一种同时测定酒醅中氨基甲酸乙酯和尿素含量的方法

摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时测定酒醅中氨基甲酸乙酯和尿素含量的方法。本发明提供了一种氨基甲酸乙酯和尿素的检测方法，所述方法包括使用高效液相色谱法同时测定酒醅样品中所述的氨基甲酸乙酯和尿素。本发明以乙醇为溶剂，通过均质、离心、净化、衍生后进液相色谱分析。本发明的这种方法，具有快速、稳定、准确的特点，提高了酒醅中氨基甲酸乙酯和尿素检测分析效率，为白酒发酵过程中氨基甲酸乙酯的研究提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时测定酒醅中氨基甲酸乙酯和尿素含量的方法。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)，又称脲烷(Urethane)，是发酵食品和酒精饮料在发酵、贮存过程中产生的一种副产物，广泛应用于商业和医学领域。EC对多种动物(鼠、仓鼠和猴子等)具有遗传毒性和致癌性，对人类具有潜在的致癌风险。2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将EC由2B类致癌物重新归类为2A类(很可能对人类致癌)致癌物。

中国白酒采用独特的固态发酵模式，以大曲、小曲作为微生物源进行糖化和发酵，其多种微生物自然接种以及长时间的固态发酵生产方式增加了白酒酿造过程中EC产生机理研究的复杂性。目前，报道的关于白酒中EC的机理研究存在局限性，范文来等

范文来等人采用了顶空固相微萃取技术结合气相色谱-质谱检测白酒酒醅中氨基甲酸乙酯的含量(耗时约110min)，采用比色法测定了酒醅中尿素浓度(耗时约45min)，并研究了不同香型酒醅中尿素和EC的变化趋势。曾婷婷等人采用了GC-MS检测特香型酒醅中氨基甲酸乙酯含量(耗时约65min)，液相色谱荧光检测器测定酒醅中尿素浓度(仅前处理耗时约40min)。以上方法检测酒醅中EC和尿素含量，均采用了不同的检测方法，不同的检测仪器，单个方法前处理也较复杂，耗时长，且对人员的要求较高。

发明内容

一些实施方案中，本发明提供了一种氨基甲酸乙酯和尿素的检测方法，所述方法包括使用高效液相色谱法同时测定酒醅样品中所述的氨基甲酸乙酯和尿素。

一些实施方案中，所述方法包括酒醅样品的前处理步骤，所述前处理步骤中使用乙醇溶液对所述的酒醅样品进行提取。

一些实施方案中，所述乙醇的浓度为0～100％(v/v)。

一些实施方案中，所述乙醇的浓度为0～75％(v/v)。

一些实施方案中，所述乙醇的浓度为0～60％(v/v)。

一些实施方案中，所述乙醇的浓度为15～60％(v/v)。

一些实施方案中，所述乙醇的浓度为20～60％(v/v)。

一些实施方案中，所述提取方法包括均质、浸泡过夜或超声。

一些实施方案中，所述提取方法为均质。

一些实施方案中，所述均质时间为1～30min。

一些实施方案中，所述均质时间为1～5min。

一些实施方案中，所述均质时间为2～4min。

一些实施方案中，所述的方法包括以下步骤：(1)取出酒醅样品加入乙醇进行均质；(2)均质完成后离心，取上清液；(3)活性炭净化；(4)衍生；(5)衍生后进样，使用高效液相色谱法进行分析。

