用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在免疫疗法中的用途

摘要

本发明提供用于扩增TIL和产生TIL的治疗性群体的改进的和/或缩短的方法，包括在密闭系统中扩增TIL群体的新方法，所述方法在较短时间段内导致TIL的改善的功效、改善的表型和增加的代谢健康，同时允许减少微生物污染以及降低成本。此类TIL可用于治疗性治疗方案。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月5日提交的美国临时专利申请号62/775,954和2019年9月20日提交的美国临时专利申请号62/903,585的优先权，所述临时专利申请均特此以引用的方式整体并入。

背景技术

使用过继性转移肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)治疗大型(bulky)、难治疗性癌症对于预后不良患者代表一种强大的治疗方法。Gattinoni,等人,Nat.Rev.Immunol.2006,6,383-393。成功免疫疗法需要大量的TIL，而商业化需要稳健且可靠的方法。由于细胞扩增的技术、后勤和法规问题，要实现这一点是一项挑战。基于IL-2的TIL扩增和随后的“快速扩增过程(REP)”已因其速度和效率而成为TIL扩增的优选方法。Dudley,等人,Science 2002,298,850-54；Dudley,等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346-57；Dudley,等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-39；Riddell,等人,Science 1992,257,238-41；Dudley,等人,J.Immunother.2003,26,332-42。REP可在14天时间段内产生1,000倍的TIL扩增，尽管其需要大量过量(例如，200倍)的经照射的通常来自多个供体的同种异体外周血单核细胞(PBMC，也称为单核细胞(MNC))作为饲养细胞，还需要抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley,等人,J.Immunother.2003,26,332-42。经历REP程序的TIL已在宿主免疫抑制后的黑色素瘤患者中产生成功的过继性细胞疗法。目前的输注接受性参数依赖TIL的组成的读数(例如，CD28、CD8或CD4阳性率)和REP产物的倍数扩增和活力。

目前的TIL制造方法受限于长度、成本、无菌性考虑和本文所述的其他因素。对提供TIL制造方法和基于此类方法的疗法存在迫切需求，所述疗法的特征在于改善的制造成本有效性和规模可扩充性以及所产生的用于治疗多个临床中心的人患者的TIL制剂的更有效的抗癌表型。本发明通过提供新颖的TIL扩增过程来满足此需求，所述过程从扩增起始即包括抗原呈递饲养细胞以引发用于扩增的TIL，而非使用传统REP前扩增步骤，因此允许大幅减少扩增过程的总体时间。

发明内容

本发明提供用于扩增TIL和产生治疗性TIL群体的改善的和/或缩短的方法。

本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：

(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；

(b)通过在包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的容器中进行，其中所述引发性第一扩增进行约1至7/8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；

(c)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充所述第二TIL群体的所述细胞培养基来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中在所述快速第二扩增中添加的APC数量是步骤(b)中添加的APC数量的至少两倍，其中所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的容器中进行；

(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体；以及

(e)将来自步骤(d)的经收获的TIL群体转移至输注袋。

本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：

(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；

(b)通过在包含IL-2、任选地OKT-3且任选地包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增进行约1至7/8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；

(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及

(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体。

在一些实施方案中，“获得”表示在方法和/或过程中所采用的TIL可直接源自样品(包括来自手术切除、针活检物、核心活检物、小活检物或其他样品)作为方法和/或过程步骤的一部分。在一些实施方案中，“接受”表示在方法和/或过程中所采用的TIL可间接源自样品(包括来自手术切除、针活检物、核心活检物、小活检物或其他样品)且接着在方法和/或过程中采用(例如，当步骤(a)以已经通过不包括在部分(a)的分开过程源自样品的TIL开始时，此类TIL可被称为“接受”)。

在方法的一些实施方案中，在步骤(b)中，所述细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，并且其中步骤(c)的培养基中的APC数量大于步骤(b)的培养基中的APC数量。

本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：

(a)通过在包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，所述第一TIL群体可通过将来自从受试者切除的肿瘤的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得，其中所述引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的容器中进行，其中所述引发性第一扩增进行约1至7/8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；

(b)通过使所述第二TIL群体与含有额外的IL-2、OKT-3和APC的所述第二TIL群体的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中在所述快速第二扩增中的APC数量是步骤(a)中的APC数量的至少两倍，其中所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的容器中进行；以及

(c)收获获自步骤(b)的所述治疗性TIL群体。

本发明还提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：

(a)通过在包含IL-2、任选地OKT-3且任选地包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增进行约1至7/8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；

(b)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及

(c)收获获自步骤(b)的所述治疗性TIL群体。

在方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，并且其中步骤(c)的培养基中的APC数量大于步骤(b)的培养基中的APC数量。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增中的APC数量与所述引发性第一扩增中的APC数量的比例选自约1.5:1至约20:1的范围。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增中的APC数量与所述引发性第一扩增中的APC数量的比例在约1.5:1至约10:1的范围内。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增中的APC数量与所述引发性第一扩增中的APC数量的比例在约2:1至约5:1的范围内。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增中的APC数量与所述引发性第一扩增中的APC数量的比例在约2:1至约3:1的范围内。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增中的APC数量与所述引发性第一扩增中的APC数量的比例是约2:1。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约1.0×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约1.5×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约2.0×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约1×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约1.5×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量选自约2×10

在一些实施方案中，将约2.5×10

在一些实施方案中，所述第二TIL群体中的TIL数量与所述第一TIL群体中的TIL数量的比例是约1.5:1至约100:1。

在一些实施方案中，所述第二TIL群体中的TIL数量与所述第一TIL群体中的TIL数量的比例是约50:1。

在一些实施方案中，所述第二TIL群体中的TIL数量与所述第一TIL群体中的TIL数量的比例是约25:1。

在一些实施方案中，所述第二TIL群体中的TIL数量与所述第一TIL群体中的TIL数量的比例是约20:1。

在一些实施方案中，所述第二TIL群体中的TIL数量与所述第一TIL群体中的TIL数量的比例是约10:1。

在一些实施方案中，所述第二TIL群体在数量上是所述第一TIL群体的至少50倍。

在一些实施方案中，所述方法包括在收获所述治疗性TIL群体的步骤之后，进行以下额外步骤：

将经收获的治疗性TIL群体转移至输注袋。

在一些实施方案中，所述多个肿瘤片段分布于多个分开的容器中，在所述分开的容器中的每一个中，所述第二TIL群体获自所述引发性第一扩增步骤中的所述第一TIL群体，并且所述第三TIL群体获自所述快速第二扩增步骤中的所述第二TIL群体，并且其中获自所述第三TIL群体的所述治疗性TIL群体从所述多个容器中的每一个收集且合并以产生经收获的TIL群体。

在一些实施方案中，所述多个分开的容器包括至少两个分开的容器。

在一些实施方案中，所述多个分开的容器包括二至二十个分开的容器。

在一些实施方案中，所述多个分开的容器包括二至十个分开的容器。

在一些实施方案中，所述多个分开的容器包括二至五个分开的容器。

在一些实施方案中，所述分开的容器中的每一个包括第一气体可渗透表面区域。

在一些实施方案中，所述多个肿瘤片段分布于单一容器中。

在一些实施方案中，所述单一容器包括第一气体可渗透表面区域。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述细胞培养基包含抗原呈递细胞(APC)，并且所述APC以约一个细胞层至约三个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约1.5个细胞层至约2.5个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约2个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述APC以约3个细胞层至约5个细胞层的厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增的所述APC以约3.5个细胞层至约4.5个细胞层的厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增的所述APC以约4个细胞层的厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的第一容器中进行，并且在所述快速第二扩增步骤中，所述快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的第二容器中进行。

在一些实施方案中，所述第二容器大于所述第一容器。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述细胞培养基包含抗原呈递细胞(APC)，并且所述APC以约一个细胞层至约三个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约1.5个细胞层至约2.5个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约2个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增的所述APC以约3个细胞层至约5个细胞层的平均厚度层叠在所述第二气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增的所述APC以约3.5个细胞层至约4.5个细胞层的平均厚度层叠在所述第二气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述APC以约4个细胞层的平均厚度层叠在所述第二气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增在每个容器中的第一TIL群体上进行，所述快速第二扩增在相同容器中在产生自此类第一TIL群体的所述第二TIL群体上进行。

在一些实施方案中，每个容器包括第一气体可渗透表面区域。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述细胞培养基包含抗原呈递细胞(APC)，并且所述APC以约一个细胞层至约三个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约1.5个细胞层至约2.5个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述APC以约2个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述APC以约3个细胞层至约5个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述APC以约3.5个细胞层至约4.5个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述APC以约4个细胞层的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面区域上。

在一些实施方案中，其中对于对第一TIL群体进行所述引发性第一扩增所处的每个容器，在所述引发性第一扩增步骤中，所述第一容器包括第一表面区域，所述细胞培养基包含抗原呈递细胞(APC)，并且所述APC层叠在所述第一气体可渗透表面区域上，并且其中所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.1至约1:10的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.2至约1:8的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.3至约1:7的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.4至约1:6的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.5至约1:5的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.6至约1:4的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.7至约1:3.5的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.8至约1:3的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例选自约1:1.9至约1:2.5的范围。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤中所层叠的APC平均层数与所述快速第二扩增步骤中所层叠的APC平均层数的比例是约1:2。

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中2至3天之后，将所述细胞培养基补充额外的IL-2。

在一些实施方案中，所述方法还包括使用冷冻保存过程冷冻保存在收获所述治疗性TIL群体的步骤中的经收获的TIL群体。

在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存所述输注袋的步骤。

在一些实施方案中，冷冻保存过程使用1:1比例的经收获的TIL群体与冷冻保存培养基进行。

在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。

在一些实施方案中，所述PBMC经照射且为同种异体的。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中，所述细胞培养基包含外周血单核细胞(PBMC)，并且其中在所述引发性第一扩增步骤中添加至所述细胞培养基的PBMC总数是约2.5×10

在一些实施方案中，在所述快速第二扩增步骤中，所述细胞培养基中的所述抗原呈递细胞(APC)是外周血单核细胞(PBMC)，并且其中在所述快速第二扩增步骤中添加至所述细胞培养基的PBMC总数是约5×10

在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。

在一些实施方案中，在收获所述治疗性TIL群体步骤中的所述收获是使用基于膜的细胞加工系统进行的。

在一些实施方案中，在收获所述治疗性TIL群体步骤中的所述收获是使用LOVO细胞加工系统进行的。

在一些实施方案中，在所述引发性第一扩增步骤中所述多个片段包括每容器约60个片段，其中每个片段具有约27mm

在一些实施方案中，所述多个片段包括约30至约60个片段，其总体积为约1300mm

在一些实施方案中，所述多个片段包括约50个片段，其总体积为约1350mm

在一些实施方案中，所述多个片段包括约50个片段，其总质量为约1克至约1.5克。

在一些实施方案中，所述细胞培养基提供于选自由G容器和Xuri细胞袋组成的组的容器中。

在一些实施方案中，所述IL-2浓度是约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。

在一些实施方案中，所述IL-2浓度是约6,000IU/mL。

在一些实施方案中，在将经收获的治疗性TIL群体转移至输注袋的步骤中，所述输注袋是含有HypoThermosol的输注袋。

在一些实施方案中，所述冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。

在一些实施方案中，所述冷冻保存培养基包含7％至10％DMSO。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤的所述第一时间段和所述快速第二扩增步骤的所述第二时间段各自单独地在5天、6天或7天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤的所述第一时间段在5天、6天或7天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增步骤的所述第二时间段在7天、8天或9天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增步骤的所述第一时间段和所述快速第二扩增步骤的所述第二时间段各自单独地在7天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体的步骤在约14天至约16天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体的步骤在约15天至约16天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体的步骤在约14天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体的步骤在约15天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体的步骤在约16天的时间段内进行。

在一些实施方案中，所述方法还包括使用冷冻保存过程冷冻保存经收获的治疗性TIL群体的步骤，其中所述引发性第一扩增至所述收获所述治疗性TIL群体和冷冻保存的步骤在16天或少于16天内进行。

在一些实施方案中，收获所述治疗性TIL群体的步骤中所收获的所述治疗性TIL群体包含对治疗有效剂量的所述TIL而言足够的TIL。

在一些实施方案中，对治疗有效剂量而言足够的TIL数量是约2.3×10

在一些实施方案中，所述快速第二扩增步骤中的所述第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。

在一些实施方案中，所述快速第二扩增步骤中的所述第三TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL提供至少1倍至5倍或更多倍的干扰素-γ产生。

在一些实施方案中，获自所述快速第二扩增步骤中的所述第三TIL群体的所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞相对于获自所述引发性第一扩增步骤中的所述第二TIL群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现增加的CD8和CD28表达。

在一些实施方案中，将来自所述收获所述治疗性TIL群体的步骤的所述治疗性TIL群体输注至患者。

本发明还提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：

(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得和/或接受来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；

(b)通过在包含IL-2、任选地OKT-3和任选地抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的容器中进行，其中所述引发性第一扩增进行约1至7/8天以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上是所述第一TIL群体的至少50倍；

(c)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充所述第二TIL群体的所述细胞培养基来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中向所述快速第二扩增添加的APC数量是步骤(b)中添加的APC数量的至少两倍，其中所述快速第二扩增进行约1至11天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的容器中进行；

(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体；

(e)将来自步骤(d)的经收获的TIL群体转移至输注袋；以及

(f)将治疗有效剂量的来自步骤(e)的所述TIL施用至所述受试者。

在一些实施方案中，对步骤(f)中施用治疗有效剂量而言足够的TIL数量是约2.3×10

在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞(APC)是PBMC。

在一些实施方案中，在步骤(f)中施用治疗有效剂量的TIL细胞之前，已向所述患者施用了清髓性淋巴细胞耗尽方案。

在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包括施用剂量为60mg/m

在一些实施方案中，所述方法还包括始于步骤(f)中施用所述TIL细胞至所述患者之后当天使用高剂量IL-2方案治疗所述患者的步骤。

在一些实施方案中，所述高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟静脉推注(bolusintravenous infusion)施用600,000或720,000IU/kg直到耐受为止。

在一些实施方案中，步骤(b)中的所述第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。

在一些实施方案中，步骤(c)中的所述第三TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL提供至少1倍至5倍或更多倍的干扰素-γ产生。

在一些实施方案中，获自步骤(c)中的所述第三TIL群体的所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞相对于获自步骤(b)中的所述第二细胞群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现增加的CD8和CD28表达。

在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是HNSCC。

在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌。

在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。

在一些实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。

在一些实施方案中，所述癌症是胃肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症是高突变癌症。

在一些实施方案中，所述癌症是小儿高突变癌症。

在一些实施方案中，所述容器是密闭容器。

在一些实施方案中，所述容器是G容器。

在一些实施方案中，所述容器是GREX-10。

在一些实施方案中，所述密闭容器包括GREX-100。

在一些实施方案中，所述密闭容器包括GREX-500。

本发明还提供由如本文中公开的方法所制造的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体。

本发明还提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。

在一些实施方案中，如本文所公开的治疗性TIL群体提供增加的干扰素-γ产生。

在一些实施方案中，如本文所公开的治疗性TIL群体提供增加的多克隆性。

在一些实施方案中，如本文所公开的治疗性TIL群体提供增加的功效。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够产生多至少1倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够产生多至少2倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够产生多至少3倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少1倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的APC下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少2倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的APC下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少3倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少1倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少2倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少3倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无添加的抗原呈递细胞(APC)且无添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少1倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无添加的抗原呈递细胞(APC)且无添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少2倍的干扰素-γ。

在一些实施方案中，如本文所述的治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无添加的抗原呈递细胞(APC)且无添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少3倍的干扰素-γ。

本发明还提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，所述组合物包含如本文所述的治疗性TIL群体和药学上可接受的载剂。

本发明还提供一种无菌输注袋，所述无菌输注袋包含如本文所述的TIL组合物。

本发明还提供一种如本文所述的治疗性TIL群体的经冷冻保存的制剂。

本发明还提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，所述组合物包含如本文所述的治疗性TIL群体和冷冻保存培养基。

在一些实施方案中，所述冷冻保存培养基含有DMSO。

在一些实施方案中，所述冷冻保存培养基含有7％至10％DMSO。

本发明还提供一种如本文所述的TIL组合物的经冷冻保存的制剂。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用作药物。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用于治疗癌症。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用于治疗实体瘤癌症。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用于治疗选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌的癌症。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用于治疗选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中癌症是黑色素瘤。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中癌症是HNSCC。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中癌症是宫颈癌。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中所述癌症是NSCLC。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中所述癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中所述癌症是胃肠癌。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中所述癌症是高突变癌症。

在一些实施方案中，如本文所述的TIL组合物用于治疗癌症，其中所述癌症是小儿高突变癌症。

在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是HNSCC。在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。在一些实施方案中，所述癌症是胃肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是高突变癌症。在一些实施方案中，所述癌症是小儿高突变癌症。

在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物用于治疗受试者的癌症的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效剂量的如本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物。

在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是HNSCC。在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。在一些实施方案中，所述癌症是胃肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是高突变癌症。在一些实施方案中，所述癌症是小儿高突变癌症。

本发明还提供一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：

(a)通过培养获自供体的第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的引发性第一扩增以实现所述第一T细胞群体的生长和引发所述第一T细胞群体的活化；

(b)在步骤(a)中引发的所述第一T细胞群体的活化开始衰退后，通过培养所述第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的快速第二扩增，以实现所述第一T细胞群体的生长和加强所述第一T细胞群体的活化而获得第二T细胞群体；以及

(c)收获所述第二T细胞群体。

在一些实施方案中，步骤(a)的所述引发性第一扩增在至多7天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(b)的所述快速第二扩增在至多11天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(b)的所述快速第二扩增在至多9天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(a)的所述引发性第一扩增在7天的时间段进行且步骤(b)的所述快速第二扩增在9天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(a)的所述引发性第一扩增在至多8天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(b)的所述快速第二扩增在至多8天的时间段进行。

在一些实施方案中，步骤(a)的所述引发性第一扩增在8天的时间段进行且步骤(b)的所述快速第二扩增在8天的时间段进行。

在所述方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述第一T细胞群体在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。

在一些实施方案中，所述第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。

在所述方法的一些实施方案中，在步骤(b)中，所述第一T细胞群体在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。

在所述方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述第一T细胞群体在包括第一气体可渗透表面的容器中的第一培养基中培养，其中所述第一培养基包含任选地OKT-3、IL-2和任选地第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中所述第一APC群体对所述第一T细胞群体的所述供体而言是外源性的且所述第一APC群体层叠在所述第一气体可渗透表面上，其中在步骤(b)中，所述第一T细胞群体在所述容器中的第二培养基中培养，其中所述第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中所述第二APC群体对所述第一T细胞群体的所述供体而言是外源性的且所述第二APC群体层叠在所述第一气体可渗透表面上，并且其中所述第二APC群体大于所述第一APC群体。

在一些实施方案中，所述第二APC群体中的APC数量与所述第一APC群体中的APC数量的比例是约2:1。

在一些实施方案中，所述第一APC群体中的APC数量是约2.5x10

在所述方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，所述第一APC群体以2层APC的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面上。

