用下进行PCR反应

PCR反应体系为40μL，内含模板DNA(20～50ng/μL)，引物CGU-dlp-S(10μM)和引物CGU-dlp-A(10μM)，Ex-Taq酶(5U/μL)，10×Ex-Taq Buffer(Mg

扩增条件为：95℃预变性5min，随后94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃充分延伸10min。扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。

4.测序

采用PCR扩增产物直接测序，测序引物为扩增引物CGU-dlp-S和CGU-dlp-A，测序分析仪为ABI3730型全自动DNA测序仪。

5.遗传信息分析

测序获得2012-2014年所采集的336尾圆口铜鱼线粒体DNA控制区序列，按照样品相对于向家坝的位置，将其分成2个群体进行分析，即向家坝坝上群体(XJBBS)和向家坝坝下群体(XJBBX)。利用软件MEGA 6对得到的线粒体D-loop序列进行排序，并对照图谱人工检验序列中可能的错误。使用DNAsp V5.00计算单倍型数h、多态位点数S、单倍型多样性Hd和核苷酸多样性指数π等遗传多样性参数。结果如表1所示，170尾坝上群体样本定义了较多的单倍型和多态位点，57个单倍型，44个多态位点；166尾坝下群体样本定义的单倍型和多态位点较少，为52个单倍型，41个多态位点。坝上群体具有更高的单倍型多态性(Hd)和核苷酸多样性(π)，分别为0.95507和0.00522，而坝下群体的稍低，分别为0.95276和0.00498。

表1向家坝坝上、坝下圆口铜鱼群体在线粒体D-loop区的遗传多样性特征

使用ARLEQUIN 3.1软件对群体间遗传分化系数Fst值进行计算和检验，并进行AMOVA分析。表2显示了AMOVA的分析结果，群体内的分子遗传变异是变异的主要来源，占变异的99.99％，而群体间的变异仅为0.01％。表3显示了圆口铜鱼坝上群体和坝下群体间的遗传分化系数，Fst值很小，仅0.00008，P>0.05，未达到显著水平。

表2坝上、坝下圆口铜鱼群体线粒体D-loop区标记的分子方差分析(AMOVA)

表3坝上、坝下圆口铜鱼群体之间的Fst值(对角线下)和对应P值(对角线上)

不同方法提取基因组DNA的凝胶电泳图如图1所示，1、2、3为酚-氯仿法提取法，4、5、6为试剂盒提取法；7为空白对照；M为DNA分子量标准DL-2000。

PCR扩增圆口铜鱼mt DNA控制区的电泳图如图2所示，1、2、3为酚-氯仿法提取法，4、5、6为试剂盒提取法；1为雅砻江金河的样本，2为金沙江下游皎平渡的样本，3为金沙江下游永善的样本，4为金沙江下游绥江的样本，5为长江上游宜宾的样本，6为长江上游江津的样本；7为空白对照；M为DNA分子量标准DL-2000。

PCR扩增圆口铜鱼mt DNA控制区所得产物经测序仪后的部分序列如图3所示，为2014年采自金沙江下游皎平渡的样本，序列如SEQ ID NO:3所示。通过对序列结果进行分析，即可获得群体的遗传多样性水平和遗传结构，并可开展群体间的遗传分化研究。

SEQ ID NO:3：

CTTCCCAAAGGCTAGAATCTAAACTAAACTATCTCTGATAGTAACATGTATGTCCTAGTACATATTATGCATAATATTACATAATGTAATGGTACATATATATGTATTATCACCATTAAATTATTTTAACCCCAAAGCAGGTACTAACATCTAAAACGTACATAAACCAAATTATTAAAACTCAGAAATAATTTATTTTAACCCGGGAAATAGATTACTCCCCTAAACATGGTCCTCAGATTTTTCCTTGAAAGACTCAACTAAGATTTAATTAAAACATATTAATGTAGTAAGAGACCACCAACTGGTCTACATTAAGGCATACTATTAATGATAGAATCAGGGACACAAAATGTGGGGGTCGCACAATGTGAACTATTCCTGGTATCTGGTTCCTATTTCAGGTACATAACTGTAATACCCCCTCTCGGATAATTATACTGGCATCTGATTAATGGTGTAATTACATACTCCTCGTTACCCAACATGCCGGGCATTCTTTTATATGCATAGGGTTCTCTTTTTTAGGTTTCCTTTCATTTTGCATCTCAGAGTGCAAGCACAAATGGTAAATCAAGGTTGAACATTTTCCCTGCTTAAGTTAAAGTAGGTTAATTATTAAAAGACATAACTTAAGAATAACATATTACTAACTCAAGTGCATAACATATCTATTACTTCTTCAGTTAACCCTTATATATACGCCCCCCCTTTCGGTTTTTGCGCGACAAACCCCCCTACCCCCTACGCTCAGCGAATCCTGTTATCCTTGTCAAACCCCGAAACCAAGGAAGGCCCGAGAACGTGCAAGCTAACAAGTTGAGATATGGGTTAGCCATCCGCATTGTATATATATACATGCACATCGCATTAACTCACCACACAAAACCCCCAAAATATTAGCCTAATATTTACTACTAAAATTTTAACAAATTTATCAATGCTAAAAATTCCAATATTACAGCGCTAACGTAGCTTAAGC

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所

<120> 一种圆口铜鱼线粒体基因组控制区扩增引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcatcggt cttgtaatcc gaaga 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcacggggt tgcggagact t 21

<210> 3

<211> 982

<212> DNA

<213> 圆口铜鱼线粒体控制区

<400> 3

cttcccaaag gctagaatct aaactaaact atctctgata gtaacatgta tgtcctagta 60

catattatgc ataatattac ataatgtaat ggtacatata tatgtattat caccattaaa 120

ttattttaac cccaaagcag gtactaacat ctaaaacgta cataaaccaa attattaaaa 180

ctcagaaata atttatttta acccgggaaa tagattactc ccctaaacat ggtcctcaga 240

tttttccttg aaagactcaa ctaagattta attaaaacat attaatgtag taagagacca 300

ccaactggtc tacattaagg catactatta atgatagaat cagggacaca aaatgtgggg 360

gtcgcacaat gtgaactatt cctggtatct ggttcctatt tcaggtacat aactgtaata 420

ccccctctcg gataattata ctggcatctg attaatggtg taattacata ctcctcgtta 480

cccaacatgc cgggcattct tttatatgca tagggttctc ttttttaggt ttcctttcat 540

tttgcatctc agagtgcaag cacaaatggt aaatcaaggt tgaacatttt ccctgcttaa 600

gttaaagtag gttaattatt aaaagacata acttaagaat aacatattac taactcaagt 660

gcataacata tctattactt cttcagttaa cccttatata tacgcccccc ctttcggttt 720

ttgcgcgaca aaccccccta ccccctacgc tcagcgaatc ctgttatcct tgtcaaaccc 780

cgaaaccaag gaaggcccga gaacgtgcaa gctaacaagt tgagatatgg gttagccatc 840

cgcattgtat atatatacat gcacatcgca ttaactcacc acacaaaacc cccaaaatat 900

tagcctaata tttactacta aaattttaac aaatttatca atgctaaaaa ttccaatatt 960

acagcgctaa cgtagcttaa gc 982