一些实施方案中，所述步骤(3)中的净化使用的是活性炭。

一些实施方案中，所述净化用活性炭为0.5～2.0％。

一些实施方案中，所述净化用活性炭为2.0～4.0％。

一些实施方案中，所述净化用活性炭为2.0～5.0％。

一些实施方案中，所述步骤(4)中衍生所使用的试剂为9-羟基顿和盐酸。

一些实施方案中，所述步骤(4)中加入9-羟基顿体积为400～800μL。

一些实施方案中，所述9-羟基顿的浓度为0.02mol/L。

一些实施方案中，所述步骤(4)中加入的9-羟基顿的量为与加入的酒醅样品量的比例为0.002～0.008mM/g。

一些实施方案中，所述步骤(4)中加入的9-羟基顿的量为与加入的酒醅样品量的比例为0.003～0.007mM/g。

一些实施方案中，所述步骤(4)中使用的盐酸为0.1～1.0mol/L。

一些实施方案中，所述步骤(4)中的衍生时间为20～75min。

一些实施方案中，所述步骤(4)中的衍生温度为10～60℃。

一些实施方案中，所述的高效液相为高效液相色谱-荧光法。

一些实施方案中，所述色谱柱为C18柱。

一些实施方案中，所述色谱柱为AgilentEclipse XDB-C18柱。

一些实施方案中，所述色谱柱的规格为250mm×4.6mm，粒径为5μm。

一些实施方案中，所述的色谱流动相为乙腈和乙酸钠溶液。

一些实施方案中，所述的高效液相色谱-荧光法中的荧光检测器的增益值为10～13。

一些实施方案中，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中经蒸煮后的粮食发酵而成。

一些实施方案中，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中经蒸煮后的高粱发酵而成。

一些实施方案中，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中不同轮次的窖内发酵酒醅。

一些实施方案中，所述酒醅选自酱香型白酒生产过程中下沙-七轮次的窖内发酵酒醅。

一些实施方案中，所述酒醅样品选自堆积酒醅、窖内酒醅和出窖酒醅、蒸馏前后酒醅一种或多种。

一些实施方案中，所述酒醅为湿酒醅。

一些实施方案中，所述的色谱条件为：检测温度30℃，进样量30～40μL，乙腈和乙酸钠作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.5～2mL/min，分析时间为30～45min。

一些实施方案中，所述荧光检测器条件为：激发波长240nm，发射波长308nm，增益值10～13。在本发明中，检测对象为酒醅样品，酒醅属于酿酒发酵过程中的固态发酵基质，因酒醅基质复杂，提取液色素深和干扰物多。例如，本发明的酒醅与黄酒进行比较，两者之间差异巨大，两者之间不具备可互推性，差异包括：(1)基质不同：黄酒为液态，基质均匀，且黄酒发酵过程为添加菌株发酵，代谢产物相对简单，而酱香型白酒酿造为敞开式、多菌种固态发酵，微生物代谢产物极其复杂，并且酒醅基质为固态，因此目标物提取、净化难度大。(2)基质中目标物含量不同：据文献

可见，本发明中酒醅样品是非常复杂的，无法从白酒等的检测方法进行简单互推，况且EC检测本身存在一定的难度，检测酒醅样品中的EC更是难上加难。

一些实施方案中，本发明提供了所述的方法在判断白酒酒醅质量方面的应用。

本发明利用EC、尿素均可通过液相色谱荧光检测器检测的特点，通过对提取溶剂、提取方式、衍生条件的优化，开发了一种白酒酒醅中EC和尿素的同时检测方法，耗时约120min，提高酒醅中EC、尿素的分析效率。

附图说明

图1氨基甲酸乙酯、尿素液相色谱图。

图2不同乙醇浓度对目标物提取效果的影响。

图3不同提取方式对目标物提取效果的影响。

图4不同均质时间对目标物提取效果的影响。

图5不同活性炭添加量对目标物的检测影响。

图6衍生试剂添加量对目标物检测的影响。

图7不同衍生时间对目标物检测的影响。

图8不同衍生温度对目标物检测的影响。

图9不同盐酸浓度对目标物检测稳定性的影响。

图10不同增益值对目标物检测的影响。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

氨基甲酸乙酯标品(sigma)，尿素标品(sigma)，乙酸钠(Sigma)，9-羟基顿(Sigma)，浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)，无水乙醇、正丙醇、乙腈、无水乙酸均为色谱纯，购自美国天地公司。

