葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途

摘要

本申请提供了葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。葫芦巴碱能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，从而能够用来预防和/或治疗糖尿病心肌病，进而用于制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物。本申请还提供了包含葫芦巴碱的植物提取物、药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物中的用途。基于葫芦巴碱能够抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化，本申请还提供了葫芦巴碱及包含其的植物提取物、药物组合物，在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途。

说明书

技术领域

本申请涉及医药技术领域，特别是涉及葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。

背景技术

目前全球糖尿病患者达4.15亿，2018年“中国心血管病报告”显示中国成人糖尿病标化患病率已高达10.9％。据统计，70-80％糖尿病患者死于心血管并发症。糖尿病心肌病是糖尿病患者远期生存的主要威胁，由于糖尿病心肌病的病因病机复杂、起病缓慢、病程较长，虽然已采取控制血糖、血脂、血压等策略，但糖尿病患者的心肌损伤仍会持续发展、恶化，严重影响患者的生存率。因此，研究和开发新的糖尿病心肌病的治疗药物有重要的临床意义。

糖尿病心肌病的发病机制复杂，尚未完全阐明。在2型糖尿病患者中，游离脂肪酸水平、特别是饱和脂肪酸水平，明显高于健康人群。体内体外实验均证实，高水平的饱和脂肪酸(如棕榈酸)是糖尿病患者心肌细胞出现死亡、肥大的原因之一。越来越多的证据表明，心肌细胞死亡是糖尿病心肌病的病理基础。

葫芦巴碱(TRG，CAS号：535-83-1，结构式如式I所示)是从豆科植物蝶形花亚科葫芦巴属葫芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)的干燥种子中分离的一种生物碱，广泛分布于植物、海洋生物中，具有良好的应用前景。TRG具有降血糖、抗癌、促进神经组织再生、降低胆固醇、镇静等药理作用，但目前未见TRG在防治糖尿病心肌病方面的报道及应用。

发明内容

本申请的发明人通过深入研究，发现葫芦巴碱能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，从而可以用来预防和/或治疗糖尿病心肌病，并基于此完成了本申请。

本申请的第一方面提供葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。

本申请的第二方面提供葫芦巴碱在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途。

本申请的第三方面提供包含葫芦巴碱的植物提取物在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途，其中，所述植物提取物选自葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物和桑叶提取物中的至少一种。

本申请的第四方面提供包含葫芦巴碱的植物提取物在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途，其中，所述植物提取物选自葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物和桑叶提取物中的至少一种。

本申请的第五方面提供一种药物组合物，其包含葫芦巴碱及药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请的第六方面提供本申请第五方面的药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。

本申请的第七方面提供本申请第五方面的药物组合物在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途。

葫芦巴碱能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，从而能够用于预防和/或治疗糖尿病心肌病，进而用于制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物。进一步地，包含葫芦巴碱的植物提取物、药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物。葫芦巴碱能够抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化，从而能够用于制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物；进一步地，包含葫芦巴碱的植物提取物、药物组合物，同样能够用于制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1显示了葫芦巴碱对心肌细胞存活率的影响。

图2显示了葫芦巴碱对心肌细胞中caspase3、cleaved-caspase3蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请的第一方面提供葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。

发明人在研究中发现，本申请的葫芦巴碱，能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，从而能够用于预防和/或治疗糖尿病心肌病，进而用于制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物。

本申请中，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患糖尿病心肌病的哺乳动物个体(优选为人)采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患糖尿病心肌病或者对糖尿病心肌病具有罹患风险的哺乳动物个体采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

本申请的第二方面提供葫芦巴碱在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途。

本申请的葫芦巴碱能够抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化，从而用于制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物。发明人在研究中发现，心肌细胞中caspase3蛋白的活化，会引起心肌细胞凋亡，诱导心肌细胞损伤，而本申请的葫芦巴碱能够抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化，能够用于制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物，从而改善心肌细胞损伤。

本申请的第三方面提供包含葫芦巴碱的植物提取物在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途，其中，所述植物提取物选自葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物和桑叶提取物中的至少一种。