在所述方法的一些实施方案中，在步骤(b)中，所述第二APC群体以选自4至8层APC范围内的平均厚度层叠在所述第一气体可渗透表面上。

在一些实施方案中，在步骤(b)中层叠在所述第一气体可渗透表面上的APC的平均层数与在步骤(a)中层叠在所述第一气体可渗透表面上的APC的平均层数的比例是2:1。

在一些实施方案中，所述APC是外周血单核细胞(PBMC)。

在一些实施方案中，所述APC包含PBMC，其中所述PBMC经照射且对所述第一T细胞群体的所述供体而言是外源性的。

在一些实施方案中，所述T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。

在一些实施方案中，所述T细胞是骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。

在一些实施方案中，所述T细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。

在一些实施方案中，所述细胞培养基是确定成分培养基(defined medium)和/或无血清培养基。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基包含(任选地重组)转铁蛋白、(任选地重组)胰岛素和(任选地重组)白蛋白。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。

在一些实施方案中，所述基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，所述血清补充剂或血清替代物选自由以下组成的组：CTS

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种白蛋白或白蛋白替代品。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种氨基酸。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种抗生素和一种或多种微量元素。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含白蛋白。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含按所述细胞培养基的体积计约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的总血清替代物浓度(vol％)。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含所述细胞培养基的总体积的约3％、约5％或约10％的总血清替代物浓度。

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含浓度约2mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含国际PCT公布号WO/1998/030679中描述的确定成分培养基。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约5至200mg/L范围内的甘氨酸、约5至250mg/L范围内的L-组氨酸、约5至300mg/L范围内的L-异亮氨酸、约5至200mg/L范围内的L-甲硫氨酸、约5至400mg/L范围内的L-苯丙氨酸、约1至1000mg/L范围内的L-脯氨酸、约1至45mg/L范围内的L-羟基脯氨酸、约1至250mg/L范围内的L-丝氨酸、约10至500mg/L范围内的L-苏氨酸、约2至110mg/L范围内的L-色氨酸、约3至175mg/L范围内的L-酪氨酸、约5至500mg/L范围内的L-缬氨酸、约1至20mg/L范围内的硫胺素、约1至20mg/L范围内的还原谷胱甘肽、约1至200mg/L范围内的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、约1至50mg/L范围内的铁饱和转铁蛋白、约1至100mg/L范围内的胰岛素、约0.000001至0.0001mg/L范围内的亚硒酸钠和/或约5000至50,000mg/L范围内的白蛋白(例如

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含一种或多种确定成分培养基中的非微量元素部分成分，所述成分以本文提供的表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。

在一些实施方案中，所述细胞培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。

在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)和/或2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，在所述第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的所述细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM、3％CTS免疫细胞血清替代物、55mM BME和任选地谷氨酰胺。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含补充有CTS

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含补充有CTS

本发明还提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，所述组合物包含：

i)治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，和

ii)任选地包含(任选地重组)转铁蛋白、(任选地重组)胰岛素和(任选地重组)白蛋白的确定成分培养基或无血清培养基。

本发明还提供一种经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，所述组合物包含：

i)治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，和

ii)任选地包含(任选地重组)转铁蛋白、(任选地重组)胰岛素和(任选地重组)白蛋白的确定成分培养基或无血清培养基。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含(任选地重组)转铁蛋白、(任选地重组)胰岛素和(任选地重组)白蛋白。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。

在一些实施方案中，所述基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，所述血清补充剂或血清替代物选自由以下组成的组：CTS

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种白蛋白或白蛋白替代品。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种氨基酸。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种抗生素和一种或多种微量元素。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含白蛋白。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含按所述细胞培养基的体积计约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的总血清替代物浓度(vol％)。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含所述细胞培养基的总体积的约3％、约5％或约10％的总血清替代物浓度。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含浓度约2mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含国际PCT公布号WO/1998/030679中描述的确定成分培养基。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含约5至200mg/L范围内的甘氨酸、约5至250mg/L范围内的L-组氨酸、约5至300mg/L范围内的L-异亮氨酸、约5至200mg/L范围内的L-甲硫氨酸、约5至400mg/L范围内的L-苯丙氨酸、约1至1000mg/L范围内的L-脯氨酸、约1至45mg/L范围内的L-羟基脯氨酸、约1至250mg/L范围内的L-丝氨酸、约10至500mg/L范围内的L-苏氨酸、约2至110mg/L范围内的L-色氨酸、约3至175mg/L范围内的L-酪氨酸、约5至500mg/L范围内的L-缬氨酸、约1至20mg/L范围内的硫胺素、约1至20mg/L范围内的还原谷胱甘肽、约1至200mg/L范围内的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、约1至50mg/L范围内的铁饱和转铁蛋白、约1至100mg/L范围内的胰岛素、约0.000001至0.0001mg/L范围内的亚硒酸钠和/或约5000至50,000mg/L范围内的白蛋白(例如

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基包含一种或多种确定成分培养基中的非微量元素部分成分，所述成分以本文提供的表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。

在一些实施方案中，所述确定成分培养基或无血清培养基还包含L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)和/或2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，在所述第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的所述确定成分培养基或无血清培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS60-24-2)。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM、3％CTS免疫细胞血清替代物、55mM BME和任选地谷氨酰胺。

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含补充有CTS

在一些实施方案中，所述细胞培养基包含补充有CTS

在一些实施方案中，所述TIL群体是治疗性TIL群体。

在一些实施方案中，所述治疗性TIL群体展现血清IFN-γ上升，其中所述IFN-γ上升大于200pg/ml、大于250pg/ml、大于300pg/ml、大于350pg/ml、大于400pg/ml、大于450pg/ml、大于500pg/ml、大于550pg/ml、大于600pg/ml、大于650pg/ml、大于700pg/ml、大于750pg/ml、大于800pg/ml、大于850pg/ml、大于900pg/ml、大于950pg/ml或大于1000pg/ml。

附图说明

图1A-1C：A)示出用于TIL制造的2A过程(大约22天过程)和第3代过程实施方案(大约14天至16天过程)的比较。B)示例性第3代过程的图提供步骤A至F的概览(大约14天至16天过程)。C)图提供三种示例性第3代过程和步骤A至F(大约14天至16天过程)三种过程变化各者的概览。

图2：提供第2代(2A过程)与第3代之间可比较性的实验流程图。

图3A-3C：A)L4054：第2代和第3代过程的TIL产物的表型鉴定。B)L4055：第2代和第3代过程的TIL产物的表型鉴定。C)M1085T：第2代和第3代过程的TIL产物的表型鉴定。

图4A-4C：A)L4054：第2代和第3代过程的TIL产物的记忆标志物分析。B)L4055：第2代和第3代过程的TIL产物的记忆标志物分析。C)M1085T：第2代和第3代过程的TIL产物的记忆标志物分析。

图5：L4054活化和耗竭标志物(A)在CD4+上门控，(B)在CD8+上门控。

图6：L4055活化和耗竭标志物(A)在CD4+上门控，(B)在CD8+上门控。

图7：IFNγ产生(pg/mL)：(A)L4054、(B)L4055和(C)M1085T的第2代和第3代过程：此处表示的各条形是指经刺激、未经刺激和培养基对照的IFNγ水平的平均值+SEM。光学密度在450nm下测量。

图8：细胞培养上清液中IL-2浓度的ELISA分析：(A)L4054和(B)L4055。此处表示的各条形是指用过的培养基的IL-2水平的平均值+SEM。光学密度在450nm下测量。

图9：定量用过的培养基中的葡萄糖和乳酸酯(g/L)：(A)葡萄糖和(B)乳酸酯：在两个肿瘤细胞系和两个过程中，观察到整个REP扩增中的葡萄糖降低。相反地，观察到乳酸酯如预期般增加。第2代与第3代过程之间的葡萄糖降低和乳酸酯增加是可比较的。

图10：A)定量L4054和L4055的用过的培养基中的L-谷氨酰胺。B)定量L4054和L4055的用过的培养基中的Glutamax。C)定量L4054和L4055的用过的培养基中的氨。

图11：端粒长度分析。相对端粒长度(RTL)值指示使用DAKO试剂盒在第2代和第3代过程中每染色体/基因组平均端粒荧光相对于对照细胞系(1301白血病细胞系)中每染色体/基因组端粒荧光。

图12：L4054和L4055的第2代和第3代过程TIL最终产物的独特CDR3序列分析。柱示出从第2代(例如，第22天)和第3代过程(例如，第14至16天)收获日收集的1×10

图13：L4054 IL收获最终细胞产物(第2代(例如，第22天)和第3代过程(例如，第14至16天))的独特CDR3序列频率。

图14：L4055 TIL收获最终细胞产物(第2代(例如，第22天)和第3代过程(例如，第14至16天))的独特CDR3序列频率。

图15：L4054和L4055的第2代和第3代过程TIL最终产物的多样性指数。Shanon熵多样性指数是较为可靠且常见的比较衡量法。第3代L4054和L4055相较于第2代显示稍微较高多样性。

图16：第7天-第3代REP起始的细胞计数原始数据呈现于表22(参见以下实施例5)。

图17：第11天-第2代REP起始和第3代规模扩大(Scale Up)的细胞计数原始数据呈现于表22(参见以下实施例5)。

图18：第16天-第2代规模扩大和第3收获(例如，第16天)的细胞计数原始数据呈现于表23(参见以下实施例5)。

图19：第22天-第2代收获(例如，第22天)的细胞计数原始数据呈现于表23(参见以下实施例5)。以L4054第2代而言，LOVO后计数外推至4个培养瓶，因为是研究总数。1个培养瓶受到污染，并且进行外推总计＝6.67E+10。

图20：描绘于图3A、4A和4B的流式细胞术结果的原始数据。

图21：描绘于图3C和4C的流式细胞术结果的原始数据。

图22：描绘于图5和6的流式细胞术结果的原始数据。

图23：描绘于图7的L4054样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。

图24：描绘于图7的L4055样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。

图25：描绘于图7的M1085T样品的IFNγ产生测定结果的原始数据。

图26：描绘于图8的IL-2ELISA测定结果的原始数据。

图27：呈现于图9和10的代谢基质和代谢物分析结果的原始数据。

图28：呈现于图11的相对端粒长度分析结果的原始数据。

图29：呈现于图12和15的独特CD3序列和克隆多样性分析结果的原始数据。

图30：示出各种第2代(2A过程)与第3.1代过程实施方案之间的比较。

图31：表格描述第2代、第2.1代和第3.0代过程的实施方案的各种特征。

图32：第3代过程的实施方案(称为第3.1代)的培养基条件概览。

图33：表格描述第2代、第2.1代和第3.0代过程的实施方案的各种特征。

图34：表格比较第2代和第3.0代过程的实施方案的各种特征。

图35：表格提供所述扩增过程的各种实施方案的培养基使用。

图36：表型比较：第3.0代和第3.1代过程实施方案显示可比较的CD28、CD27和CD57表达。第3.1代测试(其包括在第0天添加OKT-3和饲养细胞)在收获时达到培养瓶的最大容量。

图37：第3代最终产物有较高的IFNγ产生。在培养冷冻上清液中评估IFNγ分析(通过ELISA)以比较两种过程。使用各第2代(例如，第22天)和第3代过程(例如，第16天)的新鲜TIL产物，对于各肿瘤以包被的抗CD3板过夜刺激。此处表示的各条形是指经刺激、未经刺激和培养基对照的IFNγ水平。

图38：A)TIL最终产物的独特CDR3序列分析：柱示出从第2代(例如，第22天)和第3代过程(例如，第14至16天)收集的1×10

图39：第3代与第2代最终产物之间共享199个序列，对应于97.07％的前80％来自第2代与第3代最终产物所共享的独特CDR3序列。

图40：第3代与第2代最终产物之间共享1833个序列，对应于99.45％的前80％来自第2代与第3代最终产物所共享的独特CDR3序列。

图41：第3代过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图42：使用第3代过程扩增来自造血恶性肿瘤的TIL的示例性实施方案的示意图。在第0天，使用正向或负向选择方法从富含淋巴细胞的单采血液成分术产物、全血或(新鲜或解冻的)肿瘤消化物分离T细胞级分(CD3+,CD45+)，即，使用T细胞标志物(CD2、CD3等或移除其他细胞留下T细胞)或梯度离心移除T细胞。

图43：第3代过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图44：提供第3.1代过程(16天过程)的示例性实施方案(第3.1代测试)的过程概览。

图45：提供第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)示例性实施方案的TIL增生、每肿瘤片段平均总存活细胞计数、收获日活力百分比和收获日总存活细胞计数(TVC)的数据。第3.1代测试(其包括在第0天添加OKT-3和饲养细胞)在收获时达到培养瓶的最大容量。如果在第0天起始最多4个培养瓶，则各TVC收获应乘以4。

图46：条形图描绘第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)16天过程示例性实施方案的总存活细胞计数(TVC)和活力百分比。

图47：提供的数据显示第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)的示例性实施方案产生显示可比较的CD28、CD27和CD57表达的细胞。

图48：提供的数据显示第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的细胞之间的TIL记忆状态是可比较的。REP TIL的记忆状态描绘如下：CD4+或CD8+TIL记忆子集被分成不同的记忆子集。初始(CD45RA+CD62L+)、CM：中央记忆(CD45RA-CD62L+)、EM：效应记忆(CD45RA-CD62L-)、TEMRA/TEFF：RA+效应记忆/效应细胞(CD45RA+CD62L+)。所呈现的条形图是当在CD4+上门控或CD8+时CD45+/-CD62L+/-的阳性百分比。

图49：提供的数据显示，第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的细胞当在CD4+上门控时的TIL活化/耗竭标志物是可比较的。REP TIL的活化和耗竭通过多色流式细胞术确定。经收获的TIL样品使用流式细胞术抗体(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor780)染色。所呈现的条形图是REP TIL的CD4+或CD8+TIL百分比。

图50：提供的数据显示，第3代过程(第3.0代、第3.0代、第3.1代对照和第3.1代)的示例性实施方案所产生的细胞当在CD8+上门控时的TIL活化/耗竭标志物是可比较的。REPTIL的活化和耗竭通过多色流式细胞术确定。经收获的TIL样品使用流式细胞术抗体(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor780)染色。所呈现的条形图是REP TIL的CD4+或CD8+TIL百分比。

图51：提供的数据显示第3.1代最终产物展现较高的IFN-γ产生。在培养冷冻上清液中评估IFNγ分析ELISA以比较两种过程。使用各肿瘤在各收获日的新鲜TIL产物，以包被的抗CD3板进行过夜刺激。此处表示的各条形是指经刺激、未经刺激和培养基对照的IFNγ的水平。

图52：提供的数据显示使用标准培养基的第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)示例性实施方案之间的上清液IL-2浓度是可比较的。左图：L4063-第2代标准培养基。右图：L4064-CTS Optimizer培养基。*ELISA是使用AIM V稀释剂进行

图53：提供的数据显示第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)示例性实施方案之间的上清液代谢物浓度是可比较的。L4063 TIL在标准培养基中扩增。L4064 TIL在CTS Optimizer培养基中扩增。

图54：第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)示例性实施方案的端粒长度分析。肿瘤标识符L4063和L4064所产生的细胞的端粒长度分析：相对端粒长度(RTL)值指示使用DAKO试剂盒由第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试过程产生的细胞中每染色体/基因组平均端粒荧光相对于在对照细胞系(1301白血病细胞系)中每染色体/基因组端粒荧光。

图55：第3.1代测试(第3.1代优化)过程(16至17天过程)的示例性实施方案的示意图。

图56：第3代过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图57A-57B：示例性第2代和示例性第3代过程的比较表，其中示例性差异突出显示。

图58：第3代过程(16/17天过程)制备时间轴的示例性实施方案的示意图。

图59：第3代过程(14至16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图60：示例性第3代过程实施方案的三个工程改造运行在第16/17天的数据摘要。

图61：关于TIL延伸表型的数据：显示的是由示例性第3代过程实施方案的两个工程改造运行所产生的细胞的TIL鉴别(ID)规定的分化特征。

图62：关于从肺肿瘤扩增的TIL延伸表型的数据：显示的是由使用肺肿瘤组织的示例性第3代过程实施方案的两个方法开发(PD)运行所产生的细胞的TIL鉴别(ID)规定的分化特征。

图63：关于从卵巢肿瘤扩增的TIL延伸表型(纯度、鉴别性和记忆)的数据：显示的是使用示例性第2代、第3.1代和FR ER(冷冻肿瘤，早期REP)过程实施方案从卵巢肿瘤扩增的细胞的纯度、鉴别性和记忆表型特征；

图64：显示的是表征TIL的门控策略(显示门控阶层)和关于由示例性第3代过程实施方案的两个工程改造运行所产生的细胞的延伸表型特征的数据。

图65：显示的是鉴别TIL的门控策略(显示门控阶层)和关于由示例性第3代过程实施方案的两个工程改造运行所产生的细胞的CD4+子群体和CD8+子群体的延伸表型特征的数据。

图66：显示的是关于由示例性第3代过程实施方案的两个工程改造运行所产生的细胞的颗粒溶解酶B ELISA分析的数据。

图67A-67B：第3代过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图68：第3代过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。

图69：第2代、第2.1代和第3代过程(16天过程)的实施方案的比较。

图70：第2代、第2.1代和第3代过程(16天过程)的实施方案的比较。

图71：第3代实施方案组分。

图72：第3代实施方案流程图比较(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)。

图73：呈现使用标准细胞培养基和无血清细胞培养基的示例性第3代实施方案(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)的总存活细胞计数和倍数扩增。

图74：呈现使用标准细胞培养基和无血清细胞培养基的示例性第3代实施方案(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)的再活化时活力分数％、培养规模放大和TIL收获。

图75：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品所产生的最终TIL产物的表型鉴定。

图76：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品所产生的TIL产物的记忆标志物分析。

图77：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品产生且随后进行CD4+门控细胞分选的TIL的活化和耗竭标志物。

图78：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品产生且随后进行CD8+门控细胞分选的TIL的活化和耗竭标志物。

图79：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品所产生的最终TIL产物的IFN-γ产生(pg/mL)分数。

图80：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)的IL-2浓度(pg/mL)分析。

图81：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)中的葡萄糖浓度(g/L)。

图82：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)中的乳酸酯浓度(g/L)。

图83：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)中的谷氨酰胺浓度(mmol/L)。

图84：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)中的glutamax浓度(mmol/L)。

图85：呈现的是在使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的示例性第3代过程(第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试)中加工L4063和L4064肿瘤样品用过的培养基(在再活化、培养规模放大和TIL收获时收集)中的氨浓度(mmol/L)。第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)示例性实施方案的端粒长度分析。肿瘤标识符L4063和L4064所产生的细胞的端粒长度分析：相对端粒长度(RTL)值指示使用DAKO试剂盒由第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试过程产生的细胞中每染色体/基因组平均端粒荧光相对于在对照细胞系(1301白血病细胞系)中每染色体/基因组端粒荧光。

图86：使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL的端粒长度分析。肿瘤标识符L4063和L4064所产生的细胞的端粒长度分析：相对端粒长度(RTL)值指示使用DAKO试剂盒由第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试过程产生的细胞中每染色体/基因组平均端粒荧光相对于在对照细胞系(1301白血病细胞系)中每染色体/基因组端粒荧光。