Agilent1260高效液相色谱仪配荧光检测器，梅特勒-托里多pH计，离心机，艾科浦超纯水机，数控超声波清洗器、离心机，均质机。

色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。

本发明中的“湿酒醅”指的是酱香型白酒酿造过程中下沙至七轮次的发酵、蒸馏前后基质酒醅，以下实施例中具体使用的酒醅为四轮次出窖酒醅。

本文中，“均质”指的是将液态物料中的固体颗粒打碎，使固体颗粒实现超细化，并形成均匀的悬浮乳化液，使目标物更好的溶于溶剂中。

本文中，“增益值”指的是对元器件、电路、设备或系统，其电流、电压或功率增加的程度。简单理解增益值就是对信号放大的程度，增大增益值，对信号的放大作用越强。

实施例1高效液相色谱荧光法同时测定酒醅中的氨基甲酸乙酯、尿素的含量

1、实验方法：

标准溶液的配制

氨基甲酸乙酯、尿素储备液配置：准确分别称取氨基甲酸乙酯、尿素标准品0.1000g于100mL容量瓶中，用无水乙醇为溶剂定容，配制成1000mg/L的氨基甲酸乙酯、尿素标准储备液，置于4℃条件下保存。

混合标准使用溶液：准确量取氨基甲酸乙酯标准储备液10μL和尿素标准储备液1mL(因酒醅中尿素含量高，故移取1mL)至同一个10mL容量瓶中，用40％乙醇定容至10mL，4℃保存备用。混合标准液中，氨基甲酸乙酯浓度为1000μg/L，尿素浓度为100mg/mL。

9-羟基顿溶液：准确称取0.3965g的9-羟基顿，用正丙醇溶解并定容至100mL，浓度为0.02mol/L。避光冷藏(4℃)贮存。

2、样品前处理方法：

(1)取湿酒醅5.0g置于50mL离心管中，加入10mL 40％乙醇(加水配制)溶液，均质2min。

(2)均质完成后离心(6000rpm/min)5min，取1.5mL上清液于2mL圆底离心管，加入3.0％(w/v，即0.045g)活性炭净化，在4℃温度下，12000rpm/min离心10min，取上清液备用，标记为溶液1。

(3)取0.6mL溶液1加入到2mL的PV离心管中，在避光的条件下，加入0.6mL的9-羟基顿(原始浓度为0.02mol/L)，0.1mL的盐酸溶液(原始浓度为0.3mol/L)，混匀后置于暗处30℃衍生40min，衍生后用0.45μm的滤膜过滤后上机检测。

3、仪器条件：

高效液相色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃；荧光检测器：激发和发射波长分别为240nm和308nm，增益值12；流动相：超纯水、乙腈和乙酸钠(0.02mol/L)，梯度洗脱，流速为1mL/min，分析时间39.0min，洗脱条件见表1；进样量40μL。

表1梯度洗脱条件

4、方法学评价：

(1)线性范围和检出限

以40％乙醇将所述的混合标准使用溶液逐级稀释为氨基甲酸乙酯质量浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0μg/L，尿素质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/L的混合标准溶液，以上述步骤3的仪器条件下进行测定，采用外标法定量。得到的氨基甲酸乙酯与尿素的色谱图见图1。以目标物的浓度为纵坐标Y(μg/L)，以相应的色谱峰面积(X)为横坐标，绘制标准曲线。以信噪比(S/N)为3和信噪比(S/N)为10计算氨基甲酸乙酯、尿素的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，两种化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表1。

表1线性参数及其检出限、定量限

(2)回收率

在待测酒醅样品中加入EC标准溶液和尿素标准溶液，使EC配制成加标浓度为20.0、50.0、100.0μg/L的加标样品，尿素配制成加标浓度为1.0、5.0、10.0mg/L的加标样品，按上述方法进行前处理，然后进仪器分析，每个添加水平做3次平行实验，最后计算平均回收率，验证方法的准确度，结果见表2。对于3种不同的加标量，EC和尿素的回收率在80.5％～91.3％之间，相对标准偏差(RSD)在0.7％～2.7％范围内。可见此方法检测酒醅中的EC和尿素具有较好的回收率，稳定性较好。

