一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg3纳米结构脂质载体及其制作方法

摘要

本发明公开了一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg3纳米结构脂质载体及其制作方法，载体中，纳米结构脂质载体(NLC)将人参皂苷Rg3包裹在内，纳米结构脂质载体外侧被普鲁兰多糖(PUL)修饰，并增加其黏附性。本发明构建了普鲁兰多糖(PUL)修饰的人参皂苷Rg3纳米结构脂质载体，可以较长时间地滞留在胃组织中，促进人参皂苷Rg3的口服吸收，其主要通过细胞膜穴样凹陷介导的内吞途径促进人胃腺癌细胞BGC‑823细胞对其摄取。本发明具有胃黏附特性，可以较长时间地滞留在胃组织内，并促进胃癌细胞对药物的摄取，提高抗肿瘤作用。

说明书

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg

背景技术

人参是五加科人参属植物人参的干燥根，是我国传统名贵中药材，具有大补元气、补气益肺、安神益智的功效，药用历史悠久，素有“百草药王”的美誉，其中人参皂苷是人参中主要的有效成分。近年来研究发现，其化学成分中的人参皂苷Rg

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题，提供了一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg

一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg

本发明还公开了一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg

S1.将单硬脂酸甘油酯、人参皂苷Rg

S2.将PUL与TPGS共同溶于水中；

S3.将S1所得有机相在1000-1400r/min的搅拌下缓慢注入S2所得PUL与TPGS混合溶液中；在60-70℃下恒温搅拌，使有机溶剂挥发,2h后得到半透明乳液，对半透明乳液进行超声混合处理，得到PUL-Rg

作为改进，S1中所述单硬脂酸甘油酯、人参皂苷Rg

作为改进，所述人参皂苷Rg

本发明的优点在于：

本发明构建了普鲁兰多糖(PUL)修饰的人参皂苷Rg

本发明具有胃黏附特性，可以较长时间地滞留在胃组织内，并促进胃癌细胞对药物的摄取，提高抗肿瘤作用。

附图说明

图1为Rg

图2为Rg

图3为4,12,24,48h后，C6组、C6-NLC组和PUL-C6-NLC组在胃、小肠、结肠三个部位组织切片观察荧光强度；

图4为4h(A),12h(B)，24h(C)，48h(D)后，C6组、C6-NLC组和PUL-C6-NLC组在胃、小肠、结肠三个部位的组织匀浆上清液荧光强度

图5为孵育4h(A),8h(B)，12h(C)后不同实验分组对BGC-823细胞摄取的共聚焦观察及流式图(D)；

图6为孵育8h后不同实验分组对BGC-823细胞摄取的共聚焦观察(A)、流式图(B)和流式定量分析图

图7为Rg

图8为对照组、Rg

图9为BGC-823细胞接受不同处理后的细胞划痕实验(A)及划痕愈合率分析(B)；

图10为BGC-823细胞接受不同处理后的细胞侵袭(A)及定量分析(B)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好地理解本发明，但是下述实施例并不限定本发明的保护范围。

实施例1

本实施例公开了一种普鲁兰多糖修饰的人参皂苷Rg

S1.将60mg单硬脂酸甘油酯、16mg人参皂苷Rg

S2.将22mgPUL与100mgTPGS共同溶于10mL水中；

S6.将S1所得有机相，在1200r/min的搅拌下缓慢注入S2所得PUL与TPGS混合溶液中；在60-70℃下恒温搅拌，使有机溶剂挥发,2h后得到半透明乳液，对半透明乳液进行超声混合处理，得到PUL-Rg

本实施例设置对照组，对照组的制作方法为：

S1.将单硬脂酸甘油酯、人参皂苷Rg

S2.将TPGS溶于水中，得到水相；

S3.将有机相在1200r/min的搅拌下缓慢注入水相中；在40-70℃下恒温搅拌，使有机溶剂挥发，2h后得到半透明乳液；

S4.对半透明乳液进行超声混合处理，得到Rg

然后将对照组与实施例1中所得的PUL-Rg

1.粒径及Zeta电位测定

室温条件下，分别取Rg3-NLC分散液和PUL-Rg3-NLC分散液适量，经去离子水稀释到适宜浓度后，置于样品池中，分别用激光粒度分析仪测量粒径和Zeta电位。结果显示，Rg3-NLC粒径为(157±7.12)nm，PDI为0.145±0.0187，Zeta电位为(－15.93±0.91)mV；PUL-Rg3-NLC粒径为(102±1.89)nm，PDI为0.294±0.0465，Zeta电位为(－11.57±0.87)mV。

形态观察制备得的Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC均为球状，较圆整，平均粒径分别约为100，50nm，见图2。由于透射电镜观察前，Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC分散液经铜网充分干燥处理，即被去除了水化层，因此透射电镜测得的平均粒径较激光粒度分析仪测得的粒径小约50nm左右。