图87：使用标准细胞培养基和CTS无血清细胞培养基的第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL的TCR Vβ谱库总结。所描述的是肿瘤标识符L4063和L4064通过第3.0代、第3.1代对照和第3.1代测试过程所产生的最终TIL产物通过具有独特CDR3序列的TCR Vβ谱库所测量的TIL的克隆性。

图88：第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL就加工L4063肿瘤样品的TIL收获产物中独特CDR3序列频率方面的比较。

图89：第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL就加工L4063肿瘤样品的TIL收获细胞产物中共享的独特CDR3序列的百分比的比较：第3.0代和第3.1代测试最终产物之间共享975个序列，相当于88％的前80％来自第3.0代与第3.1代测试最终产物所共享的独特CDR3序列。

图90：第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL就加工L4064肿瘤样品的TIL收获细胞产物中共享的独特CDR3序列的百分比的比较：第3.0代和第3.1代测试最终产物之间共享2163个序列，相当于87％的前80％来自第3.0代与第3.1代测试最终产物所共享的独特CDR3序列。

图91：第3代过程(第3.0代、第3.1代对照、第3.1代测试)的示例性实施方案所产生的TIL就加工L4064肿瘤样品的TIL收获产物中独特CDR3序列频率方面的比较。

图92：显示的是第3代过程(第3代优化，16至17天过程)的示例性实施方案的组分。

图93：接受标准表。

图94：细胞计数再活化日。

图95：细胞计数规模放大日。

图96：细胞计数收获L4063。

图97：细胞计数收获L4064。

图98：Flow数据。

图99：Flow数据。

图100：Flow数据。

图101：Flow数据。

图102：IFN-γ产生数据图7-L4063。

图103：IFN-γ产生数据图7-L4064。

图104：IL-2浓度数据的ELISA分析。

图105：代谢数据汇总表。

图106：汇总数据。

图107：汇总数据。

图108：Shannon多样性指数。

图109：示例性过程2A的图提供步骤A至F的概览。

图110：提供结构I-A和I-B，圆柱体是指个别多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的源自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合结构域，所述TNFRSF结合结构域折叠以形成三价蛋白质，所述三价蛋白质接着与第二三价蛋白质经由IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)连接，所述IgG1-Fc用于经由二硫键(小长椭圆形)将两个三价蛋白质连接在一起，由此稳定结构且提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域与信号传导蛋白质集合在一起以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可为scFv结构域，其包含例如由接头连接的VH和VL链，所述接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly和Ser序列以及提供溶解性的Glu和Lys。

图111：使用活检物样品的第2代和第3代过程的概览。

图112：第3代过程的示例性实施方案。

序列简要说明

SEQ ID NO:1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是重组人IL-2蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是重组人IL-4蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是重组人IL-7蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是重组人IL-15蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是重组人IL-21蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是人4-1BB的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是鼠4-1BB的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。

SEQ ID NO:12是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链。

SEQ ID NO:13是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。

SEQ ID NO:14是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。

SEQ ID NO:15是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDRl。

SEQ ID NO:16是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR2。

SEQ ID NO:17是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR3。

SEQ ID NO:18是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。

SEQ ID NO:19是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。

SEQ ID NO:20是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。

SEQ ID NO:21是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。

SEQ ID NO:22是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。

SEQ ID NO:23是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(V

SEQ ID NO:24是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(V

SEQ ID NO:25是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。

SEQ ID NO:26是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。

SEQ ID NO:27是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。

SEQ ID NO:28是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。

SEQ ID NO:29是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。

SEQ ID NO:30是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。

SEQ ID NO:31是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。

SEQ ID NO:32是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:33是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:34是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:35是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:36是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:37是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:38是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:39是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:40是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:41是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:42是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。

SEQ ID NO:43是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:44是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:45是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。

SEQ ID NO:46是4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。

SEQ ID NO:47是4-1BBL多肽的可溶部分。

SEQ ID NO:48是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式1的重链可变区(V

SEQ ID NO:49是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式1的轻链可变区(V

SEQ ID NO:50是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式2的重链可变区(V

SEQ ID NO:51是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1型式2的轻链可变区(V

SEQ ID NO:52是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(V

SEQ ID NO:53是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(V

SEQ ID NO:54是人OX40的氨基酸序列。

SEQ ID NO:55是鼠类OX40的氨基酸序列。

SEQ ID NO:56是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。

SEQ ID NO:57是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的轻链。

SEQ ID NO:58是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的重链可变区(V

SEQ ID NO:59是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(V

SEQ ID NO:60是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的重链CDRl。

SEQ ID NO:61是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。

SEQ ID NO:62是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。

SEQ ID NO:63是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。

SEQ ID NO:64是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。

SEQ ID NO:65是OX40激动剂单克隆抗体他伏利昔组单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。

SEQ ID NO:66是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。

SEQ ID NO:67是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。

SEQ ID NO:68是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(V

SEQ ID NO:69是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(V

SEQ ID NO:70是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDRl。

SEQ ID NO:71是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。

SEQ ID NO:72是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。

SEQ ID NO:73是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。

SEQ ID NO:74是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。

SEQ ID NO:75是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。

SEQ ID NO:76是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。

SEQ ID NO:77是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。

SEQ ID NO:78是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(V

SEQ ID NO:79是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(V

SEQ ID NO:80是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDRl。

SEQ ID NO:81是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。

SEQ ID NO:82是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。

SEQ ID NO:83是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。

SEQ ID NO:84是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。

SEQ ID NO:85是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。

SEQ ID NO:86是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(V

SEQ ID NO:87是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(V

SEQ ID NO:88是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDRl。

SEQ ID NO:89是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。

SEQ ID NO:90是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。

SEQ ID NO:91是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。

SEQ ID NO:92是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。

SEQ ID NO:93是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。

SEQ ID NO:94是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(V

SEQ ID NO:95是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(V

SEQ ID NO:96是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDRl。

SEQ ID NO:97是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。

SEQ ID NO:98是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。

SEQ ID NO:99是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。

SEQ ID NO:100是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。

SEQ ID NO:101是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。

SEQ ID NO:102是OX40配体(OX40L)氨基酸序列。

SEQ ID NO:103是OX40L多肽的可溶部分。

SEQ ID NO:104是OX40L多肽的替代性可溶部分。

SEQ ID NO:105是OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(V

SEQ ID NO:106是OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(V

SEQ ID NO:107是OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(V

SEQ ID NO:108是OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(V

SEQ ID NO:109是OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(V

SEQ ID NO:110是OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(V

SEQ ID NO:111是OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(V

SEQ ID NO:112是OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(V

SEQ ID NO:113是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:114是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:115是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:116是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:117是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:118是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:119是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:120是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:121是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:122是人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:123是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:124是人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

SEQ ID NO:125是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(V

SEQ ID NO:126是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(V

具体实施方式

I.定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中的技术人员所通常了解的相同意义。所有在本文提及的专利和公布以引用的方式整体并入本文中。

术语“体内”是指发生在受试者身体以内的事件。

术语“体外”是指发生在受试者身体以外的事件。体外测定涵盖基于细胞的测定，其中采用活细胞或死细胞，并且也可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的测定。

术语“离体”是指涉及在从受试者身体移除的细胞、组织和/或器官上所进行处理或进行程序的事件。适当地，所述细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗的方法回到受试者体内。

术语“快速扩增”是指抗原特异性TIL在数量上在一周时间段内增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，更优选在一周时间段内增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或最优选在一周时间段内增加至少约100倍。一些快速扩增方案概述于下文。

在本文中的“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指原本获得时是白细胞但其离开受试者的血流且迁移至肿瘤中的细胞群体。TIL包括但不限于CD8

在本文中的“细胞群体”(包括TIL)是指一些具有共同特质的细胞。一般来说，群体在数量上通常介于1×10

本文中的“冷冻保存的TIL”是指在约-150℃至-60℃的范围内处理和储存的不论是原代、本体或扩增(REP TIL)的TIL。冷冻保存的常规方法也描述于本文他处，包括实施例中。为了清晰起见，可将“冷冻保存的TIL”与可用来作为原代TIL来源的冷冻组织样品区别。

本文中的“解冻的进行冷冻保存的TIL”是指先前进行冷冻保存且接着经处理以回到室温或更高温度下的TIL群体，包括但不限于细胞培养温度或其中TIL可施用至患者的温度。

TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(通过它们浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达一个或多个以下生物标志物来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外且替代地，TIL可通过它们重新引入患者体内后浸润实体瘤的能力来进行功能性定义。

术语“冷冻保存培养基”(cryopreservation media或cryopreservation medium)是指任何可用于冷冻保存细胞的培养基。此类培养基可包括包含7％至10％DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及它们的组合。术语“CS10”是指获自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以其商品名称“

术语“中央记忆T细胞”是指T细胞子集，其在人中为CD45R0+且组成性地表达CCR7(CCR7

术语“效应记忆T细胞”是指人或哺乳动物T细胞子集，其就像中央记忆T细胞是CD45R0+，但已经失去组成性表达CCR7的能力(CCR7

术语“密闭系统”是指与外界环境隔离的系统。任何适用于细胞培养方法的密闭系统都可用于本发明的方法。密闭系统包括例如但不限于密闭G容器。一旦将肿瘤区段添加至密闭系统后，所述系统即与外界环境隔离，直到准备将TIL施用至患者为止。

本文中所使用的术语“片段化(fragmenting)”、“片段(fragment)”和“片段化的(fragmented)”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械片段化方法诸如破碎、切开、分割和分碎肿瘤组织以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。

术语“细针抽吸物”或FNA是指一种类型的活检程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不移除或切除肿瘤。在细针抽吸中，将中空针头(例如25至18号)插入肿瘤或含有肿瘤的区域，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于进一步分析或如本文所述的扩增。进行FNA时，细胞被移除且不保留组织细胞的组织学结构。FNA可包含TIL。在一些例子中，细针抽吸活检是使用超声引导细针抽吸活检针头进行。FNA针头可购自Becton Dickinson,Covidien等。

术语“核心活检”(core biopsy)或“核心针活检”(core needle biopsy)是指一种活检程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不移除或切除肿瘤。在核心活检中，将中空针头(例如16至11号)插入肿瘤或含有肿瘤的区域，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于进一步分析或如本文所述的扩增。进行核心活检时，细胞可在保留一些组织细胞的组织学结构下移走，因为其相较于FNA有较大的针头大小。核心活检针通常是能够保留至少一些部分的肿瘤组织学结构的规格大小。核心活检物可包含TIL。在一些例子中，核心针活检是使用可购自Bard Medical,Becton Dickinson等的活检仪器、真空辅助核心针活检仪器、立体定位引导核心针活检仪器、超声引导核心针活检仪器、MRI引导核心针活检仪器进行。

术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC是抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞是经照射的异体外周血单核细胞。

术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”是指自外周血扩增的T细胞。在一些实施方案中，PBL是从供体的全血或单采血液成分术产物分离。在一些实施方案中，PBL通过正向或负向选择T细胞表型(诸如CD3+CD45+的T细胞表型)从供体的全血或单采血液成分术产物分离。

术语“抗CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体也包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如，奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。

术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，并且包括市售形式诸如OKT-3(30ng/mL,MACS GMP CD3 pure,Miltenyi Biotech,Inc.,San Diego,CA,USA)和莫罗单抗或其变体、保守性氨基酸取代、糖化形式或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，并且所指定的ATCC登录号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏于欧洲认证细胞培养中心(ECACC)，并且所指定的目录号为86022706。

表1.莫罗单抗的氨基酸序列

术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括其人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和变体。IL-2是描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:3)。例如，术语IL-2涵盖人重组形式的IL-2诸如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供货商，每单次使用小瓶含2200万IU)，以及由CellGenix,Inc.,Portsmouth,NH,USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供货商的其他市售等效物。阿地白介素(去丙氨酰基-1、经丝氨酸-125取代的人IL-2)是非糖基化人重组形式的IL-2，分子量为大约15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:4)。术语IL-2也涵盖如本文中描述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前药NKTR-214(可购自Nektar Therapeutics,South San Francisco,CA,USA)。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公布号US 2014/0328791A1和国际专利申请公布号WO 2012/065086 Al，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4902,502中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容以引用的方式并入本文中。

表2.白细胞介素的氨基酸序列

术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)是指称为白细胞介素4的细胞因子，其通过Th2 T细胞和通过嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调控初始

术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化组织源性细胞因子，其可获自基质细胞和上皮细胞以及树突细胞。Fry和Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7可刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(由IL-7受体α和常见γ链受体组成的异二聚体)结合，其为对于T细胞在胸腺内的发育和在周边内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人IL-7可购自多个供货商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-254)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO:6)。

术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括其人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和变体。IL-15描述于例如，Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚基。重组人IL-15是含有114个氨基酸(和N末端甲硫氨酸)的单一、非糖基化多肽链，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可购自多个供货商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,NJ,USA(目录号CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA(人IL-15重组蛋白质，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQID NO:7)。

术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白细胞介素-21的多效性细胞因子蛋白质，并且包括所有形式的IL-21，包括其人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和变体。IL-21描述于例如，Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95中，它们的公开内容都以引用的方式并入本文中。IL-21主要由自然杀伤T细胞和经活化的人CD4

当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的精确量可由医师考虑受试者的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移范围和患者(受试者)病况差异确定。通常说明本文所述的包含肿瘤浸润性淋巴细胞(例如继代TIL或遗传修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以10

术语“血液恶性肿瘤”(hematological malignancy、hematologic malignancy)或有相关意义的术语是指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”是指影响B细胞的血液恶性肿瘤。

术语“实体瘤”是指组织的异常团块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可为良性或恶性。术语“实体瘤癌症”是指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、癌(carcinoma)和淋巴瘤，诸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。

术语“液体肿瘤”是指具流体性质的细胞的异常团块。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤以及其他血液恶性肿瘤。获自液体肿瘤的TIL在本文中也称为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤的TIL(包括在外周血循环的液体肿瘤)在本文中也称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用且只有细胞所源自的组织类型的差别。

如本文中所使用的术语“微环境”可指整个实质或血液肿瘤微环境或可指在微环境中的个别细胞子集。如本文中所使用的肿瘤微环境是指如Swartz,等人,Cancer Res.,2012,72,2473所描述的“促进肿瘤性转换、支持肿瘤生长和入侵、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移成长空间的细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质和机械刺激”的复杂混合物。虽然肿瘤表达应被T细胞识别的抗原，但免疫系统因为微环境的免疫抑制作用而很少进行肿瘤清除。

在一个实施方案中，本发明包括使用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在根据本发明输注TIL之前先经非清髓性化学疗法治疗。在一些实施方案中，可提供TIL群体，其中患者在根据本发明输注TIL之前先经非清髓性化学疗法治疗。在一个实施方案中，非清髓性化学疗法是环磷酰胺60mg/kg/d共2天(TIL输注之前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d共5天(TIL输注之前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本发明的非清髓性化学疗法和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时接受720,000IU/kg静脉内IL-2的静脉内输注至生理耐受。

实验发现表示在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，通过消除调控性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子槽”(cytokine sinks))进行淋巴细胞耗尽而起着增强治疗功效的关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的rTIL之前，对患者进行淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调理”)。

如本文中所使用的术语“共同施用”、“共同施用”、“与……组合施用”、“同时”和“并行”涵盖施用两种或更多种活性药物成分(在本发明的优选实施方案中，例如至少一种钾通道激动剂与多个TIL的组合)至受试者，以使两种活性药物成分和/或它们的代谢物同时存在于受试者中。共同施用包括同时施用分开组合物、在不同时间施用分开组合物或施用其中有两种或更多种活性药物成分存在的组合物。同时施用分开组合物和施用其中有两种剂存在的组合物是优选的。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现意图应用包括但不限于疾病治疗的如本文中描述的化合物或化合物组合的量。治疗有效量可依意图应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病病况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病病况的严重性或施用方式而异。所述术语也适用于将诱导目标细胞中的特定反应(例如减少血小板粘附和/或细胞迁移)的剂量。明确剂量将取决于所选的特定化合物、所遵循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间点、其待施用的组织和携带化合物的物理递送系统而异。

术语“治疗(treatment/treating/treat)”和类似术语是指获得所需药理学和/或生理学效应。所述效应可为预防性，也就是完全或部分预防疾病或其症状，和/或所述效应可为治疗性，也就是部分或完全治愈疾病和/或疾病带来的不良影响。本文所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在受试者发生，所述受试者可为易发生所述疾病但尚未被诊断为已患所述疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的发展或进展；和(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”也涵盖递送剂以提供药理学效应，甚至在疾病或病况不存在下。例如，“治疗”涵盖递送可在疾病病况不存在下诱发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。

当术语“异源性”用于指称核酸或蛋白质的部分时，表示所述核酸或蛋白质包含两个或更多个在天然中不具有相同相互关系的子序列。举例而言，所述核酸一般为重组产生且具有两个或更多个来自不相关基因且经排列以制造新的功能性核酸的序列，例如启动子来自一个来源且编码区域来自另一来源，或编码区域来自不同的来源。类似地，异源性蛋白质表示所述蛋白质包含两个或更多个在天然中不具有相同相互关系的子序列(例如融合蛋白)。

在提及两种或更多种核酸或多肽时，术语“序列同一性”、“同一性百分比”和“序列同一性百分比”(或其有义术语，例如“99％同一”)是指当两个或更多个序列或子序列经比较和比对(需要时引入空位)以达最高对应性且不把任何保守性氨基酸取代当作序列同一性的部分时，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可利用序列比较软件或算法测量，或通过目视检查测量。各种算法和软件是本领域中已知的，可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。可确测序列同一性百分比的合适程序包括例如可得自美国政府的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)BLAST网站的BLAST程序包。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN是用来比较核酸序列，而BLASTP是用来比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大众使用的比对序列软件程序。本领域中的技术人员可确定用于特定比对软件以求最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。

如本文中所使用，术语“变体”涵盖但不限于包含与参考蛋白质、抗体或融合蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质、抗体或融合蛋白，不同之处在于在所述参考抗体、蛋白质或融合蛋白的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个或多个取代、缺失和/或添加。相较于参考抗体的氨基酸序列，变体的氨基酸序列中可包含一个或多个保守性取代。保守性取代可涉及例如类似地带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体、蛋白质或融合蛋白的抗原特异性结合的能力。术语变体也包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。

在本文中的“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指原本获得时是白细胞但其离开受试者的血流且迁移至肿瘤中的细胞群体。TIL包括但不限于CD8

TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(通过它们浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达一个或多个以下生物标志物来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。此外且替代地，TIL可通过它们重新引入患者体内后浸润实体瘤的能力来进行功能性定义。TIL的特征可进一步为效力-例如，如果例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可被认为有效。例如，如果干扰素(IFNγ)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，则TIL可被认为有效。

术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”意图包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及惰性成分。活性药物成分的此类药学上可接受的载剂或药学上可接受的赋形剂的使用是本领域中熟知的。除非任何常规药学上可接受的载剂或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其于本发明的治疗性组合物中的用途。额外活性药物成分(诸如其他药物)也可并入所描述的组合物和方法中。

