美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用

摘要

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用。包括浓度大于1.0×109cfu/ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液作为抗原，以及美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡抗血清样本。本发明通过制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗，免疫SPF鸡，以获得抗美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度和间接ELISA结果判定标准，分析间接ELISA方法的敏感性、特异性和重复性，实现快速简便、特异性好、敏感度高的检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，从而为养殖生产中有效防控美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染提供保障技术。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用。

背景技术

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae PDD)是弧菌科发光杆菌属细菌美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中。该菌对鱼类、软体动物、甲壳类、爬行类、哺乳类等海洋动物都有较强的致病性，没有明显的宿主特异性。在我国，多种经济海水养殖鱼类，如许氏平鲉(Sebastes schlegeli)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和大黄鱼(Larimichthyscrocea)等都有因感染美人鱼发光杆菌美人鱼亚种发病而造成严重经济损失的案例报道。此外，该菌还能通过伤口接触海水或食用海鲜等途径感染人，导致人严重的坏死性筋膜炎、伤口感染、败血症等症状，甚至能在短时间内导致人死亡，是少有的来自海洋环境的人鱼共患菌。

目前，有关美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的流行病学、病原学、致病机理等方面已有大量研究，但是对该菌诊断和治疗方法的研究还相对较少。现阶段，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种主要依赖于传统的细菌分离纯化和基因序列比对等分子生物学方法进行鉴定，缺乏快速有效的针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法。ELISA检测是基于蛋白特异性结合原理，具有敏感度高、特异性好、易于操作和标准化等优点。根据现有报道，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种已经广泛分布于我国四大海区沿海水域环境中，对海水养殖产业的健康发展构成了新的威胁。因此，开发针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法及试剂盒，有助于在养殖生产中快速鉴别美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，精准防控该菌的传播流行，保障渔业生产安全，为产业的健康发展提供有力的技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现阶段美人鱼发光杆菌美人鱼亚种主要依赖于传统的细菌分离纯化和基因序列比对等分子生物学方法进行鉴定，缺乏快速有效的针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒及其应用，通过制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗，免疫SPF鸡，以获得抗美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度和间接ELISA结果判定标准，分析间接ELISA方法的敏感性、特异性和重复性，实现快速简便、特异性好、敏感度高的检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，从而为养殖生产中有效防控美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染提供保障技术。

为达到上述目的，本发明公开了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，包括以浓度大于1.0×10

进一步的，所述抗原为用甲醛溶液制备浓度大于1.0×10

进一步的，所述抗原的制备步骤如下：

(1-1)活化菌体：将保存的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌种接种于TSB琼脂平板培养基上；

(1-2)制备种子液：挑取单菌落接种于少量TSB液体培养基中振荡培养；

(1-3)扩大培养：取少量种子液接种于TSB液体培养基中振荡培养；

(1-4)灭活：离心后获取菌体沉淀，加入含有0.5％甲醛的PBS溶液重悬至原来的体积；

(1-5)灭活检验：取灭活后的菌液涂布于TSB琼脂平板培养基上检验是否灭活合格。

进一步的，所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡抗血清样本的制备步骤如下：

(2-1)将灭活菌液与佐剂按3:7的体积比混合后乳化制成免疫用疫苗；

(2-2)用(2-1)中制成的疫苗分4次免疫健康SPF鸡；

(2-3)待第4次免疫结束后适时采集鸡血，制备血清，-20℃冰箱保存备用。

上述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒在间接ELISA方法检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种中的应用。

利用上述试剂盒对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行间接ELISA检测，包括以下步骤：

(1)将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液在液氮和温水浴之间反复冻融，破碎菌体；

(2)用包被缓冲液将灭活菌液稀释至l0

(3)倾去孔中液体，在吸水纸上拍干，加入100μL洗涤液冲洗酶标板，在吸水纸上拍干，如此反复洗涤3次；

(4)加入5％脱脂奶粉液，300μL/孔，37℃封闭2h，洗涤3次；

(5)加入100μLBSA稀释液稀释的抗血清，37℃温育1h，每次都需加稀释液的对照组血清设立阴性对照和不加一抗的空白对照，洗涤3次；最后一次停留5min；

(6)用山羊源抗体专用稀释液将酶标二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡抗体)稀释8000倍，100μL/孔，37℃温育1h，洗涤3次；

(7)加入100μL底物四甲基联苯胺底物显色液，室温避光显色10min；

(8)每孔加入100uL终止液终止反应，用酶标仪测取OD

本发明的有益效果在于：

(1)对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的特异性强，灵敏度较高，检测结果通过酶标仪判读，减少主观性判断。