2.PUL-Rg3-NLC的体内黏附性研究

(1)荧光标记的普通纳米结构脂质载体和荧光标记的普鲁兰多糖修饰的纳米结构脂质载体的制备

使用C6作为荧光探针，其余辅料保持不变，依据实施例1中的制备方法，将人参皂苷Rg3组分替换为5mgC6，其他步骤不变，制得荧光标记的普通纳米结构脂质载体分散液，标记为C6-NLC。再按同样方法，在水相中加入PUL，制备荧光标记的PUL修饰的纳米结构脂质载体分散液，标记为PUL-C6-NLC。整个操作过程注意避光。

(2)体内黏附

BALB/c小鼠(体质量18～22g)，实验前禁食12h，自由饮水，麻醉前15min，灌胃给予pH7.4的PBS溶液0.5mL，冲洗胃肠道。对照组灌胃给予C6的生理盐水混悬液，其余2组分别灌胃给予C6-NLC分散液和PUL-C6-NLC分散液(C6的剂量均为5mg·kg

给药4h后，胃、小肠、结肠对游离C6组的吸收均较少，见图3。形成C6-NLC后，胃、小肠、结肠对C6的摄取均显著增加，表明普通纳米结构脂质载体对装载药物在口服吸收时，在3个部位均具有吸收促进作用。PUL修饰的纳米结构脂质载体(PUL-NLC)通过荧光标记形成PUL-C6-NLC后，对装载药物进行口服吸收评价时，在胃、小肠、结肠的吸收促进作用进一步增强。相比于其他各组，给药12h后，C6，C6-NLC和PUL-C6-NLC在胃部的蓄积达到峰值。给药24，48h后，C6组和C6-NLC组对C6在各组织的蓄积均较弱，而PUL-C6-NLC组仍有一定的蓄积，表明PUL-NLC具有黏附性，可以较长时间地驻留在组织器官中。

给药4h后，PUL-C6-NLC组在胃的组织匀浆上清液荧光强度分别是C6组和C6-NLC组的1.74，1.39倍，表明形成PUL-C6-NLC后，可以显著促进胃部组织装载药物的摄取，见图4。12h后，胃组织对C6组的摄取显著降低，与4h相比降低了44.33％，可能是由于胃排空造成的；反观C6-NLC和PUL-C6-NLC组，在胃部的摄取，仍较强，可能是形成纳米结构脂质载体促进摄取和提高滞留所造成的。PUL-C6-NLC组在胃的组织的荧光强度是C6-NLC组的1.47倍。给药24h后，C6组、C6-NLC组和PUL-C6-NLC组在胃部的荧光强度均显著降低，但是相比于C6组、C6-NLC组，PUL-C6-NLC组在胃的组织匀浆上清液荧光强度仍为最强，表明黏附纳米结构脂质载体(PUL-NLC)具有一定黏附性，可以较长时间地驻留在胃组织中。48h的结果表明，C6组、C6-NLC组以及PUL-C6-NLC组在各组织中没有显著性差异。此外，PUL-C6-NLC在胃部的摄取和蓄积显著优于小肠、结肠，因此可以推测在胃酸性条件下PUL-C6-NLC的黏附性强于其在小肠、结肠的碱性条件。综上所述，选择胃腺癌细胞进行进一步研究。

(3)人胃腺癌BGC-823细胞对PUL-C6-NLC的体外摄取及其机制评价

激光共聚焦见图5，人胃腺癌细胞BGC-823细胞对C6摄取的能力较弱，与细胞共孵育4h后，仅有较弱的绿色荧光(图5A)，随着孵育时间的延长(图5B，5C)，荧光强度逐渐增强。普通纳米结构脂质载体(NLC)也表现出促进BGC-823细胞对C6的摄取的功能，表明NLC对装载药物有吸收促进的作用。黏附纳米结构脂质载体(PUL-NLC)相比于普通纳米粒，能够显著促进BGC-823细胞的摄取，表明PUL-NLC对装载药物具有更显著的吸收促进作用。

流式定量分析见图5D，细胞与药物孵育4h后，相比于C6组和C6-NLC组，PUL-C6-NLC组的平均荧光强度分别增加了9.11，1.09倍；孵育8，12h后，PUL-C6-NLC组的荧光强度分别为1411.34，1522.47，相关结果表明BGC-823细胞对于PUL-C6-NLC的摄取接近饱和。但是，C6组和C6-NLC组随着时间的增加，荧光强度均显著增加，分别达到了649.06，1081.37，但是仍低于同时间的PUL-C6-NLC组。结果表明，PUL修饰NLC后显著提高了药物进入BGC-823细胞的量，增加药物摄取，且摄取存在饱和现象，孵育8h后，摄取近乎饱和。