术语“约”或“大约”是指在数值的具统计意义的范围内。这种范围可在给定数值或范围的数量级内，优选在50％以内，更优选在20％以内，更优选在10％以内，并且甚至更优选在5％以内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于特定研究系统而定，并且可被本领域的技术人员容易地了解。此外，如本文中所使用的术语“约”和“大约”意指尺寸、大小、制剂、参数、形状及其他数量和特征并不确切而且不需要确切，但可根据需要为近似值和/或较大或较小值，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差和类似值和本领域中的技术人员已知的其他因素。一般来说，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征都为“约”或“大约”，无论是否如此明白说明。已注意到非常不同大小、形状和尺寸的实施方案可采用所述的安排。

当过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”以原始和修改形式用于随附权利要求书中时，其就权利要求范围定义有关于哪些未引述的额外权利要求要素或步骤(如果有的话)被排除于权利要求的范围的外。术语“包含”意图为包括性或开放式且不排除任何额外、未引述要素、方法、步骤或材料。术语“由……组成”排除任何不在权利要求中指明的要素、步骤或材料，并且在后者情况中排除与所指明的材料寻常相关的杂质。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制在所指明的要素、步骤或材料和那些实质上不影响所要求发明的基本和新颖特征者。本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可在替代性实施方案中通过任何过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”更具体地定义。

II.TIL制造方法(第3代过程的实施方案，任选地包括确定成分培养基)

在不受任何特定理论限制下，据信如本发明的方法所述的引发T细胞的活化的引发性第一扩增，随后加强T细胞的活化的快速第二扩增，允许制备保留“较年轻”表型的经扩增的T细胞，并且因此预期本发明的经扩增的T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞展现较高细胞毒性。特别是，据信如本发明的方法所教示的通过暴露至抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和任选地抗原呈递细胞(APC)来引发T细胞的活化且接着通过后续暴露至额外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC来加强，限制或避免培养中T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群体，所述T细胞较不因培养扩增而耗竭且对癌细胞展现较高细胞毒性。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大(scaling up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大(scaling out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小规模培养中培养T细胞约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自第一小规模培养中的T细胞转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在第二小规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的T细胞转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养T细胞约4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的T细胞转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约5天。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化已降低了为或为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之后进行。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化已降低了为或为约1％至100％范围内的百分比之后进行。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化已降低了为或为约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％范围内的百分比之后进行。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化已降低了至少为或为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％之后进行。

在一些实施方案中，快速第二扩增在通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化已降低了至多约或为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之后进行。

在一些实施方案中，通过引发性第一扩增所实现的T细胞活化的降低通过T细胞因应抗原刺激所释放的干扰素γ的量的减少来确定。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在至多为或为约7天或约8天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在至多为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增在至多为或为约11天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增在至多为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的快速第二扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在从为或为约1天至为或为约7天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在从为或为约1天至为或为约11天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在至多为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在至多为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或约11天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在从为或为约1天至为或为约8天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在从为或为约1天至为或为约9天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在8天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在9天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在从为或为约1天至为或为约7天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在从为或为约1天至为或为约9天的时间段进行。

在一些实施方案中，T细胞的引发性第一扩增在7天的时间段进行且T细胞的快速第二扩增在9天的时间段进行。

在一些实施方案中，所述T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。

在一些实施方案中，所述T细胞是骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。

在一些实施方案中，所述T细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。

在一些实施方案中，T细胞获自患有癌症的供体。

在一些实施方案中，T细胞获自从患有癌症的患者切除的肿瘤的TIL。

在一些实施方案中，T细胞获自患有血液恶性肿瘤的患者骨髓的MIL。

在一些实施方案中，T细胞获自来从供体的外周血单核细胞(PBMC)的PBL。在一些实施方案中，供体患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患有肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是液体肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，供体患有血液恶性肿瘤。

在本发明的某些方面中，免疫效应细胞(例如T细胞)可从一单位收集自受试者的血液，使用熟练的技术人员所知的任何数量的技术(诸如FICOLL分离)获得。在一个优选的方面中，来自受试者的循环血液中的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面中，通过单采血液成分术所收集的细胞可经洗涤以去除血浆部分且任选地将细胞放置于适当缓冲液或培养基以供进行后续加工步骤。在一个实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个替代性实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子。在一个方面中，T细胞从外周血淋巴细胞分离，其可通过例如离心通过PERCOLL梯度或通过逆流离心淘析以裂解红细胞并耗竭单核细胞。

在一些实施方案中，T细胞是从供体的全血或富含淋巴细胞的单采血液成分术产物分离的PBL。在一些实施方案中，供体患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患有肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是液体肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，供体患有血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，PBL分离自全血或通过使用正向或负向选择方法而富含淋巴细胞的单采血液成分术产物，即，使用T细胞表型的标志物例如CD3+CD45+移除PBL，或移除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施方案中，PBL通过梯度离心分离。在分离来从供体组织的PBL后，PBL的引发性第一扩增可根据本文所述的任何方法中的引发性第一扩增步骤，通过将合适数量的经分离的PBL(在一些实施方案中，大约1×10

含有一些这些特征的称为过程3(在本文中也称为第3代)的示例性TIL过程描绘于图1(特别是例如图1B和/或图1C)，并且本发明的此实施方案的一些优于过程2A的优点描述于图1、2、30和31(特别是例如图1B和/或图1C)。过程3的两个实施方案显示于图1和30(特别是例如图1B和/或图1C)。过程2A或第2代也描述于美国专利公布号2018/.0280436中，其以引用的方式整体并入本文中。

如本文中所讨论和总体概述的，TIL取自患者样品且使用本文所述且称为第3代的TIL扩增过程操作以在移植至患者中之前扩增它们的数量。在一些实施方案中，TIL任选地可进行如下讨论的遗传操作。在一些实施方案中，TIL可在扩增之前或之后进行冷冻保存。一旦解冻后，它们也可进行再刺激以在输注至患者中之前增加它们的代谢。

在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，引发性第一扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所示的过程)缩短为1至8天且快速第二扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)缩短为1至9天。在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，引发性第一扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所示的过程)缩短为1至8天且快速第二扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)缩短为1至8天。在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，引发性第一扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所示的过程)缩短为1至7天且快速第二扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)缩短为1至9天。在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，引发性第一扩增(包括本文中称为快速扩增前(REP前)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所示的过程)是1至7天且快速第二扩增(包括本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)是1至10天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)缩短为8天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是7至9天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是8天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是8至9天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)缩短为7天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是7至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)缩短为8天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是8天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是9天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是8天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是10天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是7天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是7至10天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是7天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是8至10天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)是7天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是9至10天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增)缩短为7天且快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所述的扩增)是7至9天。在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，引发性第一扩增与快速第二扩增(例如，图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B和步骤D所述的扩增)的组合是14至16天。特别是，所考虑的是本发明的某些实施方案包含引发性第一扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露至抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露至抗原来活化。在某些实施方案中，如上述在引发性第一扩增步骤中被活化的TIL是第一TIL群体，即原代细胞群体。

以下的“步骤”代号A、B、C等参照图1(特别是例如图1B和/或图1C)的非限制性实例且参照本文所述的某些非限制性实施方案。以下和图1(特别是例如图1B和/或图1C)中的步骤顺序为示例性且步骤的任何组合或顺序以及额外步骤、重复步骤和/或步骤省略都在本申请和在本文中公开的方法考虑。

A.步骤A：获得患者肿瘤样品

一般来说，TIL最初获自患者肿瘤样品(“原代TIL”)或循环淋巴细胞(诸如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞)，并且接着扩增成较大群体以进行如本文中描述的进一步操作，任选地进行冷冻保存和任选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指标。

患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由手术切除、针吸活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段。一般来说，肿瘤样品可来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵入性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，诸如获自血液恶性肿瘤的肿瘤。实体瘤可为任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。在一些实施方案中，有用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高水平的TIL。

一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器分割片段化成介于1至约8mm

如上所指示，在一些实施方案中，TIL源自实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤未经片段化。在一些实施方案中，实体瘤未经片段化且以全肿瘤进行酶催化性消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中在37℃、5％CO

在一些实施方案中，肿瘤用冷冻干燥的酶于无菌缓冲剂中重构。在一些实施方案中，缓冲剂是无菌HBSS。

在一些实施方案中，酶混合物包含胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是胶原酶IV。在一些实施方案中，胶原酶的工作储备溶液是100mg/ml 10X工作储备溶液。

在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作储备溶液是10,000IU/ml 10X工作储备溶液。

在一些实施方案中，酶混合物包含透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶的工作储备溶液是10-mg/ml 10X工作储备溶液。

在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/ml胶原酶、1000IU/ml DNA酶和1mg/ml透明质酸酶。

在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/ml胶原酶、500IU/ml DNA酶和1mg/ml透明质酸酶。

一般来说，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施方案中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。

在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，片段化是物理片段化。在一些实施方案中，片段化是分割。在一些实施方案中，片段化通过消化。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶催化性肿瘤消化物和肿瘤片段培养。在一个实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶催化性肿瘤消化物和肿瘤片段培养。

在一些实施方案中，当肿瘤是实体瘤时，在例如(如图1(特别是例如图1B和/或图1C)中提供的)步骤A中获得肿瘤样品后，肿瘤进行物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化发生在获得肿瘤之后且不进行任何冷冻保存。在一些实施方案中，片段化步骤是体外或离体过程。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将10、20、30、40个或超过40个片段或片放入每个容器进行引发性第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将30或40个片段或片放入每个容器进行引发性第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将40个片段或片放入每个容器进行引发性第一扩增。在一些实施方案中，多个片段包括约4至约50个片段，其中每个片段具有约27mm

在一些实施方案中，TIL获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤片段介于约1mm

在一些实施方案中，肿瘤经片段化以最小化各片上出血性、坏死和/或脂肪组织的量。在一些实施方案中，肿瘤经片段化以最小化各片上出血性组织的量。在一些实施方案中，肿瘤经片段化以最小化各片上坏死性组织的量。在一些实施方案中，肿瘤经片段化以最小化各片上脂肪性组织的量。在某些实施方案中，片段化肿瘤步骤是体外或离体方法。

在一些实施方案中，进行肿瘤片段化以维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，进行肿瘤片段化，不包括使用解剖刀进行锯切动作。在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶的酶培养基中孵育，随后机械解离(GentleMACS,MiltenyiBiotec,Auburn,CA)而产生肿瘤消化物。在将肿瘤放入酶培养基后，可将肿瘤机械解离大约1分钟。接着可将溶液在37℃下在5％CO

在一些实施方案中，将引发性第一扩增步骤之前的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。

在一些实施方案中，细胞可在样品分离后(例如，在获得肿瘤样品后和/或从肿瘤样品获得细胞悬浮液后)任选地冷冻且在进入步骤B描述的扩增之前冷冻储存，所述步骤B在以下进一步详细描述且在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中例示。

1.核心/小活检物来源的TIL

在一些实施方案中，TIL最初通过核心活检物或类似程序获自患者肿瘤样品(“原代TIL”)且接着扩增成较大群体以进行如本文中描述的进一步操作，任选地冷冻保存且任选地评估表型和代谢参数。

在一些实施方案中，患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由小活检物、核心活检物、针吸活检物或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段。一般来说，肿瘤样品可来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵入性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，诸如获自血液恶性肿瘤的肿瘤。在一些实施方案中，样品可来自多个小肿瘤样品或活检物。在一些实施方案中，样品可包含来自相同患者的单一肿瘤的多个肿瘤样品。在一些实施方案中，样品可包含来自相同患者的一、二、三或四个肿瘤的多个肿瘤样品。在一些实施方案中，样品可包含来自相同患者的多个肿瘤的多个肿瘤样品。实体瘤可为任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，有用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高水平的TIL。

一般来说，获自肿瘤核心或片段的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“鲜获得的”新或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施方案中，使新鲜获得TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。

在一些实施方案中，如果肿瘤是转移性且原发病灶已在过去有效地治疗/移除，则可能需要移除一个转移性病灶。在一些实施方案中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮肤病灶或颈部或腋域淋巴结。在一些实施方案中，移除皮肤病灶或移除其小活检物。在一些实施方案中，移除淋巴结或其小活检物。在一些实施方案中，可采用肺或肝脏转移性病灶或腹部内或胸部淋巴结或它们的小活检物。

在一些实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤的小活检物包含黑痣或其一部分。

在一些实施方案中，小活检物是穿孔活检物。在一些实施方案中，穿孔活检物以圆形刀片压入皮肤获得。在一些实施方案中，穿孔活检物以圆形刀片压入可疑黑痣周围的皮肤获得。在一些实施方案中，穿孔活检物以圆形刀片压入皮肤获得且移除一片圆形皮肤。在一些实施方案中，小活检物是穿孔活检物且移除圆形部分的肿瘤。

在一些实施方案中，小活检物是切除式活检物。在一些实施方案中，小活检物是切除式活检物且移除整个黑痣或生长。在一些实施方案中，小活检物是切除式活检物且连同小边缘的正常外观皮肤移除整个黑痣或生长。

在一些实施方案中，小活检物是切开式活检物。在一些实施方案中，小活检物是切开式活检物且仅采集最不规则部分的黑痣或生长。在一些实施方案中，小活检物是切开式活检物且切开式活检物在其他技术无法完成时使用，诸如当可疑黑痣非常大时。

在一些实施方案中，小活检物是肺活检物。在一些实施方案中，小活检物通过支气管镜检获得。通常，支气管镜检是在患者麻醉下，使小工具通过鼻或口、下至咽喉且进入支气管通道，其中小工具用于移除一些组织。在一些实施方案中，其中肿瘤或生长无法经由支气管镜检达到，可以采用经胸针吸活检。通常，经胸针吸活检也是在患者麻醉下，将针穿过皮肤直接插入可疑位点以移除小样品的组织。在一些实施方案中，经胸针吸活检可能需要介入性放射线学(例如，使用x射线或CT扫描来引导针头)。在一些实施方案中，小活检物通过针吸活检获得。在一些实施方案中，小活检物经内视镜超声(例如，带有灯的内视镜经口放入食道)获得。在一些实施方案中，小活检物经手术获得。

在一些实施方案中，小活检物是头颈活检物。在一些实施方案中，小活检物是切开式活检物。在一些实施方案中，小活检物是切开式活检物，其中从外观异常区域切除一小片组织。在一些实施方案中，如果异常区域容易接近，样品采集可不需要住院。在一些实施方案中，如果肿瘤在口或咽喉内较深的处，活检可能需要在手术室全身麻醉进行。在一些实施方案中，小活检物是切除式活检物。在一些实施方案中，小活检物是切除式活检物，其中移除整个区域。在一些实施方案中，小活检物是细针抽吸(FNA)。在一些实施方案中，小活检物是细针抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器的非常细的针头从肿瘤或肿块抽取(抽吸)细胞。在一些实施方案中，小活检物是穿孔活检物。在一些实施方案中，小活检物是穿孔活检物，其中使用穿孔镊移除一片可疑部位。

在一些实施方案中，小活检物是子宫颈活检物。在一些实施方案中，小活检物经由阴道镜获得。通常，阴道镜方法采用附接至双目放大镜的带有灯的放大仪器(阴道镜)，接着用于活检一小部分的子宫颈表面。在一些实施方案中，小活检物是子宫颈锥状切除/锥状活检物。在一些实施方案中，小活检物是子宫颈锥状切除/锥状活检物，其中可能需要门诊手术移除较大片的子宫颈组织。在一些实施方案中，锥状活检物除了帮助确诊之外，锥状活检物可作为初始治疗。

术语“实体瘤”是指组织的异常团块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可为良性或恶性。术语“实体瘤癌症”是指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、癌(carcinoma)和淋巴瘤，诸如肺癌、乳腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。

在一些实施方案中，来自肿瘤的样品以细针抽吸物(FNA)、核心活检物、小活检物(包括例如，穿孔活检物)获得。在一些实施方案中，首先将样品放入G-Rex 10。在一些实施方案中，当有1或2个核心活检物和/或小活检物样品时，首先将样品放入G-Rex 10。在一些实施方案中，当有3、4、5、6、8、9或10或超过10个核心活检物和/或小活检物样品时，首先将样品放入G-Rex 100。在一些实施方案中，当有3、4、5、6、8、9或10或超过10个核心活检物和/或小活检物样品时，首先将样品放入G-Rex 500。

FNA可获自选自由以下组成的组的肿瘤：肺肿瘤、黑色素瘤、头颈肿瘤、子宫颈肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、成胶质细胞瘤、结肠直肠肿瘤和肉瘤。在一些实施方案中，FNA获自肺肿瘤，诸如来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺肿瘤。在一些情况下，NSCLC患者先前已经历外科治疗。

本文所述的TIL可获自FNA样品。在一些情况下，FNA样品是使用从18号针头到25号针头范围的细规格针头从患者获得或分离。细规格针头可为18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施方案中，来自患者的FNA样品可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。

在一些情况下，本文所述的TIL获自核心活检物样品。在一些情况下，核心活检物样品是使用从11号针头到16号针头范围的外科或医用针头从患者获得或分离。针头可为11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施方案中，来自患者的核心活检物样品可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。

一般来说，将收获的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。

在一些实施方案中，TIL不是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，实体瘤核心未经片段化。

在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在例如但不限于RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶的酶培养基中孵育，随后机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)而产生肿瘤消化物。在将肿瘤放入酶培养基后，可将肿瘤机械解离大约1分钟。接着可将溶液在37℃下在5％CO

2.

在本发明的一个实施方案中，PBL方法1是进行如下：在第0天，将冷冻保存的PBMC样品解冻且计数PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱(Miltenyi Biotec)分离T细胞。

在本发明的一个实施方案中，PBL方法2是进行如下：在第0天，将冷冻保存的PMBC样品解冻且将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于6孔板于CM-2培养基中且在摄氏37℃下孵育3小时。在3小时后，移除非粘附细胞(其是PBL)且计数。

在本发明的一个实施方案中，PBL方法3是进行如下：在第0天，将源自外周血的冷冻保存的PBMC解冻和计数。使用CD19 Multisort人试剂盒(Miltenyi Biotec)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱(Miltenyi Biotec)纯化T细胞。

在一个实施方案中，PBMC分离自全血样品。在一个实施方案中，使用PBMC样品作为扩增PBL的起始材料。在一个实施方案中，样品在扩增过程之前进行冷冻保存。在另一个实施方案中，使用新鲜样品作为扩增PBL的起始材料。在本发明的一个实施方案中，使用本领域中已知的方法从PBMC分离T细胞。在一个实施方案中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一个实施方案中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)从PBMC分离T细胞。

在本发明的一个实施方案中，PBMC样品在有效鉴定非粘附细胞的所需温度下孵育一段时间。在本发明的一个实施方案中，孵育时间是约3小时。在本发明的一个实施方案中，温度是约37℃。非粘附细胞接着使用上述过程扩增。

在一些实施方案中，PBMC样品是来自已任选地用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，肿瘤样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长时间的受试者或患者。在另一个实施方案中，PBMC源自目前正在接受ITK抑制剂方案诸如依鲁替尼(ibrutinib)治疗的患者。

在一些实施方案中，PBMC样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗且对激酶抑制剂或ITK抑制剂诸如依鲁替尼治疗呈现难治性的受试者或患者。

在一些实施方案中，PBMC样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗但不再接受激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样品是来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案预治疗但不再接受激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗且未接受治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长时间的受试者或患者。在另一个实施方案中，PBMC源自先前暴露至ITK抑制剂但已未治疗至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年的患者。

在本发明的一个实施方案中，在第0天，细胞经CD19+选择且因此分选。在本发明的一个实施方案中，选择是使用抗体结合珠进行。在本发明的一个实施方案中，纯的T细胞在第0天从PBMC分离。

在本发明的一个实施方案中，以未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者而言，10至15ml的血沉棕黄层将产生约5×10

在本发明的一个实施方案中，对于用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者而言，扩增过程将产生约20×10

在任何前述实施方案中，PBMC可源自全血样品、通过单采血液成分术、来自血沉棕黄层或来自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法。

3.