(2)操作简便易行，检测成本低廉，适宜推广。

(3)不需要无菌操作，可应用于现场检测，并进行大批量检测。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，包括浓度大于1.0×10

其中，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液的制备包括以下步骤：

(1)取-80℃冰箱保存的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株接种于TSB琼脂平板培养基上，28℃条件下倒置培养24h。

(2)挑取单菌落接种于20mLTSB培养基中，28℃、180r/min振荡培养8～10h，制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的种子液。

(3)取上述2mL的种子液接种于200mLTSB培养基中，28℃、180r/min振荡培养15～18h，制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的活菌液。

(4)取上述活菌液100μL梯度稀释后分别涂布于TSB琼脂平板培养基上计算细菌含量。同时，在4℃、9000r/min条件下离心活菌液9min后获取菌体沉淀，用无菌PBS重悬至原来的体积。向重悬的菌悬液中加入终浓度为0.5％的甲醛，28℃、180r/min摇床振荡灭活24h。

(5)取100μL灭活后菌液涂布于固体培养基上，若无菌落长出，证明灭活合格。将灭活合格的菌液分装于离心管中。4℃、9000r/min离心9min后倒去上清液，用无菌PBS重悬。

抗美人鱼发光杆菌美人鱼亚种鸡抗血清样本的制备包括以下步骤：

(1)将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液与商品化白油佐剂ISA71按3:7的体积比乳化制得免疫用疫苗。

(2)选取5只35日龄健康SPF鸡，共进行4次免疫，第1次免疫颈部皮下注射0.5mL灭活疫苗；2周后进行第2次免疫，颈部皮下注射0.8mL灭活疫苗；第2次免疫后2周后进行第3次免疫，胸部肌肉注射1mL灭活疫苗；第3次免疫后第3周进行第四次免疫，胸部肌肉注射1mL灭活疫苗。

(3)第4次免疫后1周从翅根静脉进行采血，血液37℃条件下静置3～4h后，低速离心收集血清，分装于离心管中，-20℃冰箱保存备用。在第1次免疫实验前，抽取血液制备鸡血清，作为阴性对照组血清。

利用上述试剂盒对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行间接ELISA检测，包括以下步骤：

(1)将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液在液氮和温水浴之间反复冻融5次，破碎菌体。

(2)用包被缓冲液将灭活菌液稀释至l0

(3)倾去孔中液体，在吸水纸上拍干，加入100μL洗涤液冲洗酶标板，在吸水纸上拍干，如此反复洗涤3次。

(4)加入5％脱脂奶粉，300μL/孔，37℃封闭2h。洗涤3次。

(5)加入100μLBSA稀释液稀释的抗血清，37℃温育1h，每次都需设立阴性对照(加稀释液的对照组血清)和空白对照(不加一抗)，洗涤3次。最后一次停留5min。

(6)用山羊源抗体专用稀释液将酶标二抗稀释8000倍，100μL/孔，37℃温育1h。洗涤3次。

(7)加入100μL底物显色液，室温避光显色10min。

(8)每孔加入100uL终止液终止反应。用酶标仪测取OD

用上述建立的间接ELISA方法对实验室菌种库保存的43株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行检测。检测结果中有43株全部呈阳性(表1)，相对符合率为100％。

表1美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA快速检测结果

对比实施例1：确定最佳抗原包被浓度

取抗美人鱼发光杆菌美人鱼亚种鸡阳性血清和阴性血清，以灭活菌液作为抗原建立ELISA检测方法，检测美人鱼发光杆菌血清抗体样品。在此过程中，优化抗原包被浓度、血清稀释度。

在确定最佳反应条件时，通常选择以能产生OD

将浓度大于l0

表2抗原最适包被浓度的确定

对比实施例2：确定免疫血清最适稀释度

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种抗原按最适工作浓度包被，将阳性血清和阴性血清分别按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10000进行系列稀释，每个稀释度2孔，进行间接ELISA法测定。如表3所示，当免疫血清稀释度为4000倍时，OD

表3免疫血清最适稀释度的确定

对比实施例3：ELISA方法的敏感性、特异性以及重复性分析

(1)敏感性分析

将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液用稀释液稀释至10

表4免疫血清敏感性实验结果

(2)特异性分析

交叉实验：用浓度均为10

阻断实验：用10

表5免疫血清交叉实验结果

表6免疫血清阻断实验结果

(3)重复性实验

按最适抗原包被浓度和最适血清稀释度条件作ELISA检测，每个样品检测7孔，根据OD

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的原理或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。