一种利用天蓝淡红链霉菌DM对中药来源蒽醌类产物的高效生物转化的方法

摘要

本发明涉及一种天蓝淡红链霉菌DM高效制备中药来源蒽醌类天然产物葡萄糖醛酸化的方法，属于生物催化领域。天蓝淡红链霉菌DM通过全细胞对3种中药蒽醌类成分包括：大黄素，茜素，吡啉进行高效生物催化，其生物转化率最高可以高达92％。本发明通过培养基筛选，转化条件摸索，高效制备蒽醌的葡萄糖醛酸化产物，解决了蒽醌类葡萄醛酸化产物的稀缺性，并且提高了蒽醌产物的水溶性以及抗氧化活性。

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种高效制备中药来源蒽醌葡萄糖醛酸化产物的方法。

背景技术

蒽醌类化合物种类繁多结构多样，并且分布十分广泛。该类化合物多存在于茜草科，豆科，鼠李科，百合科等天然植物。是多种中药包括(大黄，何首乌，决明子，芦荟，紫草，丹参)的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化，抗肿瘤，保护肝肾等多种作用。尽管蒽醌类化合物对人类的健康十分有益,但其在人体内较低的生物利用度(基本上小于5％)却制约了蒽醌类化合物的充分利用。

大黄素，茜素，吡啉都是中药来源蒽醌类化合物的典型代表，具有抑菌，抗氧化，抗肿瘤等活性。然而这些化合物的水溶性都比较低，这在一定程度上限制了这些化合物进一步开发和使用。如果对这些蒽醌类化合物进行葡萄糖醛酸化修饰，则可以极大提高这些化合物的水溶性以及生物利用度。据报道，吗啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)为吗啡的代谢产物，M6G为阿片受体激动剂，其麻醉作用是吗啡的100倍，具有很好的应用前景。药物的葡萄糖醛酸化产物往往比其相应的苷元具有更好的水溶性以及极性，在发挥药理学活性中起关键作用。例如药物灯盏花素-7-O-葡萄糖醛酸苷直接作为药物用于临床心脑血管疾病的治疗。

葡萄糖醛酸化对蒽醌的生理特性也有显著影响，如可以提高溶解度、增加生物利用度、提高细胞间转运等作用。目前，制备蒽醌类化合物葡萄糖醛酸产物主要采用的是化学法合成，成本高，步骤繁琐。因此，如何高效生物转化制备获得蒽醌葡萄糖醛酸化产物是本发明的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效制备中药来源蒽醌葡萄糖醛酸化产物的生物转化方法。应用天蓝淡红链霉菌DM，进行全细胞生物转化获得相应的蒽醌葡萄糖醛酸化产物的方法。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种利用天蓝淡红链霉菌 DM对中药来源蒽醌类产物的高效生物转化的方法，所述天蓝淡红链霉菌DM在 F培养基中对中药来源蒽醌类产物的高效生物转化制备蒽醌葡萄糖醛酸化产物的方法；所述的F培养基其蔗糖，葡萄糖，酪蛋白水解物，酵母提取物，K

优选的，该方法分别以大黄素、茜草素、吡啉为原料，在F培养基条件下，天蓝淡红链霉菌DM通过全细胞催化，分别在大黄素、茜草素、吡啉的酚羟基上直接转化获得葡萄糖醛酸化产物。

优选的，所述的F培养基F成分如下：蔗糖20g/L；葡萄糖10g/L；酪蛋白水解物0.1g/L；酵母提取物5g/L；Mops 5g/L；微量元素1mL；K

优选的，所述生物转化的路线如下：通过DM在F培养基中培养2天后，直接投入三种不同的蒽醌底物，包括大黄素，茜素，吡啉，可以高效获得三种蒽醌葡萄糖醛酸化产物；

优选的，包括以下三个步骤：

步骤(1)：将所述的天蓝淡红链霉菌DM，进行常规培养，包括在MS固体培养基活化5d，将新鲜孢子用无菌水洗至TSB培养基，通过TSB液体培养基培养2d后，以10％的接种量转接至F培养基，30℃震荡培养2d。F培养基成分如下g/L(蔗糖20g；葡萄糖10g；酪蛋白水解物0.1g；酵母提取物5g；Mops 5g；微量元素1mL；K2SO4 1g；MgCl2 1g)