在本发明的一个实施方案中，MIL方法3是进行如下：在第0天，将PBMC的进行冷冻保存的样品解冻且计数PBMC。将细胞使用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色且使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。细胞被分选成两个级分：免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。

在本发明的一个实施方案中，PBMC获自骨髓。在一个实施方案中，PBMC经由单采血液成分术、抽吸、细针活检或本领域中已知的其他类似手段获自骨髓。在一个实施方案中，PBMC是新鲜的。在另一个实施方案中，PBMC是进行冷冻保存的。

在本发明的一个实施方案中，MIL是从10至50ml的骨髓抽吸物扩增。在本发明的一个实施方案中，从患者获得10ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，从患者获得20ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，从患者获得30ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，从患者获得40ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，从患者获得50ml的骨髓抽吸物。

在本发明的一个实施方案中，从约10至50ml的骨髓抽吸物产生的PBMC数量是约5×10

在本发明的一个实施方案中，约5×10

在本发明的一个实施方案中，源自骨髓抽吸物的12×10

在任何前述实施方案中，PBMC可源自全血样品、骨髓、通过单采血液成分术、来自血沉棕黄层或来自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法。

B.步骤B：引发性第一扩增

在一些实施方案中，本方法提供较年轻TIL，所述较年轻TIL相较于较老TIL(即在施用至受试者/患者之前已进一步进行更多次复制的TIL)可能提供额外治疗好处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia,等人,Scandinavian Journal of Immunology,75:157–167(2012)；Dudley等人,Clin Cancer Res,16:6122-6131(2010)；Huang等人,JImmunother,28(3):258–267(2005)；Besser等人,Clin Cancer Res,19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人,J Immunother 32:415–423(2009)；Robbins,等人,J Immunol 2004；173:7125-7130；Shen等人,J Immunother,30:123–129(2007)；Zhou,等人,J Immunother,28:53–62(2005)；以及Tran,等人,J Immunother,31:742–751(2008)，所述文献都以引用的方式并入本文中。

在例如诸如图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤A所述的分割或消化肿瘤片段和/或肿瘤片段之后，将所得细胞在有利TIL但不利肿瘤及其他细胞生长的条件下培养于含有IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中。在一些实施方案中，IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养起始时连同肿瘤消化物和/或肿瘤片段添加(例如在第0天)。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤片段以每容器至多60个片段和6000IU/mL的IL-2孵育于容器中。在一些实施方案中，将此原代细胞群体培养一段数天的时间段(通常1至8天)，产生通常约1×10

在一个优选的实施方案中，TIL的扩增可使用如以下和本文所述的引发性第一扩增步骤(例如诸如那些图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B中所述者，其可包括称为REP前或引发性REP的过程且其从第0天和/或从培养起始含有饲养细胞)进行，随后进行如以下步骤D和本文所述的快速第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行任选的冷冻保存，和随后进行如以下和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可如本文所述的任选地以表型特征和代谢参数鉴定。在一些实施方案中，肿瘤片段介于约1mm

在一些实施方案中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。

在一些实施方案中，存在少于或等于240个肿瘤片段。在一些实施方案中，有少于或等于240个肿瘤片段被放入少于或等于4个容器中。在一些实施方案中，容器是GREX100MCS培养瓶。在一些实施方案中，少于或等于60个肿瘤片段被放入1个容器中。在一些实施方案中，每个容器包括少于或等于每容器500mL的培养基。在一些实施方案中，培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施方案中，培养基包含每容器2.5×10

在制备肿瘤片段后，将所得细胞(即，片段且是原代细胞群体)在有利TIL但不利肿瘤及其他细胞生长的条件下培养于含有IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中且其允许从第0天培养起始开始TIL引发和加速生长。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤片段与6000IU/mL的IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起孵育。将此原代细胞群体培养数天时间段(通常1至8天)，产生通常约1×10

在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。

在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。

在一个实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL之间和介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于15ng/ml与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含30ng/mL的OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体是莫罗单抗。

表3：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列

在一些实施方案中，引发性第一扩增细胞培养基在细胞培养基中包含一种或多种TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂是4-1BB激动剂，并且4-1BB激动剂选自由乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白和它们的片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中实现介于0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中实现介于20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。

在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，引发性第一扩增细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，引发性第一扩增细胞培养基还包含初始浓度约6000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。

在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人AB血清、25mMHepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在一些实施方案中，CM是实施例(参见实施例A)中所述的CM1。在一些实施方案中，引发性第一扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中发生。在一些实施方案中，引发性第一扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为饲养细胞)。

在一些实施方案中，在本文中公开的扩增过程中使用的培养基是无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是用于预防和/或降低部分因为含有血清培养基的批次变异所致的实验变异。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于一种或多种CTS

在一些实施方案中，CTS

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)是总无血清或确定成分培养基体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，2-巯基乙醇于培养基中的最终浓度是55μM。

在一些实施方案中，国际PCT专利公布号WO/1998/030679(其以引用的方式并入本文中)描述的确定成分培养基可用于本发明。在所述公布，描述无血清真核细胞培养基。无血清、真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含以下或通过组合一种或多种选自以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定成分培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白替代品和一种或多种选自以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，确定成分培养基中的甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度是约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度是约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度是约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度是约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度是约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度是约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度是约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度是约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度是约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度是约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度是约5至500mg/L，硫胺素的浓度是约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度是约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度是约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度是约1至50mg/L，胰岛素的浓度是约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度是约0.000001至0.0001mg/L且白蛋白(例如

在一些实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基的优选实施方案”的栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定成分培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂的优选实施方案”的栏中列出的种类和浓度的非微量部分成分。

表A：非微量元素部分成分的浓度

在一些实施方案中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，Smith,等人,“Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement,”Clin Transl Immunology,4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定成分培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTS

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是1至8天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是2至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是3至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图4C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是4至8天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是1至7天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是2至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是2至7天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是3至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是3至7天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是4至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是4至7天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是5至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是5至7天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是6至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是6至7天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所提供的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是7至8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所提供的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是8天。在一些实施方案中，引发性第一扩增(包括诸如例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所提供的过程，其可包括有时称为REP前或引发性REP的那些)过程是7天。

在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行1天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行1天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行2天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行2天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行3天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行3天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行4天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行4天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行5天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行5天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行6天至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行6天至7天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行7至8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行8天。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后可进行7天。

在一些实施方案中，TIL的引发性第一扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天。

在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在引发性第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可被包括在引发性第一扩增期间，包括例如在根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B过程期间以及如本文所述者。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在引发性第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可被包括在根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B过程期间以及如本文所述者。

在一些实施方案中，引发性第一扩增(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-10。

1.饲养细胞和抗原呈递细胞

在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第4至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第4至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第5至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第5至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第6至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第6至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第7或8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在引发性第一扩增期间第8天期间的任何时间添加。

在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序(例如包括诸如那些于图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤B所述的扩增以及称为REP前或引发性REP的那些)在TIL扩增起始时和引发性第一扩增期间需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施方案中，饲养细胞获自异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，引发性第一扩增期间使用2.5×10

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且如实施例所述用于REP程序，其提供用于评估照射同种异体PBMC的复制不能的示例性方案。

在一些实施方案中，如果第14天存活细胞总数小于在引发性第一扩增第0天放入培养中的初始存活细胞数量，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天存活细胞总数并未从在引发性第一扩增第0天放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和6000IU/mlIL-2存在下培养。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天存活细胞总数并未从在引发性第一扩增第0天放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和3000IU/mlIL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例是约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至50和1至300之间。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至100和1至200之间。

在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序需要约2.5×10

在一些实施方案中，引发性第一扩增的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，引发性第一扩增的培养基包含6000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，引发性第一扩增的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，引发性第一扩增的培养基包含每容器2.5×10

在一个实施方案中，本文所述的引发性第一扩增程序在第二扩增期间需要多于TIL的过量饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞获自异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且用于本文所述的TIL扩增程序，包括在图和实施例中所述的示例性程序。

在一个实施方案中，在引发性第一扩增中使用人工抗原呈递细胞来置换PBMC或与PBMC组合使用。

2.细胞因子

本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所知。

替代地，使用细胞因子的组合以进行TIL的引发性第一扩增是另外可能的，如同总体上在国际专利公布号WO 2015/189356和WO 2015/189357中概述的两种或更多种IL-2、IL-15和IL-21的组合，特此明确地以引用的方式整体并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞的产生，并且特别是如其中所述的T细胞。

表4：白细胞介素的氨基酸序列

C.步骤C：引发性第一扩增至快速第二扩增的转变

在一些情况下，获自引发性第一扩增(其可包括有时称为REP前的扩增)的本体TIL群体包括例如获自例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示的步骤B的TIL群体可经受快速第二扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)且接着如以下讨论冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰的TIL将用于疗法中的情况中，来自引发性第一扩增的经扩增的TIL群体或来自快速第二扩增的经扩增的TIL群体可在扩增步骤之前或在引发性第一扩增之后且在快速第二扩增之前进行遗传修饰以用于合适治疗。

在一些实施方案中，获自引发性第一扩增(例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示的步骤B)的TIL进行储存直到为了选择而测定表型。在一些实施方案中，获自引发性第一扩增(例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示的步骤B)的TIL不进行储存且直接进行快速第二扩增。在一些实施方案中，获自引发性第一扩增的TIL在引发性第一扩增之后且在快速第二扩增之前不进行冷冻保存。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在肿瘤片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约3天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约3天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约4天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约4天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约5天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约5天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约6天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约6天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约7天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后约8天发生。

在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后1天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后1天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后2天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后2天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后3天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后3天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后4天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后4天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后5天至7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后5天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后6天至7天发生。。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后6天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后7天至8天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后7天发生。在一些实施方案中，引发性第一TIL扩增至快速第二扩增的转变在片段化发生后和/或第一引发性扩增步骤起始后8天发生。

在一些实施方案中，TIL在初级(primary)第一扩增之后且在快速第二扩增之前不进行储存，并且TIL直接进行快速第二扩增(例如在一些实施方案中，在如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示的从步骤B至步骤D的转变期间并不进行储存)。在一些实施方案中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自引发性第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行快速第二扩增而无转变期。

在一些实施方案中，引发性第一扩增至快速第二扩增的转变(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如GREX-10或GREX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。在一些实施方案中，引发性第一扩增至快速第二扩增的转变涉及容器大小的规模放大。在一些实施方案中，引发性第一扩增在比起快速第二扩增较小的容器中进行。在一些实施方案中，引发性第一扩增在GREX-100中进行且快速第二扩增在GREX-500中进行。

D.步骤D：快速第二扩增

在一些实施方案中，TIL细胞群体在如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示的收获和引发性第一扩增(步骤A和步骤B)和称为步骤C的转变之后在数量上进一步扩增。此进一步扩增在本文中称为快速第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP；以及如图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)的扩增过程。快速第二扩增通常使用包含一些组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在气体可渗透容器中完成。在一些实施方案中，在快速第二扩增起始后1天、2天、3天或4天(即总体第3代过程的第8、9、10或11天)，将TIL转移至较大体积容器。

在一些实施方案中，TIL的快速第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)可使用任何本领域中的技术人员所知的TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二TIL扩增可在快速第二扩增起始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约1天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约1天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约2天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约2天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约3天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约3天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约4天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约4天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约5天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约5天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约6天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约6天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约7天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约7天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约8天至约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约8天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约9天至约10天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约1天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约2天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约3天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约4天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约5天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约6天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约7天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约8天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约9天。在一些实施方案中，第二TIL扩增在快速第二扩增起始后可进行约10天。

在一个实施方案中，快速第二扩增可在气体可渗透容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所示的过程)进行。在一些实施方案中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施方案中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中将饲养细胞添加至最终浓度，所述最终浓度是存在于引发性第一扩增中的饲养细胞浓度的两倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增。非特异性T细胞受体刺激可包括例如抗CD3抗体诸如约30ng/ml的OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)或UHCT-1(可购自BioLegend,San Diego,CA,USA)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括它们的抗原性部分诸如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原任选地在T细胞生长因子诸如300IU/mL IL-2或IL-15存在下任选地从载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合适抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或它们的抗原性部分。TIL也可通过用脉冲至HLA-A2表达性抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激来快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激发生为第二扩增的一部分。在一些实施方案中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下发生。

在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于1000与2000IU/mL之间、介于2000与3000IU/mL之间、介于3000与4000IU/mL之间、介于4000与5000IU/mL之间、介于5000与6000IU/mL之间、介于6000与7000IU/mL之间、介于7000与8000IU/mL之间或介于8000IU/mL的IL-2。

在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL之间和介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于30ng/ml与60ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约60ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，OKT-3抗体是莫罗单抗。

在一些实施方案中，快速第二扩增的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，快速第二扩增的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二扩增的培养基包含每容器7.5×10

在一些实施方案中，快速第二扩增的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL的IL-2。在一些实施方案中，快速第二扩增的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器介于5×10

在一些实施方案中，细胞培养基在细胞培养基中包含一种或多种TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂是4-1BB激动剂，并且4-1BB激动剂选自由乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白和它们的片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中实现介于0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中实现介于20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。

在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。

在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可被包括在第二扩增期间，包括例如在根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D过程期间以及如本文所述者。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可被包括在根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D过程期间以及如本文所述者。

在一些实施方案中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞和任选地TNFRSF激动剂的经补充的细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二扩增在经补充的细胞培养基中发生。在一些实施方案中，经补充的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。

在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。

在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC和/或抗原呈递细胞的比例是约1比10、约1比15、约1比20、约1比25、约1比30、约1比35、约1比40、约1比45、约1比50、约1比75、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC的比例介于1至50和1至300之间。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC的比例介于1至100和1至200之间。

在一个实施方案中，REP和/或快速第二扩增在培养瓶中进行，其中本体TIL与100或200倍过量的去活化饲养细胞、30ng/mL OKT3抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合，其中饲养细胞细胞浓度是引发性第一扩增中的饲养细胞细胞浓度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。置换培养基(通常经由抽吸2/3用过的培养基且用相等体积的新鲜培养基置换来置换2/3培养基)直到细胞转移至替代性生长室。替代性生长室包括G-REX培养瓶和如以下更完整讨论的气体可渗透容器。

在一些实施方案中，快速第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)是7至9天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，第二扩增是7天。在一些实施方案中，第二扩增是8天。在一些实施方案中，第二扩增是9天。

在一个实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及于图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D中提及的那些)可在500mL容量的具有100cm气体可渗透硅底的气体可渗透培养瓶(G-Rex 100，可购自Wilson Wolf Manufacturing Corporation,NewBrighton,MN,USA)中进行，5×10

在一些实施方案中，在本文中公开的扩增过程中使用的培养基是无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是用于预防和/或降低部分因为含有血清培养基的批次变异所致的实验变异。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于一种或多种CTS

在一些实施方案中，CTS

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)是总无血清或确定成分培养基体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，国际PCT专利公布号WO/1998/030679(其以引用的方式并入本文中)描述的确定成分培养基可用于本发明。在所述公布，描述无血清真核细胞培养基。无血清、真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含以下或通过组合一种或多种选自以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定成分培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白替代品和一种或多种选自以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，确定成分培养基中的甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度是约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度是约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度是约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度是约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度是约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度是约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度是约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度是约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度是约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度是约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度是约5至500mg/L，硫胺素的浓度是约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度是约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度是约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度是约1至50mg/L，胰岛素的浓度是约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度是约0.000001至0.0001mg/L且白蛋白(例如

在一些实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基的优选实施方案”的栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定成分培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂的优选实施方案”的栏中列出的种类和浓度的非微量部分成分。

表A：非微量元素部分成分的浓度

在一些实施方案中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，Smith,等人,“Ex vivo expansion ofhuman T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement,”Clin Transl Immunology,4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定成分培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTS

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

在一个实施方案中，快速第二扩增(包括称为REP的扩增)经进行且还包含其中选择优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用任何本领域中已知的选择方法。例如，美国专利申请公布号2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)所述的方法可用于选择优异肿瘤反应性的TIL。

任选地，在快速第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后可使用本领域中已知的标准测定进行细胞活力测定。例如，可在本体TIL的样品上进行台盼蓝排除测定，其选择性地标记死亡细胞且允许活力评估。在一些实施方案中，TIL样品可使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)计算和确定活力。在一些实施方案中，活力是根据标准细胞计数器K2 Image Cytometer自动细胞计数器方案确定。

T和B淋巴细胞的多样抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供用于产生展现和增加T细胞谱库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，在第二扩增获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。

在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更详细讨论的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施方案中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30ug/培养瓶OKT-3以及如以下更详细讨论的7.5×10

在一些实施方案中，快速第二扩增(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-500。

1.饲养细胞和抗原呈递细胞

在一个实施方案中，本文所述的快速第二扩增程序(例如包括诸如图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D中所述的那些以及称为REP的那些)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且如实施例所述用于REP程序，其提供用于评估照射同种异体PBMC的复制不能的示例性方案。

在一些实施方案中，如果第7或14天存活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的存活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/ml OKT3抗体和6000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和6000IU/ml IL-2存在下培养。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的存活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/ml OKT3抗体和1000至6000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/ml OKT3抗体和2000至5000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/ml OKT3抗体和2000至4000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/ml OKT3抗体和2500至3500IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/ml OKT3抗体和6000IU/ml IL-2存在下培养。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例是约1比10、约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至50和1至300之间。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至100和1至200之间。

在一个实施方案中，本文所述的第二扩增程序需要约5×10

在一个实施方案中，本文所述的快速第二扩增程序在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞获自异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。在一些实施方案中，PBMC以添加至引发性第一扩增的PBMC浓度的两倍添加至快速第二扩增。

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且用于本文所述的TIL扩增程序，包括在图和实施例中所述的示例性程序。

在一个实施方案中，在快速第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来置换PBMC或与PBMC组合使用。

2.细胞因子

本文所述的快速第二扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所知。

替代地，使用细胞因子的组合以进行TIL的快速第二扩增是额外可能的，如同总体上在WO 2015/189356和WO 2015/189357中概述的两种或更多种IL-2、IL-15和IL-21的组合，特此明确地以引用的方式整体并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞的产生，并且特别是如其中所述的T细胞。

E.步骤E：收获TILS

在快速第二扩增步骤之后，可收获细胞。在一些实施方案中，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方案中，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所提供的两个扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方案中，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所提供的两个扩增步骤(一个引发性第一扩增和一个快速第二扩增)之后收获TIL。