表2.样品加标回收实验结果

(3)精密度和稳定性实验

分别配制两种混合标准溶液(EC浓度分别为10.0、50.0μg/L；尿素浓度分别为1.0mg/L、10mg/L)，重复测定6次；随机取一样品，按上述方法进行样品前处理，平行样品6份，进仪器分析。分别验证仪器与方法的精密度和稳定性，结果见表3，从表中可看出浓度为10.0、50.0μg/L的EC标样和1.0mg/L、10.0mg/L的尿素标样的RSD值范围在0.8％～5.4％，样品中EC、尿素相对标准偏差RSD值分别为2.1％、4.9％，表明该方法具有良好的精密度和稳定性。

表3方法的精密度和稳定性

实施例2：不同乙醇体积浓度对目标物提取效果的影响

本发明分析了不同乙醇浓度对目标物提取效果的影响，乙醇体积浓度如下，其余的实验步骤同实施例1。

乙醇体积浓度1为:0％乙醇水

乙醇体积浓度2为:20％乙醇水

乙醇体积浓度3为:40％乙醇水

乙醇体积浓度4为:60％乙醇水

乙醇体积浓度5为:80％乙醇水

乙醇体积浓度6为:100％乙醇水

不同提取溶剂对目标物的提取效果影响较大，根据EC、尿素在乙醇中易溶的特点，本实验考察了6种不同乙醇浓度对酒醅中氨基甲酸乙酯、尿素提取效果的影响。选取EC和尿素的响应值为考察结果，如图2。结果表明：随乙醇体积浓度的增加，目标化合物的响应先增加而后呈降低趋势，40％乙醇体积浓度作为提取溶剂时目标物响应达到最高；当乙醇体积浓度继续增高，其响应呈下降趋势。综上选择40％乙醇为最佳提取溶剂。

实施例3：不同提取方式对目标物提取效果的影响

本发明分析了不同提取方式对目标物提取效果的影响，提取方式如下，其余的实验步骤同实施例1。

提取方式1：均质

提取方式2：浸泡过夜

提取方式3：超声30min

本实验考察了3种提取方式对酒醅中氨基甲酸乙酯、尿素提取效果的影响。结果表明：均质的提取方式效果最好。如图3，结果显示均质提取的目标物响应高于浸泡、超声提取方式。三种提取方式均是为了使目标化合物能更好的溶解于提取溶剂中，因酒醅基质中70％以上是颗粒状的高粱，浸泡、超声只能使高粱表皮中的目标物溶解出，对于高粱颗粒内部目标物的较难溶出。而通过均质，将颗粒状的基质破碎，使目标化合物更容易溶出。

实施例4：不同均质时间对目标物提取效果的影响

本发明分析了不同均质时间对目标物提取效果的影响，超声时间如下，其余的实验步骤同实施例1。

均质时间1：1min

均质时间2：2min

均质时间3：3min

均质时间4：4min

本实验考察了4种不同均质时间对酒醅中氨基甲酸乙酯、尿素提取效果的影响。选取EC和尿素的响应值为考察目标，如图4，随着均质时间的延长，EC和尿素的提取效率增加，目标物不断溶解于提取溶剂中，而后因目标物基本全部溶于提取溶剂，即使均质时间延长，目标物的量也未增加。最佳的均质时间为2min。

实施例5：不同活性炭添加量对目标物检测的影响

本发明考察了提取液在不同活性炭添加量后对目标物检测的影响，活性炭添加量(w/v，即加入的活性炭的质量在所取的酒醅提取液中质量体积浓度)如下，其余的实验步骤同实施例1。