为进一步评价PUL-C6-NLC的细胞摄取机制，实验选用高渗蔗糖(网格蛋白介导的内吞抑制剂)、阿米洛利(巨胞饮路径的抑制剂)和制霉菌素(细胞膜穴样凹陷介导的内吞抑制剂)对其摄取情况进行了研究。

激光共聚焦见图6A，首先采用3种抑制剂预孵育BGC-823细胞8h后，相比于PUL-C6-NLC组，加入化学抑制剂的3个实验组的细胞摄取均出现抑制现象。其中，“PUL-C6-NLC+制霉菌素”组的抑制效果＞“PUL-C6-NLC+阿米洛利”组的抑制效果＞“PUL-C6-NLC+高渗蔗糖”组的抑制效果。结果表明，3个途径均介导BGC-823细胞摄取，其中经细胞膜穴样凹陷介导的内吞途径优于巨胞饮通路介导的内吞途径优于网格蛋白结构介导的内吞途径。细胞膜穴样凹陷介导的内吞途径可能是BGC-823细胞对PUL-C6-NLC摄取的主要途径。

流式定量分析见图6B，6C，与PUL-C6-NLC组相比，采用制霉菌素孵育后，可以显著抑制BGC-823细胞对PUL-C6-NLC的摄取，C6摄取抑制率为48.8％，采用阿米洛利孵育后，C6摄取抑制率为37.3％，采用高渗蔗糖孵育后，C6摄取抑制率为22.8％。相关定量分析结果与定性分析结果一致。定量分析进一步证明，PUL-C6-NLC的BGC-823细胞摄取机制与高渗蔗糖、阿米洛利和制霉菌素抑制通路均有关，且细胞膜穴样凹陷介导的途径可能是BGC-823细胞对PUL-C6-NLC摄取的主要途径。

3.MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的人胃腺癌BGC-823细胞，消化、计数、配制成浓度为5×10

抑制率＝[(A空白对照组－A实验组)/A空白对照组]×100％。

计算各实验分组加药后72h的IC

MTT结果表明，人胃腺癌BGC-823细胞分别接受Rg3，Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC实验分组的不同处理后，见图7A～7C，Rg3，Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC对BGC-823的细胞毒性均具有剂量依赖性，即给药浓度越高，对肿瘤细胞的抑制率越高，肿瘤细胞的存活率越低。采用NLC装载Rg3后可以增加对BGC-823细胞的抑制作用，采用普鲁兰多糖修饰后，其对BGC-823细胞的抑制作用进一步增强。对于BGC-823细胞而言，Rg3组的IC

4.细胞凋亡

取对数生长期的人胃腺癌BGC-823细胞接种到6孔板中，次日，根据组别设计分别加入不含药的培养基、Rg3、Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC的培养基，孵育72h后收集细胞，用PBS洗涤细胞2次(1000r·min

对照组的BGC-823细胞凋亡率仅为2.19％±0.31％，没有显著的细胞凋亡，而给药Rg3后，BGC-823细胞的凋亡率显著增加到19.81％±2.71％，Rg3-NLC组的BGC-823细胞凋亡率为29.28％±4.11％，PUL-Rg3-NLC组的BGC-823细胞凋亡率为39.39％±4.95％，见图8。结果表明，Rg3组可以显著诱导BGC-823细胞凋亡；形成Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC后，相比于Rg3组诱导凋亡的作用分别提高了47.8％，98.9％，可见PUL修饰纳米结构脂质载体后，具有更显著的诱导细胞凋亡作用。

5.细胞划痕

在6孔板中加入约5×10

6.细胞侵袭

通过Transwell法检测BGC-823细胞的侵袭性。细胞撤去血清，使用不完全培养基饥饿培养24h。将Matrigel基质胶放置4℃过夜融化，将融化的Matrigel胶使用不完全培养基稀释一倍，Transwell上室加入30μL稀释的Matrigel，于37℃孵育120min，使Matrigel聚合成胶。取对数生长期的人胃腺癌BGC-823细胞，按3×10

与对照组相比，Rg3组、Rg3-NLC组和PUL-Rg3-NLC组细胞数均存在极显著性差异，见图10；与Rg3-NLC组相比，PUL-Rg3-NLC组亦存在极显著性差异，且细胞数降低了48.6％。结果表明，Rg3-NLC和PUL-Rg3-NLC均能降低人胃腺癌BGC-823细胞的侵袭能力，并且PUL修饰的PUL-Rg3-NLC对BGC-823细胞侵袭能力的抑制效果非常显著地优于不经PUL修饰的Rg3-NLC。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不等同于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，不脱离本发明的精神和范围下所做的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。