TIL可以任何适当且无菌的方式收获，包括例如离心。用于收获TIL的方法是本领域中熟知的且本过程可采用任何此类已知的方法。在一些实施方案中，使用自动化系统收获TIL。

细胞收获器和/或细胞加工系统可购自多个来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。本方法可采用任何基于细胞的收获器。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞加工系统是基于膜的细胞收获器。在一些实施方案中，细胞收获是经由细胞加工系统诸如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞加工系统”也指由任何供货商制造的任何可将包含细胞的溶液泵送通过无菌和/或密闭系统环境中的膜或过滤器诸如旋转膜或旋转过滤器的仪器或装置，允许连续流动和细胞加工以在无需团块化下移除上清液或细胞培养基。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞加工系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞加工步骤。

在一些实施方案中，快速第二扩增(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器是G-REX-500。

在一些实施方案中，根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤E是根据本文所述的过程进行。在一些实施方案中，密闭系统在无菌条件下经由针筒进入以维持系统的无菌性和密闭特性。在一些实施方案中，采用本文所述的密闭系统。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法收获TIL。在一些实施方案中，使用本文所述的方法收获介于第14与16天之间的TIL。在一些实施方案中，使用本文所述的方法在14天收获TIL。在一些实施方案中，使用本文所述的方法在15天收获TIL。在一些实施方案中，使用本文所述的方法在16天收获TIL。

F.步骤F：最终制剂/转移至输注袋

在如图1(特别是例如图1B和/或图1C)以示例性顺序提供且如以上和本文详细概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器以用于施用至患者。在一些实施方案中，一旦使用上述的扩增方法获得治疗足够数量的TIL后，将它们转移至容器以用于施用至患者。

在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL作为药物组合物施用至患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲剂中的悬浮液。如本文公开扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，TIL作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内。

G.PBMC饲养细胞比

在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图1(特别是例如图1B和/或图1C))的培养基包括抗CD3抗体例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合诱导TIL群体中的T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab’)2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，特此以引用的方式整体并入本文中。

在一个实施方案中，PBMC饲养细胞层的数量如下计算：

A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr

B.具有40μm(4个细胞)高度的G-Rex 100(M)体积：V＝(4/3)πr

C.需要填充柱B的细胞数量：4×10

D.可在4D空间中被最优选活化的细胞数量：4.86×10

E.外推至G-Rex 500的饲养细胞和TIL数量：TIL：100×10

在此计算中，使用在具有100cm

在一个实施方案中，在引发性第一扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数量大约是在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数量的一半。在某些实施方案中，方法包括在相较于快速第二扩增的细胞培养基包含大约50％较少抗原呈递细胞的细胞培养基中进行引发性第一扩增。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)数量大于引发性第一扩增期间外源供应的APC数量。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约20:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例为或为约2:1。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数量与在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量的比例为或为约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量是为或为约1×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量处于为或为约2×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增期间外源供应的APC数量是为或为约2.5×10

在一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)数量是在引发性第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC数量的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在引发性第一扩增第0天添加抗原呈递细胞至第一TIL群体且在第7天添加抗原呈递细胞至第二TIL群体，其中在第0天添加的抗原呈递细胞的数量是在引发性第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数量的大约50％。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量大于引发性第一扩增第0天外源供应的PBMC数量。

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以处于为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以处于为或为约2×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以为或为约2×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC以处于为或为约2.5×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC以处于为或为约3.5×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC以处于为或为约4.0×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC以处于为或为约4.0×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增外源供应的APC以为或为约2.5×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增外源供应的APC以为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增中外源供应的APC以处于为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增中外源供应的APC以处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增中外源供应的APC以处于为或为约2×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增中外源供应的APC以为或为约2×10

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的PBMC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约20:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的PBMC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的PBMC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例为或为约2:1。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量与在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量的比例为或为约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量是为或为约1×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量处于为或为约1×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量处于为或为约2×10

在另一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数量是为或为约2.5×10

在一个实施方案中，在引发性第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数在快速第二扩增第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在引发性第一扩增第0天添加抗原呈递细胞层至第一TIL群体且在第7天添加抗原呈递细胞层至第二TIL群体，其中在第0天添加的抗原呈递细胞层的数量是在第7天添加的抗原呈递细胞层数量的大约50％。

在另一个实施方案中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在引发性第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约1.5个细胞层至为或为约2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约1个细胞层至为或为约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约3个细胞层至为或为约10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约2个细胞层至为或为约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约4个细胞层至为或为约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约4个细胞层至为或为约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在平均厚度为或为约1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在平均厚度为或为约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:10的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:8的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:7的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:6的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:5的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:4的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:3的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:2的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.2至为或为约1:8的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.3至为或为约1:7的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.4至为或为约1:6的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.5至为或为约1:5的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.6至为或为约1:4的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.7至为或为约1:3.5的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.8至为或为约1:3的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.9至为或为约1:2.5的范围内。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例为或为约1:2。

在另一个实施方案中，引发性第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，并且快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比例处于为或为约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量处于约1.0×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量处于约1.5×10

在一些实施方案中，所述引发性第一扩增中的APC数量处于约2.0×10

H.任选的细胞培养基组分

1.抗CD3抗体

在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图1(特别是例如图1B和/或图1C))的培养基包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合诱导TIL群体中的T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab’)2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，特此以引用的方式整体并入本文中。

本领域中的技术人员将会理解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在特定实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)。

表5：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列

2.4-1BB(CD137)激动剂

在一个实施方案中，引发性第一扩增和/或快速第二扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一个实施方案中，TNFRSF激动剂是4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可为任何本领域中已知的4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可为能够与人或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链和轻链。如本文中所使用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人、人源化或嵌合抗体和抗体片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达库产生的片段、任何上述者的表位结合片段、以及抗体的经工程改造形式例如与4-1BB结合的scFv分子。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是为完全人抗体的抗原结合蛋白质。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是为人源化抗体的抗原结合蛋白质。在一些实施方案中，用于本公开方法和组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB粘连蛋白(adnectin)、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体可诱导强烈免疫应答。Lee,等人,PLOS One2013,8,e69677。在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂是激动性抗4-1BB人源化或完全人单克隆抗体(即源自单一细胞系的抗体)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。

在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可为融合蛋白。在一个优选的实施方案中，相较于通常拥有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体而言，多聚体4-1BB激动剂诸如三聚体或六聚体4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优异的受体(4-1BBL)簇集和内部细胞性信号传导复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且任选地进一步连接两个或更多个这些融合蛋白的三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更大融合蛋白描述于例如Gieffers,等人,Mol.Cancer Therapeutics 2013,12,2735-47中。

已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白可诱导强烈免疫应答。在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂是以足以降低毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是废除抗体依赖性细胞性毒性(ADCC)，例如NK细胞细胞毒性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是废除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是废除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是废除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。

在一些实施方案中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和性和激动性活性与人4-1BB(SEQ ID NO:9)结合。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是与人4-1BB(SEQ ID NO:9)结合的结合分子。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是与鼠4-1BB(SEQ ID NO:10)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列总结于表6中。

表6. 4-1BB抗原的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约100pM或更低的K

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约7.5×10

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约2×10

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约10nM或更低的IC

在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌托鲁单抗可得自Pfizer,Inc.。乌托鲁单抗是免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌托鲁单抗的氨基酸序列是如表7所示。乌托鲁单抗包含位于Asn59和Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(V

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含由SEQ ID NO:11给出的重链和由SEQ IDNO:12给出的轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12中所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含乌托鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是药物监管结构参照乌托鲁单抗所核准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，所述4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是乌托鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中所述4-1BB激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是乌托鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是乌托鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是乌托鲁单抗。

表7.与乌托鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，4-1BB激动剂是单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可得自Bristol-Myers Squibb,Inc.和Creative Biolabs,Inc.。乌瑞鲁单抗是免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌瑞鲁单抗的氨基酸序列是如表EE所示。乌瑞鲁单抗包含位于位置298(和298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(V

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含由SEQ ID NO:21给出的重链和由SEQ IDNO:22给出的轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22中所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，4-1BB激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是药物监管机构参照乌瑞鲁单抗所核准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，所述4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中所述4-1BB激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是乌瑞鲁单抗。

表8：与乌瑞鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂选自由以下组成的组：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo FisherMS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、由保藏为ATCC号HB-11248的细胞系产生且公开于美国专利号6,974,863中的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BDPharmingen 559446)、公开于美国专利申请公布号US 2005/0095244中的抗体、公开于美国专利号7,288,638中的抗体(诸如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、公开于美国专利号6,887,673中的抗体(诸如4E9或BMS-554271)、公开于美国专利号7,214,493中的抗体、公开于美国专利号6,303,121中的抗体、公开于美国专利号6,569,997中的抗体、公开于美国专利号6,905,685中的抗体(诸如4E9或BMS-554271)、公开于美国专利号6,362,325中的抗体(诸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、公开于美国专利号6,974,863中的抗体(诸如53A2)；公开于美国专利号6,210,669中的抗体(诸如1D8、3B8或3El)、描述于美国专利号5,928,893中的抗体、公开于美国专利号6,303,121中的抗体、公开于美国专利号6,569,997中的抗体、公开于国际专利申请公布号WO 2012/177788、WO 2015/119923和WO 2010/042433中的抗体以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公布各自的公开内容以引用的方式并入本文中。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是国际专利申请公布号WO 2008/025516 A1、WO2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1和WO 2010/078966 A1；美国专利申请公布号US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1和US 2015/0126710 A1；和美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460中所述的4-1BB激动性融合蛋白，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是如图110所提供的结构I-A(C末端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc-抗体片段融合蛋白)所描绘的4-1BB激动性融合蛋白或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物：

在结构I-A和I-B中，圆柱体是指个别多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的源自例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(TNFSF9))或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合结构域，所述TNFRSF结合结构域折叠以形成三价蛋白质，其接着与第二个三价蛋白质经由IgG1-Fc(包括C

结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列在表9中给出。Fc结构域优选地包含完整恒定结构域(SEQ ID NO:31的氨基酸17至230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO:31的氨基酸1至16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO:31的氨基酸4至16)。用于连接C末端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41给出的实施方案，包括适用于融合额外多肽的接头。

表9：TNFRSF激动剂融合蛋白的氨基酸序列，包括4-1BB激动剂融合蛋白，具有C末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)。

结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列在表10中给出。如果Fc抗体片段如结构I-B中融合至TNRFSF激动剂融合蛋白的N末端，则Fc模块的序列优选地显示于SEQ ID NO:42，并且接头序列优选地选自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示的那些实施方案。

表10：TNFRSF激动剂融合蛋白的氨基酸序列，包括4-1BB激动剂融合蛋白，具有N末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个选自由以下组成的组的4-1BB结合结构域：乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、选自表10所述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合结构域，所述4-1BB结合结构域包含4-1BBL序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合结构域，所述4-1BB结合结构域包含根据SEQ ID NO:46的序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合结构域，所述4-1BB结合结构域包含可溶性4-1BBL序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合结构域，所述4-1BB结合结构域包含根据SEQ ID NO:47的序列。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个或多个4-1BB结合结构域，所述4-1BB结合结构域是包含各自分别与SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中所示的序列至少95％同一的V

表11：在融合蛋白中用作4-1BB结合结构域或用作scFv 4-1BB激动剂抗体的额外多肽结构域。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含在N末端和/或C末端的额外结构域，并且其中所述额外结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含在N末端和/或C末端的额外结构域，其中所述额外结构域是Fab或Fc片段结构域，其中所述可溶性4-1BB结构域中的每一者缺乏茎区域(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某些距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)且所述第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸长度。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中可溶性TNF超家族细胞因子结构域中的每一者缺乏茎区域且所述第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸长度，并且其中各TNF超家族细胞因子结构域是4-1BB结合结构域。

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性scFv抗体，其包含连接至任何前述V

在一个实施方案中，4-1BB激动剂是BPS Bioscience的4-1BB激动剂抗体(目录号79097-2，可购自BPS Bioscience,San Diego,CA,USA)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂是Creative Biolabs的4-1BB激动剂抗体(目录号MOM-18179，可购自Creative Biolabs,Shirley,NY,USA)。

3.OX40(CD134)激动剂

在一个实施方案中，TNFRSF激动剂是OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域中已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可为能够与人或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链和轻链。如本文中所使用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人、人源化或嵌合抗体和抗体片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达库产生的片段、任何上述者的表位结合片段以及抗体的经工程改造形式例如与OX40结合的scFv分子。在一个实施方案中，OX40激动剂是为完全人抗体的抗原结合蛋白质。在一个实施方案中，OX40激动剂是为人源化抗体的抗原结合蛋白质。在一些实施方案中，用于本公开方法和组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40粘连蛋白、抗OX40结构域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选的实施方案中，OX40激动剂是激动性抗OX40人源化或完全人单克隆抗体(即源自单一细胞系的抗体)。

在一个优选的实施方案中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun,等人,J.Immunother.2009,182,1481-89。在一个优选的实施方案中，相较于通常拥有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体而言，多聚体OX40激动剂诸如三聚体或六聚体OX40激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优异的受体(OX40L)簇集和内部细胞性信号传导复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且任选地进一步连接两个或更多个这些融合蛋白的三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更大融合蛋白描述于例如Gieffers,等人,Mol.CancerTherapeutics 2013,12,2735-47中。

已知激动性OX40抗体和融合蛋白可诱导强烈免疫应答。Curti,等人,CancerRes.2013,73,7189-98。在一个优选的实施方案中，OX40激动剂是以足以降低毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂是废除抗体依赖性细胞性毒性(ADCC)，例如NK细胞细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂是废除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂是废除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂是废除Fc区功能性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。

在一些实施方案中，OX40激动剂的特征在于以高亲和性和激动性活性与人OX40(SEQ ID NO:54)结合。在一个实施方案中，OX40激动剂是与人OX40(SEQ ID NO:54)结合的结合分子。在一个实施方案中，OX40激动剂是与鼠OX40(SEQ ID NO:55)结合的结合分子。OX40激动剂或结合分子所结合的OX40抗原的氨基酸序列总结于表12中。

表12：OX40抗原的氨基酸序列

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约100pM或更低的K

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约7.5×10

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约2×10

在一些实施方案中，所描述的组合物、过程和方法包括以约10nM或更低的IC

在一些实施方案中，OX40激动剂是他伏利昔组单抗，也称为MEDI0562或MEDI-0562。他伏利昔组单抗可得自AstraZeneca,Inc.的子公司MedImmune。他伏利昔组单抗是免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化和嵌合单克隆抗体。他伏利昔组单抗的氨基酸序列是如表13所示。他伏利昔组单抗包含位于位置301和301”的N-糖基化位点，附接岩藻糖基化复合物双触角CHO型聚糖；位于位置22-95(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO:56给出的重链和由SEQ ID NO:57给出的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:56和SEQID NO:57中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含他伏利昔组单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，OX40激动剂是药物监管机构参照他伏利昔组单抗所核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是他伏利昔组单抗。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中所述OX40激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是他伏利昔组单抗。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是他伏利昔组单抗。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是他伏利昔组单抗。

表13：与他伏利昔组单抗有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。

在一些实施方案中，OX40激动剂是11D4，其是可得自Pfizer,Inc.的完全人抗体。11D4的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930和9,028,824中，其公开内容以引用的方式并入本文中。11D4的氨基酸序列是如表14所示。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO:66给出的重链和由SEQ ID NO:67给出的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:66和SEQID NO:67中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，OX40激动剂是药物监管机构参照11D4所核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是11D4。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中所述OX40激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是11D4。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是11D4。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是11D4。

表14：与11D4有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。

在一些实施方案中，OX40激动剂是18D8，其是可得自Pfizer,Inc.的完全人抗体。18D8的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930和9,028,824号，其公开内容以引用的方式并入本文中。18D8的氨基酸序列是如表15所示。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO:76给出的重链和由SEQ ID NO:77给出的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中所示的序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中所示的序列至少99％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中所示的序列至少98％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中所示的序列至少97％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:76和SEQID NO:77中所示的序列至少96％同一的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77中所示的序列至少95％同一的重链和轻链。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，OX40激动剂是药物管理机构参照18D8所核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是18D8。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中所述OX40激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是18D8。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是18D8。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是18D8。

表15：与18D8有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。

在一些实施方案中，OX40激动剂是Hu119-122，其是可得自GlaxoSmithKline plc.的人源化抗体。Hu119-122的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085号和国际专利公布号WO 2012/027328号，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu119-122的氨基酸序列是如表16所示。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，OX40激动剂是药物管理机构参照Hu119-122所核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu119-122。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中所述OX40激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu119-122。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu119-122。

表16：与Hu119-122有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。

在一些实施方案中，OX40激动剂是Hu106-222，其是可得自GlaxoSmithKline plc.的人源化抗体。Hu106-222的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085号和国际专利公布号WO 2012/027328号，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu106-222的氨基酸序列是如表17所示。

在一个实施方案中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(V

在一个实施方案中，OX40激动剂包含具有分别如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98中所示的序列的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代，和具有分别如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101中所示的序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域和它们的保守性氨基酸取代。

在一个实施方案中，OX40激动剂是药物管理机构参照Hu106-222所核准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，所述OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且其相较于所述参考药品或参考生物产品包含一个或多个翻译后修饰，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方案中，所述一个或多个翻译后修饰选自以下中的一者或多者：糖基化、氧化、脱酰胺和截短。在一些实施方案中，生物类似物是获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中所述OX40激动剂抗体提供于与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药物监管机构诸如美国FDA和/或欧盟的EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方案中，生物类似物被提供为还包含一种或多种赋形剂的组合物，其中所述一种或多种赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中所述参考药品或参考生物产品是Hu106-222。

表17：与Hu106-222有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。

在一些实施方案中，OX40激动剂抗体系MEDI6469(又称为9B12)。MEDI6469是鼠单克隆抗体。Weinberg,等人,J.Immunother.2006,29,575-585。在一些实施方案中，OX40激动剂由9B12杂交瘤产生的抗体(由Biovest Inc.(Malvern,MA,USA)保藏)，其描述于Weinberg,等人,J.Immunother.2006,29,575-585，其公开特此以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施方案中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。

在一个实施方案中，OX40激动剂是L106 BD(Pharmingen Product#340420)。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen Product#340420)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen Product#340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方案中，OX40激动剂是ACT35(Santa CruzBiotechnology,Catalog#20073)。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体ACT35(SantaCruz Biotechnology,Catalog#20073)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology,Catalog#20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方案中，OX40激动剂是鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(OX86克隆)，其可购自InVivoMAb,BioXcell Inc,West Lebanon,NH。

在一个实施方案中，OX40激动剂选自描述于国际专利申请公布号WO 95/12673、WO95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191和WO2014/148895；欧洲专利申请案EP 0672141；美国专利申请公布号US 2010/136030、US2014/377284、US 2015/190506和US 2015/132288(包括20E5和12H3克隆)；和美国专利号7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399和9,163,085号中的OX40激动剂，它们各自的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