步骤(2)：以大黄素、茜素、吡啉底物原料，通过DM菌体直接进行生物转化；

步骤(3)：将加入底物的DM菌液在30℃，160rpm震荡培养两天；离心后获得发酵上清液，通过有机溶剂萃取制备液相从而分离获得化合物。

优选的，DM对于大黄素、茜草素、吡啉的生物转化，三种底物的投料浓度为150mg/L，转化条件为30℃，ph＝6。

优选的，所述的萃取溶剂为己酸乙酯。

优选的，DM对于大黄素、茜草素、吡啉的葡萄糖醛酸化产物的生物转化率分别92％，87％，92％。

优选的，大黄素-3-O-葡萄糖醛酸苷，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷的水溶相比较于底物大黄素，茜素，吡啉分别提高了7.7倍，3.7倍， 5.8倍。

优选的，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2-O-葡萄糖醛酸苷清除羟基自由的能力比茜草素和吡啉分别提高了6.2和17.1倍。

优选的，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2-O-葡萄糖醛酸苷的总抗氧化能力比茜草素和吡啉分别提高了2.4和1.6倍。

使用天蓝淡红链霉菌DM菌在F培养基中进行蒽醌葡萄糖醛酸苷生物转化制备的方法。该方法以中药来源蒽醌类化合物大黄素，茜素，吡啉为原来，在天蓝淡红链霉菌DM的生物转化作用下，在蒽醌的2位酚羟基发生糖基化反应，分别形成大黄素-3-O-葡糖醛酸苷；茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷。

有益效果：

1.本发明提供了一种利用天蓝淡红链霉菌DM全细胞催化，制备获得蒽醌葡萄糖醛酸化产物的方法。本方法通过高效生物转化解决蒽醌葡萄糖醛酸化类化合物稀缺的问题，与化学法合成相比，具有极高的催化位置与立体选择性，成本较低，糖基化产物单一，分离简单，具备一定的工业化前景；

2.本发明不仅解决了中药蒽醌类天然产物水溶性低、使用受限的问题，其中大黄素-3-O-葡萄糖醛酸苷，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷的水溶性分别提高了7.7倍，3.7倍，5.8倍。同时，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷清除羟基自由基的能力分别提高了分别提高了6.2和17.1倍，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷的总抗氧化能力分别提高了2.4 和1.6倍，这些制备获得的蒽醌葡萄糖醛酸化产物在抗炎，抗氧化方面等领域具有潜在的研究价值。

3、本发明通过培养基筛选，转化条件摸索，高效制备蒽醌的葡萄糖醛酸化产物，解决了蒽醌类葡萄醛酸化产物的稀缺性，并且提高了蒽醌产物的水溶性以及抗氧化活性。

4、通过DM在F培养基中培养发酵，DM本身不会产生任何柔红霉素相关产物。同时在该转化过程中，几乎不产生任何副产物，只在蒽醌的间位(大黄素) 和邻位(茜素，吡啉)的酚羟基上进行特异性转化，形成相应的葡萄糖醛酸化产物。

附图说明

图1.蒽醌化合物的葡萄糖醛酸化的生物转化过程

图2.葡萄糖醛酸化产物的液质联用分析

图3.蒽醌葡萄糖醛酸化产物的相对水溶性测定

图4.蒽醌葡萄糖醛酸化产物的羟基自由基清除能力的测定

图5.蒽醌葡萄糖醛酸化产物的总抗氧化能力的测定

图6.蒽醌葡萄糖醛酸化产物的抑菌活性测定

图7不同培养基的葡萄糖醛酸转化效率

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

天蓝淡红链霉菌DM的培养以及生物转化培养基的筛选。

将所述的天蓝淡红链霉菌DM，天蓝淡红链霉菌DM(Streptomycescoeruleorubidus DM)为实验室保藏，菌种由上海医药工业研究院胡又佳实验室馈赠