活性炭添加量1为：0.5％

活性炭添加量2为：2％

活性炭添加量3为：3％

活性炭添加量4为：4％

活性炭添加量5为：5％

酒醅提取液中色素较深、含丰富的有机酸、糖类、酯类等干扰物，特别是后期轮次酒醅，由于其反复发酵蒸煮，代谢产物复杂。本发明考察了5种活性炭添加量的净化效果，结果如图5所示，随活性炭添加量的增加，EC、尿素的响应值先增加后减小，这是因为活性炭添加量较少时，对样品的净化不充分，影响目标物的响应，当活性炭添加量较多是，可能对目标物有吸附作用，导致目标物响应降低。因此最佳活性炭添加量为3％。

实施例6：衍生试剂添加量的选择

本发明考察了衍生试剂添加量对目标物检测的影响，衍生试剂(即为实施例1配制的9-羟基顿溶液)添加量如下，其余的实验步骤同实施例1。

9-羟基顿添加量1为：400μL

9-羟基顿添加量2为：500μL

9-羟基顿添加量3为：600μL

9-羟基顿添加量4为：700μL

9-羟基顿添加量5为：800μL

本实验考察9-羟基顿的7种添加量对目标物检测峰的影响，如图6所示。结果表明：随着9-羟基顿添加量的增加，目标物响应呈先增加而后平缓，当9-羟基顿量足够时，目标物衍生完全，其响应值也不在增加。选择最佳衍生试剂添加量为600μL。

实施例6：不同衍生时间对目标物检测的影响

本发明考察了不同衍生时间对目标物检测的影响，衍生时间如下，其余的实验步骤同实施例1。

衍生时间1：30min

衍生时间2：40min

衍生时间3：50min

衍生时间4：70min

衍生时间对目标物的衍生效果有直接的影响。本实验考察了4种不同衍生时间对目标物的检测影响，见图7。结果表明：随着衍生时间的增加，目标物的响应值不断增大而后呈平缓趋势，衍生40min以后，目标物响应不再随时间增加而增加。所以选择最优衍生时间为40min。

实施例7：不同衍生温度对目标物检测的影响

本发明考察了不同衍生温度对目标物检测的影响，衍生温度如下，其余的实验步骤同实施例1。

衍生温度1:20℃

衍生温度2:30℃

衍生温度3:40℃

衍生温度4:50℃

衍生温度5:60℃

实验讨论：

本实验考察了5种不同衍生温度下对目标物检测的影响，见图8。结果显示：EC随衍生温度的增加，其响应值呈先增加后降低的趋势，尿素在20℃～40℃时，其响应值无显著变化，当温度不断升高后，尿素的响应值降低。结合EC的响应值情况，选择衍生温度为30℃为最优。

实施例8：不同浓度的盐酸溶液对目标物检测稳定性的影响

本发明考察了不同浓度的盐酸溶液(原始浓度)对目标物检测稳定性的影响，盐酸浓度如下，其余的实验步骤同实施例1。

盐酸浓度1:0.1mol/L

盐酸浓度2:0.3mol/L

盐酸浓度3:0.5mol/L

盐酸浓度4:0.8mol/L

盐酸浓度5:1.0mol/L

在5种不同盐酸浓度条件下衍生的样品在24h内测定6次，计算其RSD值，考察盐酸浓度对目标物检测稳定性的影响，结果见图9。酒醅中基质很复杂，其在衍生过程中，加入盐酸，使其衍生环境在酸性环境下进行，不同的盐酸浓度对目标化合物的稳定性影响较大。随盐酸浓度的增加目标化合物的RSD值先减小后增加，盐酸浓度为0.3mol/L时，目标化合物的RSD值(n＝6)小于10％。因此选择最佳盐酸浓度为0.3mol/L。

实施例9：不同增益值对目标物检测的影响

本发明考察了荧光检测器不同增益值对目标物检测的影响，增益值如下，其余的实验步骤同实施例1。

增益值1:10

增益值2:11

增益值3:12

增益值4:13

随增益值倍数增大，样品信号也被放大，合适的增益值可以使目标化合物响应增高，提高检测灵敏度。本实验考察了4种不同增益值对目标物检测的影响(见图10)，结果表明，当增益值为12时，目标化合物响应高。

参考文献：

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