在一个实施方案中，OX40激动剂是如结构I-A(C端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc-抗体片段融合蛋白)所描绘的OX40激动性融合蛋白或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的性质描述于以上和美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460号，其公开内容以引用的方式并入本文中。结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列在表9中给出。Fc结构域优选地包含完整恒定结构域(SEQ ID NO:31的氨基酸17至230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO:31的氨基酸1至16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO:31的氨基酸4至16)。用于连接C末端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41给出的实施方案，包括适用于融合额外多肽的接头。类似地，结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列在表10中给出。如果Fc抗体片段如结构I-B中融合至TNRFSF融合蛋白的N末端，则Fc模块的序列优选地显示于SEQ ID NO:42，并且接头序列优选地选自如SEQ IDNO:43至SEQ ID NO:45所示的那些实施方案。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个选自由以下组成的组的OX40结合结构域：他伏利昔组单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表17所述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域包含OX40L序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域包含根据SEQ ID NO:102的序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域包含可溶性OX40L序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域包含根据SEQ ID NO:103的序列。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域包含根据SEQID NO:104的序列。

在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个或多个OX40结合结构域，所述OX40结合结构域是包含各自分别与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59中所示的序列至少95％同一的V

表18：在融合蛋白(例如，结构I-A和I-B)中用作OX40结合结构域或用作scFv OX40激动剂抗体的额外多肽结构域。

在一个实施方案中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性OX40结合结构域，还包含在N端和/或C端的额外结构域，并且其中所述额外结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方案中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性OX40结合结构域，还包含在N端和/或C端的额外结构域，其中所述额外结构域是Fab或Fc片段结构域，其中所述可溶性OX40结合结构域中的每一者缺乏茎区域(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某些距离，但不是OX40结合结构域的一部分)且所述第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸长度。

在一个实施方案中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中可溶性TNF超家族细胞因子结构域中的每一者缺乏茎区域且所述第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸长度，并且其中TNF超家族细胞因子结构域是OX40结合结构域。

在一些实施方案中，OX40激动剂是MEDI6383。MEDI6383是OX40激动性融合蛋白且可如美国专利号6,312,700号所述制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在一个实施方案中，OX40激动剂是OX40激动性scFv抗体，其包含连接至任何前述V

在一个实施方案中，OX40激动剂是Creative Biolabs的OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自Creative Biolabs,Inc.,Shirley,NY,USA。

在一个实施方案中，OX40激动剂是OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自BioLegend,Inc.,San Diego,CA,USA。

I.任选的细胞活力分析

任选地，在引发性第一扩增(有时称为初始本体扩增)之后可使用本领域中已知的标准测定进行细胞活力测定。因此，在某些实施方案中，方法包括在引发性第一扩增后进行细胞活力测定。例如，可在本体TIL的样品上进行台盼蓝排除测定，其选择性地标记死亡细胞且允许活力评估。其他用于测试活力的测定可包括但不限于阿尔玛蓝测定和MTT测定。

1.细胞计数、活力、流式细胞术

在一些实施方案中，测量细胞计数和/或活力。标志物的表达(诸如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及任何其他本文公开或描述者)可通过流式细胞术使用FACSCanto

在一些情况下，本体TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。替代地，本体TIL群体可如以下讨论进行REP且接着冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰的TIL将用于疗法中的情况中，本体或REP TIL群体可进行遗传修饰以用于合适治疗。

2.细胞培养

在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法(包括那些以上讨论以及图1特别是例如图1B和/或图1C例示者)可包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，在引发性第一扩增中的培养基无血清。在一些实施方案中，在第二扩增中的培养基无血清。在一些实施方案中，在引发性第一扩增和第二扩增(也称为快速第二扩增)中的培养基都无血清。在一个实施方案中，扩增TIL数量使用不超过一种细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM链霉素硫酸盐和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)。就此而言，本发明方法有利地减少扩增TIL数量所需的培养基的量和培养基类型的数量。在一个实施方案中，扩增TIL数量可包含频繁性不超过每三或四天一次地饲养细胞。在气体可渗透容器中扩增细胞数量通过减少扩增细胞所需的饲养频率，简化扩增细胞数量所需的程序。

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。

在一个实施方案中，方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；使所述肿瘤组织样品于第一气体可渗透容器中培养约1至8天(例如，约8天)的持续时间作为引发性第一扩增，所述第一气体可渗透容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二气体可渗透容器且于所述第二气体可渗透容器中扩增TIL数量约7至9天(例如，约7天、约8天或约9天)的持续时间，所述第二气体可渗透容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。

在一个实施方案中，方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；使所述肿瘤组织样品于第一气体可渗透容器中培养约1至7天(例如，约7天)的持续时间作为引发性第一扩增，所述第一气体可渗透容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二气体可渗透容器且于所述第二气体可渗透容器中扩增TIL数量约7至9天(例如，约7天、约8天或约9天)的持续时间，所述第二气体可渗透容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。

在一个实施方案中，方法的持续时间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样品；使所述肿瘤组织样品于第一气体可渗透容器中培养约1至7天(例如，约7天)的持续时间作为引发性第一扩增，所述第一气体可渗透容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二气体可渗透容器且于所述第二气体可渗透容器中扩增TIL数量约7至10天(例如，约7天、约8天、约9天或约10天)的持续时间，所述第二气体可渗透容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。

在一个实施方案中，TIL在气体可渗透容器中扩增。已使用气体可渗透容器来扩增TIL，并且使用PBMC、使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括描述于美国专利申请公布号2005/0106717A1中的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，TIL在气体可渗透袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在气体可渗透袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)。在一个实施方案中，TIL使用在气体可渗透袋中扩增TIL的细胞扩增系统扩增，诸如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括气体可渗透细胞袋，所述袋的体积选自由约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L组成的组。

在一个实施方案中，TIL可在G-Rex培养瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。所述实施方案允许细胞群体从约5×10

J.任选的TIL基因工程改造

在一些实施方案中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后包括在密闭、无菌方法期间(各提供于本文中)经进一步操作以用暂时性方式改变蛋白质表达。在一些实施方案中，暂时性改变的蛋白质表达是因为暂时性基因编辑。在一些实施方案中，本发明的扩增TIL用转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施方案中，TF和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子提供TIL群体中改变的肿瘤抗原表达和/或改变肿瘤抗原特异性T细胞的数量。

在某些实施方案中，方法包括基因编辑TIL群体。在某些实施方案中，方法包括基因编辑第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。

在一些实施方案中，本发明包括经由核苷酸插入TIL群体的基因编辑，诸如经由核糖核酸(RNA)插入，包括插入信号传导RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)，以促进一个或多个蛋白质的表达或抑制一个或多个蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。

在一些实施方案中，本发明的扩增TIL经历蛋白质表达的暂时性改变。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一扩增之前的本体TIL群体，包括例如在获自例如图1(特别是图1B和/或图1C)所示的步骤A的TIL群体中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一扩增期间，包括例如在例如图1(例如图1B和/或图1C)所示的步骤B扩增的TIL群体中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一扩增之后，包括例如在第一至第二扩增之间转变的TIL群体中(例如本文所述的第二TIL群体)、获自例如图1所示的步骤B且包括于步骤C的TIL群体。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二扩增之前的本体TIL群体，包括例如在获自例如图1所示的步骤C且在其步骤D扩增之前的TIL群体中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二扩增期间，包括例如在例如图1所示的步骤D扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二扩增之后，包括例如在获自例如图1所示的步骤D扩增的TIL群体中。

在一个实施方案中，暂时性改变TIL群体蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法是本领域中已知的且描述于例如，Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公布号2014/0227237A1中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群体蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和内吞作用)是本领域中已知的且描述于Graham和vander Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利号5,593,875中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群体蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法诸如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的且描述于Rose,等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417和美国专利号5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484和7,687,070中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群体蛋白质表达的方法包括使用美国专利号5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994和7,189,705中所述的方法的转染步骤；它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致干记忆T细胞(TSCM)增加。TSCM是抗原经历中央记忆T细胞的早期祖细胞。TSCM通常显示定义干细胞的长期存活、自我再生和多能能力，并且通常为产生有效TIL产物所希望的。TSCM在过继性细胞转移的小鼠模型中已显示相较于其他T细胞子集增强的抗肿瘤活性(Gattinoni等人Nat Med 2009,2011；Gattinoni,Nature Rev.Cancer,2012；Cieri等人Blood 2013)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致具有包含高比例的TSCM的组合物的TIL群体。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TIL群体中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的TSCM的TIL群体。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的TSCM的治疗性TIL群体。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致抗原经历T细胞焕新(rejuvenation)。在一些实施方案中，焕新包括例如增加增生、增加T细胞活化和/或增加抗原识别。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达改变T细胞一大组分的表达，以保留肿瘤来源的TCR谱库。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达不改变肿瘤来源的TCR谱库。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达维持肿瘤来源的TCR谱库。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质导致改变特定基因的表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向包括但不限于以下基因：PD-1(也称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1和/或cAMP蛋白质激酶A(PKA)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向选自由以下组成的组的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受体)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1和/或cAMP蛋白质激酶A(PKA)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向PD-1。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向TGFBR2。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR4/5。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CBLB。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CISH。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-2。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-12。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-15。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向IL-21。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向TIM3。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向LAG3。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向TIGIT。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向TGFβ。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR1。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR2。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR4。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCR5。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCR1。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCR2。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CSCR3。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL5(RANTES)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCL1。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CXCL8。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL22。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CCL17。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向VHL。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向CD44。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向PIK3CD。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向SOCS1。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达靶向cAMP蛋白质激酶A(PKA)。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致趋化激素受体增加和/或过表达。在一些实施方案中，因暂时性蛋白质表达而过表达的趋化激素受体包括配体包括但不限于CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17的受体。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ途径阻断)。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH的表达降低和/或减少。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致趋化激素受体增加和/或过表达，以例如改善TIL移动或运动至肿瘤部位。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致CCR(嵌合共刺激受体)增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3组成的组的趋化激素受体增加和/或过表达。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致白细胞介素增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由IL-2、IL-12、IL-15和/或IL-21组成的组的白细胞介素增加和/或过表达。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致NOTCH 1/2ICD增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致VHL增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致CD44增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PIK3CD增加和/或过表达。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致SOCS1增加和/或过表达。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致cAMP蛋白质激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的分子的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的两个分子的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1和选自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的一个分子的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3和它们的组合的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1和LAG3、CISH、CBLB、TIM3和它们的组合中的一者的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致PD-1和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致LAG3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致CISH和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3和PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致TIM3和CBLB的表达降低和/或减少。

在一些实施方案中，选自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合组成的组的粘着性分子通过γ逆转录病毒或慢病毒方法插入第一TIL群体、第二TIL群体或经收获的TIL群体(例如粘着性分子的表达增加)。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的分子的表达降低和/或减少，和CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的表达增加和/或增强。在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达导致选自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB和它们的组合组成的组的分子的表达降低和/或减少，和CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的表达增加和/或增强。

在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。

在一些实施方案中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％。在一些实施方案中，表达增加至少约90％。在一些实施方案中，表达增加至少约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约99％。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达通过用转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导。在一些实施方案中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。所述证实递送蛋白质(包括转录因子)至多种原代人细胞(包括T细胞)的能力的方法(Sharei等人PNAS 2013以及Sharei等人PLOS ONE 2015和Greisbeck等人J.Immunologyvol.195,2015)已经描述；参见例如，国际专利公布WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1和WO 2017/123663A1，所有都以引用的方式整体并入本文中。如描述于国际专利公布WO2013/059343A1、WO 2017/008063A1和WO 2017/123663A1中的此类方法可为本发明所采用，以暴露TIL群体至转录因子(TF)和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子，其中所述TF和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子提供增加肿瘤抗原的表达和/或增加TIL群体中肿瘤抗原特异性T细胞的数量，因此导致TIL群体的重新编程和经重新编程的TIL群体相较于未重新编程的TIL群体的治疗功效增加。在一些实施方案中，重新编程导实现应T细胞和/或中央记忆T细胞子群体相对于如本文所述的TIL的起始或先前(即在重新编程之前)群体增加。

在一些实施方案中，转录因子(TF)包括但不限于TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)是TCF-1。在一些实施方案中，转录因子(TF)是NOTCH 1/2ICD。在一些实施方案中，转录因子(TF)是MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)是与诱导多能干细胞培养(iPSC)诸如市售KNOCKOUT Serum Replacement(Gibco/ThermoFisher)一起施用，以诱导额外的TIL重新编程。在一些实施方案中，转录因子(TF)是与iPSC混合物一起施用，以诱导额外的TIL重新编程。在一些实施方案中，转录因子(TF)不与iPSC混合物一起施用。在一些实施方案中，重新编程导致TSCM的百分比增加。在一些实施方案中，重新编程导致TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的TSCM。

在一些实施方案中，如上述的暂时性改变蛋白质表达的方法可与遗传修饰TIL群体的方法组合，包括稳定并入基因以产生一种或多种蛋白质的步骤。在某些实施方案中，方法包括遗传修饰TIL群体的步骤。在某些实施方案中，方法包括遗传修饰第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导步骤。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导步骤。慢病毒转导系统是本领域中已知的且描述于例如，Levine,等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.2006,103,17372-77；Zufferey,等人,Nat.Biotechnol.1997,15,871-75；Dull,等人,J.Virology1998,72,8463-71和美国专利号6,627,442，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括γ逆转录病毒转导步骤。γ逆转录病毒转导系统是本领域中已知的且描述于例如，Cepko和Pear,Cur.Prot.Mol.Biol.1996,9.9.1-9.9.16中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移步骤。转座子介导的基因转移系统是本领域中已知的且包括其中提供转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞的系统，例如提供转座酶作为mRNA(例如包含帽和聚腺苷酸尾的mRNA)。合适转座子介导的基因转移系统包括鲑型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)诸如SB10、SB11和SB100x和具有增加酶活性的经工程改造的酶描述于例如，Hackett,等人,Mol.Therapy 2010,18,674-83和美国专利号6,489,458中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，暂时性改变蛋白质表达是指由自我递送RNA干扰(sdRNA)所诱导的表达减少，所述自我递送RNA干扰是化学合成的具有高百分比2’-OH取代(一般为氟或-OCH

在一些实施方案中，在制造期间将sdRNA插入TIL群体中。在一些实施方案中，sdRNA编码干扰NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白质激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBLB的RNA。在一些实施方案中，表达减少是基于基因沉默的百分比确定，例如通过流式细胞术和/或qPCR评估。在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。

基于化学修饰siRNA的可自我递送RNAi技术可为本发明的方法所采用，以成功递送sdRNA至如本文所述的TIL。组合不对称siRNA结构对主链的修饰与疏水性配体(参见例如，Ligtenberg,等人,Mol.Therapy,2018和US20160304873)允许sdRNA通过简单添加至培养基而穿透培养的哺乳动物细胞，不需要额外制剂和方法，充分利用sdRNA的核酸酶稳定性。此稳定性允许在只需维持sdRNA于培养基中的有效浓度下，支持恒定量的RNAi介导的目标基因活性减少。虽然不受理论限制，sdRNA的主链稳定化提供延长减少基因表达效应，其在非分裂细胞中可持续数月。

在一些实施方案中，超过95％的TIL转染效率和目标的表达减少通过各种特异性sdRNA发生。在一些实施方案中，含有数个未经修饰的核糖残基的sdRNA经完全修饰的序列置换，以增加RNAi效应的效力和/或寿命。在一些实施方案中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更多天。在一些实施方案中，表达减少效应在TIL经sdRNA处理后10天或更多天降低。在一些实施方案中，目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，TIL中的目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1途径的表达减少允许TIL展现更强效的体内效应，这在一些实施方案中是因为避免PD-1/PD-L1途径的抑制效应。在一些实施方案中，因sdRNA的PD-1表达减少导致增加TIL增生。

小干扰RNA(siRNA)(有时称为短干扰RNA或沉默RNA)是双链RNA分子，长度通常为19至25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)，其中其利用互补核苷酸序列干扰特定基因的表达。

双链DNA(dsRNA)通常可用于定义包含一对RNA互补链(通常为有义(乘客)和反义(引导)链)的任何分子且可包括单链突出端区。相对于siRNA，术语dsRNA通常是指包括siRNA分子序列的前体分子，所述siRNA分子通过裂解酶系统包括Dicer酶的作用从较大dsRNA分子释放。

sdRNA(可自我递送RNA)是新类型的经共价修饰的RNAi化合物，其不需要递送介导物即可进入细胞且相较于传统siRNA具有改善的药理学。“可自我递送RNA”或“sdRNA”是经疏水性修饰的RNA干扰-反义杂合体，经证实在体外原代细胞和体内局部施用时高度有效。已证实稳健摄取和/或沉默且无毒性。sdRNA是大致上不对称的经化学修饰的核酸分子，具有极少双链区域。sdRNA分子一般含有单链区域和双链区域，并且在分子的单链和双链区域内都可含有多种化学修饰。此外，sdRNA分子可附接至疏水性缀合物，诸如本文所述的常规和先进的固醇类分子。sdRNA和制造所述sdRNA的相关方法也广泛描述于例如US20160304873、WO2010033246、WO2017070151、WO2009102427、WO2011119887、WO2010033247A2、WO2009045457、WO2011119852，它们所有都以引用的方式整体并入本文中以用于所有目的。为了优化sdRNA结构、化学、靶向位置、序列优先性等，开发了专用算法且运用于sdRNA的效力预测(参见例如，US 20160304873)。基于这些分析，功能性sdRNA序列通常被定义为在1μM浓度下具有超过70％的表达减少，并且机率超过40％。

在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现70％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现75％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现80％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现85％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现90％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现95％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列展现99％的目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时展现目标基因表达减少。

在一些实施方案中，寡核苷酸剂包含一种或多种修饰以增加治疗剂的稳定性和/或有效性和实现寡核苷酸至待治疗的细胞或组织的有效递送。此类修饰可包括2’-O-甲基修饰、2’-O-氟基修饰、二硫代磷酸酯修饰、2’F修饰的核苷酸、2’-O-甲基修饰的和/或2’脱氧核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸经修饰以包括一种或多种疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苄基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在额外特定实施方案中，经化学修饰的核苷酸是硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。在一些实施方案中，糖可经修饰且经修饰的糖可包括但不限于D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-0-乙基)，即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-S-烷基、2’-卤基(包括2’-氟基)、T-甲氧基乙氧基、2’-烯丙基氧基(-OCH

在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸的全长是双链，即分子任一端不具有突出端单链序列，即为钝端。在一些实施方案中，个别核酸分子可具有不同长度。换句话说，本发明的双链寡核苷酸不是全长双链。例如，当使用两个分开的核酸分子时，其中一个分子例如包含反义序列的第一分子可比与其杂交的第二分子更长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施方案中，当使用单一核酸分子时，一部分的分子在任一端可维持单链。

在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在寡核苷酸至少约70％的长度中为双链。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸至少约80％的长度中为双链。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸至少约90％至95％的长度中为双链。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在寡核苷酸至少约96％至98％的长度中为双链。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。

在一些实施方案中，寡核苷酸可通过修饰例如3’或5’键联(例如美国专利号5,849,902和WO 98/13526)而实质上不受核酸酶作用。例如，可通过纳入“阻断基团”而使寡核苷酸具有抗性。本文中使用的术语“阻断基团”是指可附接至寡核苷酸或核单体(nucleomonomer)作为合成的保护基或偶合基团(例如FITC、丙基(CH