本申请所述的葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物、桑叶提取物的提取方式现有技术中多有报道，本申请对各药物提取物的提取方式没有特别限制，本领域技术人员可以通过现有的任意方式获取包含葫芦巴碱的葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物或桑叶提取物。在一种实施方式中，示例性地，可以将葫芦巴用70-80％乙醇溶液进行加热回流提取，得到包含葫芦巴碱的葫芦巴提取物。

本申请的第四方面提供包含葫芦巴碱的植物提取物在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途，其中，所述植物提取物选自葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物和桑叶提取物中的至少一种。

本申请的第五方面提供一种药物组合物，其包含葫芦巴碱及药学上可接受的载体或赋形剂。

在本申请第五方面的一些实施方式中，所述葫芦巴碱是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。

在本申请第五方面的一些实施方式中，所述植物提取物选自葫芦巴提取物、益母草提取物、金线莲提取物、紫茉莉提取物和桑叶提取物中的至少一种。

在本申请第五方面的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。

本文中，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本申请药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本申请的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本申请的药物组合物。根据本申请的药物组合物，其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)、或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

本申请的第六方面提供本申请第五方面的药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途。

本申请的第七方面提供本申请第五方面的药物组合物在制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物中的用途。

材料：H9C2心肌细胞：美国细胞培养收藏中心；葫芦巴碱(TRG)：上海源叶生物科技有限公司；棕榈酸(PA)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基：以色列BI公司；青链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25％胰蛋白酶-EDTA)：美国Gibco公司；CCK-8试剂(Cell CountingKit-8细胞计数试剂)盒：日本株式会社同仁化学研究所；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟溶液，PMSF)、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、10×电泳液、10×转膜液、10×TBST缓冲液、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；5×上样缓冲液(Loading Buffer)：上海碧云天生物技术有限公司；蛋白Marker：美国Thermo公司；Immobilon-P PVDF(0.45μm，26.5cm×3.75m roll 1/Pk)：美国Thermo公司；β-Actin(β-肌动蛋白)抗体：美国Santa Cruz生物技术公司；caspase3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)抗体：美国Cell Signaling Technology公司；cleaved-caspase3(切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)抗体：美国Cell SignalingTechnology公司；二抗(anti-rabbit IgG抗体)：美国Cell Signaling Technology公司；脱脂奶粉：美国BD公司；化学发光试剂：德国默克密理博公司。仪器：二氧化碳细胞孵育温箱：美国Thermo公司；INFINITEF50型酶标仪：瑞士TECAN公司；台式冷冻离心机：美国Thermo公司；A25977型电泳仪：美国Thermo公司；153BR型转膜仪：美国伯乐公司；TS-BS转移脱色摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Amersham Imager 600凝胶成像系统：日本GE公司。

下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。

实施例1葫芦巴碱对心肌细胞存活率的影响

棕榈酸诱导心肌细胞死亡是目前常用的实验用糖尿病心肌病模型。

大鼠心肌细胞H9C2培养于含10％胎牛血清、青霉素100U/mk、链霉素0.1mg/mL的DMEM高糖培养基(完全培养基)中。在37℃、5％CO

精密称取棕榈酸粉末于玻璃试管中，在90℃水浴条件下用0.1mol/L氢氧化钠溶液制备成0.1mol/L棕榈酸钠溶液；在55℃水浴条件下制备10％牛血清白蛋白(BSA)溶液；将二者按照1:9的比例充分混合，制备成10mmol/L棕榈酸储备液，0.22μm滤膜过滤后，于4℃保存。取棕榈酸储备液用完全培养基分别稀释成0.8mmol/L和0.4mmol/L的棕榈酸溶液。

精密称取5.06mg葫芦巴碱标准品，用0.461mL DMSO充分溶解，制备成80mmol/L的葫芦巴碱储备液，-20℃保存。临用前，取葫芦巴碱储备液用完全培养基稀释成40μmol/L葫芦巴碱稀释液。

取对数生长期的H9C2心肌细胞，胰蛋白酶常规消化并收集细胞，用完全培养基吹散细胞，调整细胞密度为8×10

实施例2葫芦巴碱抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化

细胞凋亡是细胞死亡的一种方式。心肌细胞中caspase3蛋白经切割、活化，形成cleaved-caspase3蛋白，而cleaved-caspase3蛋白的表达会致使心肌细胞凋亡，导致糖尿病心肌病的发生。