在MS固体培养基(黄豆粉20g/L，甘露醇20g/L，琼脂粉20g/L)培养活化5天，将新鲜孢子用无菌水洗至TSB培养基(胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5 g/L,氯化钠5g/L)。通过TSB液体培养基培养2天后，以10％的接种量转接至F 培养基，30℃震荡培养2天。F培养基成分如下(蔗糖20g/L；葡萄糖10g/L；酪蛋白水解物0.1g/L；酵母提取物5g/L；Mops 5g/L；微量元素1mL；K2SO4 1g/L；MgCl2 1g/L)。

实施例2

底物转化率的测定

在实施例1中培养好的DM菌液中分别加入蒽醌类底物，包括大黄素，茜素，吡啉，底物投料比150mg/L,将DM在30℃，160rpm继续震荡培养2天后。以 8000rpm离心10分钟后获得转化上清液。在上清液中加入等体积乙酸乙酯，萃取3次后合并萃取液，通过旋蒸进行样品浓缩，最后甲醇复溶。通过HPLC检测分析测得大黄素、茜素、吡啉的葡萄糖醛酸化产物的生物转化率分别92％，87％， 92％。通过DM在F培养基中培养发酵，DM本身不会产生任何柔红霉素相关产物。同时在该转化过程中，几乎不产生任何副产物，只在蒽醌的间位(大黄素)和邻位(茜素，吡啉)的酚羟基上进行特异性转化，形成相应的葡萄糖醛酸化产物。

天蓝淡红链霉菌DM在F培养基中生物转化蒽醌类化合物的反应式如图1。并且对获得的产物分离纯化后，经液质联用分析，获得的结构与预期产物的结构一致。

实施例3

蒽醌葡萄糖醛酸化产物的相对水溶性测定

分别将大黄素，茜素，吡啉，以及实施例1中制备获得的三个葡萄糖醛酸化产物，包括大黄素-3-O-葡糖醛酸苷；茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷用DMSO溶解，配置成终浓度为4mg/ml的母液。分别取100ul母液与100ul 蒸馏水混合后，静置24h后13000rpm离心10分钟取上清液，通过HPLC分析上清液中溶解化合物的峰面积，进行水溶性测定和比较。大黄素-3-O-葡萄糖醛酸苷，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷的水溶性分别提高了7.7倍， 3.7倍，5.8倍，结果如图3.

实施例4羟基自由基清除能力的测定

该实验利用羟自由基消除能力检测试剂盒完成，分别将大黄素，茜素，吡啉，以及实施例1中制备获得的三个葡萄糖醛酸化产物,包括大黄素-3-O-葡糖醛酸苷，茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷，用DMSO溶解，配置初始样品浓度配置为1mg/mL。活性计算：羟自由基清除率D％＝(A测-A对)÷(A空 -A对)×100％。茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2-O-葡萄糖醛酸苷清除羟基自由基的能力分别提高了6.2和17.1倍，结果如图4.

实施例5总抗氧化能力的测定

本实验采用总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS快速法)来测定底物以及转化产物的抗氧化能力的差异，分别将大黄素，茜素，吡啉，以及实施例1中制备获得的三个葡萄糖醛酸化产物，包括大黄素-3-O-葡糖醛酸苷；茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2O-葡萄糖醛酸苷用DMSO溶解，配置初始样品浓度配置为10μM的终浓度体系。通过测定414波长下ABTS吸光度的变化，计算样品的总抗氧化能力。茜素-2-O-葡萄糖醛酸苷，吡啉-2-O-葡萄糖醛酸苷的总抗氧化能力分别提高了 2.4和1.6倍。

实施例6抑菌活性测定

本实验以大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为抑菌对象，首先将过夜培养的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌液的浓度调整至10

对比例1

天蓝淡红链霉菌DM只在F培养基中对蒽醌类化合物进行葡萄糖醛酸化生物转化。而在其他培养基例如A培养基中(淀粉10g/L；酵母提取物4g/L；蛋白胨2g/L；CaCO