取实施例1中对数生长期的H9C2心肌细胞，胰蛋白酶常规消化并收集细胞，用完全培养基吹散细胞，调整细胞密度为8×10

配制8％分离胶溶液10mL：纯水4.8mL、30％丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis，29:1)2.7mL、SDS-PAGE分离胶缓冲液(4×)2.5mL、10％过硫酸铵(APS)0.1mL、四甲基二乙胺(TEMED)0.006mL，立即注入准备好的玻璃板间，上层加异丙醇压胶，室温静置2-3h使其凝固(以能看到水胶分界线为准)。回收上层异丙醇。配制5％浓缩胶溶液4mL：纯水2.28mL、30％Acr-Bis(29:1)0.68mL、SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(4×)1mL、10％APS 0.04mL、TEMED 0.004mL，立即注入玻璃板间，缓慢而垂直地插入梳子，避免产生气泡。待浓缩胶凝固后，将玻璃板放入电泳槽中，灌入电泳缓冲液，拔去梳子。

向上样泳道中依次加入10μL各组蛋白样品，并在两旁泳道分别加入4μL预染蛋白分子量Marker。板间加满电泳液，90V恒压电泳，当蛋白样品电泳至浓缩胶与分离胶交界处时，改为120V恒压电泳，待Loading Buffer电泳至距胶边缘0.3-0.5cm处时，停止电泳。剪取5×8cm PVDF膜(切角标记)，依次浸于甲醇、水和转膜液中各3min，甲醇回收，膜在转膜液中备用。将凝胶、PVDF膜、滤纸按下列顺序放好：负极板、1层海绵网、1层滤纸、凝胶、PVDF膜、1层滤纸、1层海绵网，赶尽气泡。将电极板放入转膜仪中，灌入转膜液。300mA低温恒流转膜1.5h。

封闭：转膜完成后将PVDF膜浸于5％脱脂奶粉中，室温封闭2h。裁膜：根据分子量裁剪目的条带。孵育一抗(caspase3抗体和cleaved-caspase3抗体)：膜分别浸入1×TBST溶液稀释的caspase3抗体和cleaved-caspase3抗体(稀释比例：1:1000)中，4℃孵育过夜。洗膜：1×TBST溶液洗膜，摇床振荡清洗4次，每次7min。孵育二抗(anti-rabbit IgG抗体)：膜浸入1×TBST溶液稀释的anti-rabbit IgG抗体(1:5000)中，室温振摇孵育1.5h。洗膜：1×TBST溶液洗膜，摇床振荡清洗4次，每次7min。将膜浸入显影液中30s。取出，放入凝胶成像仪中，运行凝胶成像程序，曝光1-7min，显影结果如图2的A图所示，采用ImageJ对A图的结果进行定量分析，结果如图2的B图所示。

根据图2可知，以β-actin为内参校正基因，与对照组相比，模型组心肌细胞的caspase3蛋白水平不变，但cleaved-caspase3蛋白水平明显增加(n＝3,*P<0.05)，且cleaved-caspase3/caspase3亦明显增加(n＝3,*P<0.05)，说明棕榈酸能诱导心肌细胞caspase3蛋白的活化，促进cleaved-caspase3蛋白的形成。与模型组相比，给药组的心肌细胞caspase3蛋白水平不变，但cleaved-caspase3蛋白水平明显降低(n＝3,*P<0.05)，且cleaved-caspase3/caspase3亦明显降低(n＝3,*P<0.05)，表明葫芦巴碱能够抑制棕榈酸诱导的心肌细胞caspase3蛋白的活化，抑制cleaved-caspase3蛋白的形成，从而抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌细胞损伤，从而用于预防和/或治疗糖尿病心肌病。

综上，葫芦巴碱能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，从而能够用于预防和/或治疗糖尿病心肌病，进而用于制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物。进一步地，葫芦巴碱能够抑制心肌细胞中caspase3蛋白的活化，从而能够用于制备抑制心肌细胞中caspase3蛋白活化的药物。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。