在一些实施方案中，sdRNA内的至少一部分毗连多核苷酸通过取代基键联例如硫代磷酸酯键联连接。

在一些实施方案中，化学修饰可导致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500种细胞摄取增强(enhancements in cellular uptake)。在一些实施方案中，C或U残基中的至少一者包括疏水性修饰。在一些实施方案中，多个C和U含有疏水性修饰。在一些实施方案中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C和U可含有疏水性修饰。在一些实施方案中，所有C和U含有疏水性修饰。

在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA经由并入可质子化胺展现增强的胞内体释放sd-rxRNA分子。在一些实施方案中，可质子化胺被并入有义链(在RISC负载后被弃置的分子部分)。在一些实施方案中，本发明的sdRNA化合物包含不对称化合物，所述不对称化合物包含双链区域(有效RISC进入所需，10至15个碱基长)和4至12个核苷酸长的单链区域；具有13个核苷酸双链。在一些实施方案中，采用6个核苷酸的单链区域。在一些实施方案中，sdRNA的单链区域包含2至12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中，采用6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中，本发明的sdRNA化合物也包括独特的化学修饰模式，其提供稳定性且与RISC进入相容。

举例来说，引导链也可通过任何证实稳定性且不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施方案中，引导链中的化学修饰模式包括大部分C和U核苷酸是2’F修饰的，并且5’端经磷酸化。

在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30％的核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中100％的核苷酸是经修饰的。

在一些实施方案中，sdRNA分子具有极少双链区域。在一些实施方案中，双链的分子区域从8至15个核苷酸长不等。在一些实施方案中，双链的分子区域是8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在一些实施方案中，双链区域是13个核苷酸长。引导与乘客链之间可有100％互补性，或者引导与乘客链之间可有一个或多个错配。在一些实施方案中，在双链分子的一端上，分子为钝端或具有一个核苷酸突出端。分子的单链区域在一些实施方案中是介于4至12个核苷酸长。在一些实施方案中，单链区域可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。在一些实施方案中，单链区域也可小于4个或大于12个核苷酸长。在某些实施方案中，单链区域是6或7个核苷酸长。

在一些实施方案中，sdRNA分子具有降低的稳定性。在一些例子中，经化学修饰的sdRNA或sd-rxRNA分子在培养基中具有长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时(包括任何中间值)的半衰期。在一些实施方案中，sd-rxRNA在培养基中具有长于12小时的半衰期。

在一些实施方案中，sdRNA经优化以增加效力和/或降低毒性。在一些实施方案中，引导和/或乘客链的核苷酸长度和/或引导和/或乘客链中的硫代磷酸酯修饰数量在一些方面可影响RNA分子的效力，然而以2’-0-甲基(2’OMe)修饰置换2’-氟基(2’F)修饰在一些方面中可影响分子的毒性。在一些实施方案中，预期减少分子的2’F含量可减少分子的毒性。在一些实施方案中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数量可影响细胞的分子摄取，例如被动摄取分子至细胞中的效率。在一些实施方案中，sdRNA不具有2’F修饰，但特征仍为相等的细胞摄取性和组织穿透效率。

在一些实施方案中，引导链的长度大约是18至19个核苷酸且具有大约2至14个磷酸盐修饰。例如，引导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或超过14个经磷酸盐修饰的核苷酸。引导链可含有一个或多个授予增加的稳定性且不干扰RISC进入的修饰。经磷酸盐修饰的核苷酸(诸如经硫代磷酸酯修饰的核苷酸)可位于3’端、5’端或分布在整个引导链。在一些实施方案中，引导链3’末端的10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。引导链也可含有2’F和/或2’OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施方案中，在引导链位置一的核苷酸(引导链最5’位置的核苷酸)是经2’OMe修饰的和/或经磷酸化的。引导链内的C和U核苷酸可经2’F修饰。例如，19个nt的引导链的位置2至10(或对应不同长度引导链中的位置)的C和U核苷酸可经2’F修饰。引导链内的C和U核苷酸也可经2’OMe修饰。例如，l9个nt的引导链的位置11至18(或对应不同长度引导链中的位置)的C和U核苷酸可经2’OMe修饰。在一些实施方案中，在引导链最3’端的核苷酸未经修饰。在某些实施方案中，在引导链内大部分C和U经2’F修饰且引导链的5’端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和在位置11至18的C或U经2’OMe修饰且引导链的5’端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和在位置11至18的C或U经2’OMe修饰，引导链的5’端经磷酸化且在位置2至10的C或U经2’F修饰。

可自我递送RNAi技术提供用RNAi剂直接转染细胞的方法，无须额外制剂或技术。转染难以转染细胞系的能力、高体内活性和易于使用是这类组合物和方法的特征，相较于基于siRNA的传统技术呈现显著功能优点，并且因此在数个关于在本发明的TIL中目标基因表达减少的方法的实施方案中采用sdRNA方法。sdRNAi方法允许直接递送化学合成化合物至广泛范围的离体和体内原代细胞和组织。在本发明的一些实施方案中描述的sdRNA可购自Advirna LLC,Worcester,MA,USA。

sdRNA形成为经疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂交结构，并且公开于例如Byrne等人,2013年12月,J.Ocular Pharmacology and Therapeutics,29(10):855-864，其以引用的方式整体并入本文中。

在一些实施方案中，sdRNA寡核苷酸可使用无菌电穿孔递送至本文所述的TIL。在某些实施方案中，方法包括无菌电穿孔TIL群体以递送sdRNA寡核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合以递送至细胞。在一些实施方案中，此跨膜递送系统包含脂质、病毒载体和类似物。在一些实施方案中，寡核苷酸剂是从我递送RNAi剂，不需要任何递送剂。在某些实施方案中，方法包括使用跨膜递送系统递送sdRNA寡核苷酸至TIL群体。

寡核苷酸和寡核苷酸组合物接触(例如，使接触，在本文中也称为施用或递送至)本文所述的TIL且被摄入，包括经由TIL被动摄取。sdRNA可在第一扩增期间(例如，步骤B)、在第一扩增之后(例如，步骤C期间)、第二扩增之前或期间(例如，步骤D之前或期间)、步骤D之后和步骤E收获之前、步骤F收获期间或之后、步骤F最终制剂和/或转移至输注袋之前或期间、以及步骤F任何任选的冷冻保存步骤之前添加至本文所述的TIL。另外，sdRNA可在从步骤F任何冷冻保存步骤解冻后添加。在一个实施方案中，可将一个或多个靶向如本文所述的基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB的sdRNA，以选自由100nM至20mM、200nM至10mM、500nm至1mM、1μM至100μM和1μM至100μM组成的组的浓度添加至包含TIL及其他剂的细胞培养基。在一个实施方案中，可将一个或多个靶向如本文所述的基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB的sdRNA，以选自由0.1μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基或10μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基组成的组的量添加至包含TIL及其他剂的细胞培养基。在一个实施方案中，可将一个或多个靶向如本文所述的基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH和CBLB的sdRNA在REP前或REP阶段期间，以一天二次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培养。

本发明的寡核苷酸组合物包括sdRNA可在扩增过程期间与本文所述的TIL接触，例如以高浓度溶解sdRNA于细胞培养基中且允许足够时间让被动摄取发生。在某些实施方案中，本发明的方法包括使TIL群体与如本文所述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施方案中，方法包括将寡核苷酸例如sdRNA溶解于细胞培养基中且使细胞培养基与TIL群体接触。TIL可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。

在一些实施方案中，递送寡核苷酸至细胞中可通过合适的本领域认可方法增强，包括磷酸钙、DMSO、甘油或葡聚糖、电穿孔，或通过使用例如阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体使用本领域中已知的方法转染(参见例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美国专利号4,897,355；Bergan等人1993.Nucleic Acids Research.21:3567)。

在一些实施方案中，使用超过一个sdRNA来减少目标基因的表达。在一些实施方案中，一起使用一个或多个靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3和/或CISH的sdRNA。在一些实施方案中，使用PD-1sdRNA与TIM-3、CBLB、LAG3和/或CISH中的一者或多者，以减少超过一个基因目标的表达。在一些实施方案中，使用LAG3 sdRNA与靶向CISH的sdRNA的组合，以减少两个目标的基因表达。在一些实施方案中，在本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3和/或CISH中的一者或多者的sdRNA可购自Advirna LLC,Worcester,MA,USA。

在一些实施方案中，sdRNA靶向选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的基因。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的基因。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向PD-1且另一个sdRNA靶向选自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合组成的组的基因。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3和它们的组合的基因。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自PD-1和LAG3、CISH、CBLB、TIM3和它们的组合中的一者的基因。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向PD-1且一个sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向PD-1且一个sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向PD-1且一个sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向LAG3且一个sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向LAG3且一个sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向CISH且一个sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向TIM3且一个sdRNA靶向PD-1。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向TIM3且一个sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向TIM3且一个sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一个sdRNA靶向TIM3且一个sdRNA靶向CBLB。

如上所讨论，本发明的实施方案提供经由基因编辑以增强治功效应的经遗传修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。本发明的实施方案包含经由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL群体的基因编辑，以促进一种或多种蛋白质的表达和抑制一种或多种蛋白质的表达以及它们的组合。本发明的实施方案还提供用于扩增TIL成治疗性群体的方法，其中所述方法包括基因编辑TIL。有数种可用来遗传修饰TIL群体的基因编辑技术，它们适用于本发明。

在一些实施方案中，方法包括遗传修饰TIL群体的方法，其包括稳定并入基因以产生一种或多种蛋白质的步骤。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导步骤。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导步骤。慢病毒转导系统是本领域中已知的且描述于例如，Levine,等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.2006,103,17372-77；Zufferey,等人,Nat.Biotechnol.1997,15,871-75；Dull,等人,J.Virology1998,72,8463-71和美国专利号6,627,442，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括γ逆转录病毒转导步骤。γ逆转录病毒转导系统是本领域中已知的且描述于例如，Cepko和Pear,Cur.Prot.Mol.Biol.1996,9.9.1-9.9.16中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移步骤。转座子介导的基因转移系统是本领域中已知的且包括其中提供转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞的系统，例如提供转座酶作为mRNA(例如包含帽和聚腺苷酸尾的mRNA)。合适转座子介导的基因转移系统包括鲑型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)诸如SB10、SB11和SB100x和具有增加酶活性的经工程改造的酶描述于例如，Hackett,等人,Mol.Therapy 2010,18,674-83和美国专利号6,489,458中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。

在一个实施方案中，方法包括遗传修饰TIL群体例如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体的方法。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括稳定并入基因以产生或抑制(例如沉默)一种或多种蛋白质的步骤。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括电穿孔步骤。电穿孔方法是本领域中已知的且描述于例如，Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公布号2014/0227237A1中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用其他本领域中已知的电穿孔方法，诸如描述于美国专利号5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613和6,078,490中的那些，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，电穿孔方法是无菌电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，所述方法包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或造成TIL中经定义且受控制的永久或暂时变化的步骤，包含施加至少三次单一、操作者控制、独立编程的具有等于或大于100V/cm场强的DC电气脉冲的序列至TIL的步骤，其中至少三次DC电气脉冲的序列具有一、二或三种以下特征：(1)至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲振幅上不同；(2)至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲宽度上不同；和(3)第一组至少三次脉冲中二次的第一脉冲间隔与第二组至少三次脉冲中二次的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，所述方法包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或造成TIL中经定义且受控制的永久或暂时变化的步骤，包含施加至少三次单一、操作者控制、独立编程的具有等于或大于100V/cm场强的DC电气脉冲的序列至TIL的步骤，其中至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲振幅上不同。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，所述方法包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或造成TIL中经定义且受控制的永久或暂时变化的步骤，包含施加至少三次单一、操作者控制、独立编程的具有等于或大于100V/cm场强的DC电气脉冲的序列至TIL的步骤，其中至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲宽度上不同。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，所述方法包括用脉冲电场处理TIL以改变、操作或造成TIL中经定义且受控制的永久或暂时变化的步骤，包含施加至少三次单一、操作者控制、独立编程的具有等于或大于100V/cm场强的DC电气脉冲的序列至TIL的步骤，其中第一组至少三次脉冲中二次的第一脉冲间隔与第二组至少三次脉冲中二次的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法是脉冲电穿孔方法，所述方法包括用脉冲电场处理TIL以在TIL中诱导孔洞形成的步骤，包含施加至少三次具有等于或大于100V/cm场强的DC电气脉冲的序列至TIL的步骤，其中至少三次DC电气脉冲的序列具有一、二或三种以下特征：(1)至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲振幅上不同；(2)至少三次脉冲中至少二次彼此在脉冲宽度上不同；和(3)第一组至少三次脉冲中二次的第一脉冲间隔与第二组至少三次脉冲中二次的第二脉冲间隔不同，以使得经诱导的孔洞持续相对长的时间段，并且使得TIL的活力得以维持。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和内吞作用)是本领域中已知的且描述于Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利号5,593,875中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括脂质体转染步骤。脂质体转染方法诸如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的且描述于Rose,等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417和美国专利号5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484和7,687,070中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，遗传修饰TIL群体的方法包括使用美国专利号5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994和7,189,705所述的方法的转染步骤；它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可为如本文所述的TIL第一群体、第二群体和/或第三群体。

根据实施方案，基因编辑过程可包含使用可编程的核酸酶以在一个或多个免疫检查点基因介导双链或单链断裂产生。所述可编程核酸酶通过在特定基因座引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即它们依赖识别基因组内特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置且在靶向序列介导产生双链断裂。DNA中的双链断裂后续募集内源性修复机制至断裂部位，以通过非同源末端联结(NHEJ)或同源引导修复(HDR)介导基因组编辑。因此，断裂修复可导致引入破坏(例如沉默、阻抑或增强)目标基因产物的插入/缺失突变。

经开发而能够进行定点基因组编辑的主要核酸酶类型包括锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于它们的DNA识别模式大致分为两大类：ZFN和TALEN经由蛋白质-DNA相互作用实现特异性DNA结合，然而CRISPR系统(诸如Cas9)通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA引导分子和通过蛋白质-DNA相互作用来靶向特定DNA序列。参见例如，Cox等人,Nature Medicine,2015,第21卷,第2期。

可用于本发明的TIL扩增方法的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，它们在以下更详细描述。根据一个实施方案，用于扩增TIL成为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如第3代过程)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述进行，其中所述方法还包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一者或多者基因编辑至少一部分的TIL，以产生可提供增强治功效应的TIL。根据一个实施方案，可通过体外比较经基因编辑的TIL与未经修饰的TIL来评估它们的改善的治功效应，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子谱等。在某些实施方案中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法基因编辑TIL群体。

在本发明的一些实施方案中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，诸如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统是流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的合适流式电穿孔系统实例是市售MaxCyte STX系统。有数种可供选择的市售电穿孔仪器可能适用于本发明，诸如可得自BTX-Harvard Apparatus,CellaxessElektra(Cellectricon)的AgilePulse系统或ECM 830、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统是如本文所述的脉冲电穿孔系统，并且与TIL扩增方法的其余部分形成密闭无菌系统。

用于扩增TIL成为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如第3代过程)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述进行，其中所述方法还包括通过CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因编辑至少一部分的TIL。根据具体实施方案，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中沉默或减少一个或多个免疫检查点基因的表达。替代地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中增强一个或多个免疫检查点基因的表达。

CRISPR代表“成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)”。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的CRISPR系统，其中并入RNA和Cas蛋白质且可用于本发明：第I、II和III型。第II型CRISPR(由Cas9例示)是最广为表征的系统之一。

CRISPR技术是改编自细菌和古菌(单细胞微生物的结构域)的天然防卫机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白质(包括Cas9)，通过切碎并摧毁外来入侵者的DNA来阻止病毒及其他外来体的攻击。CRISPR是具有两个独特特征的DNA特化区域：有核苷酸重复和间隔子存在。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区域，并且在重复序列之间穿插有短区段的外来DNA(间隔子)。在第II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合在CRISPR基因座内且经转录和加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA与反式活化crRNA(tracrRNA)粘合且引导Cas蛋白质进行序列特异性切割和沉默致病性DNA。Cas9蛋白质进行的目标识别需要位在crRNA内的“种子”序列和在crRNA结合区域上游的含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻模体(PAM)序列。由此CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向，可切割几乎任何DNA序列。天然系统中的crRNA和tracrRNA可被简化成大约100个核苷酸的单一导引RNA(sgRNA)以用于基因工程改造。CRISPR/Cas系统通过共递送表达Cas9内切核酸酶和必要crRNA组分的质粒可直接移动至人细胞。可使用Cas蛋白质的不同变体以减少靶向限制(例如Cas9同源基因，诸如Cpf1)。

通过以CRISPR方法永久基因编辑TIL而可被沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

通过以CRISPR方法永久基因编辑TIL而可被增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。

用于通过CRISPR方法改变目标基因序列表达且可用于本发明的实施方案的系统、方法和组合物实例描述于美国专利号8,697,359；8,993,233；8,795,965；8,771,945；8,889,356；8,865,406；8,999,641；8,945,839；8,932,814；8,871,445；8,906,616和8,895,308中，它们以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法的资源诸如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒可购自公司诸如GenScript。

在一个实施方案中，如本文所述的TIL群体的遗传修饰可使用如美国专利号US9790490所述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。

用于扩增TIL成为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如过程2A)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述进行，其中所述方法还包括通过TALE方法基因编辑至少一部分的TIL。根据具体实施方案，在TIL扩增过程期间使用TALE方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中沉默或减少一个或多个免疫检查点基因的表达。替代地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中增强一个或多个免疫检查点基因的表达。

TALE代表“转录活化因子样效应物”蛋白质，其包括TALEN(“转录活化因子样效应物核酸酶”)。使用TALE系统进行基因编辑的方法在本文中也可称为TALE方法。TALE是来自植物致病性细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，含有由一系列33至35个氨基酸的重复结构域构成的DNA结合结构域，所述重复结构域各识别单一碱基对。TALE特异性由两个被称为重复可变双残基(RVD)的超变异氨基酸确定。模块化TALE重复连接在一起以识别毗连DNA序列。DNA结合结构域中的特定RVD识别目标基因座中的碱基，提供结构特征以组装可预测的DNA结合结构域。TALE的DNA结合结构域与IIS型FokI内切核酸酶的催化结构域融合，以制造一可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，两个通过14至20个碱基对间隔基因区域分离的个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚化且产生目标双链断裂。

数个利用各种组装方法的大型、系统性研究已指示TALE重复可经组合以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也可经由Cellectis Bioresearch(Paris,France)、Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington,KY,USA)和Life Technologies(Grand Island,NY,USA)的商业途径获得。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于美国专利申请公布号US 2011/0201118 A1；US 2013/0117869 A1；US 2013/0315884 A1；US 2015/0203871 A1和US 2016/0120906 A1中，其公开内容以引用的方式并入本文中。

通过以TALE方法永久基因编辑TIL而可被沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

通过以TALE方法永久基因编辑TIL而可被增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。

用于通过TALE方法改变目标基因序列表达且可用于本发明的实施方案的系统、方法和组合物实例描述于美国专利号8,586,526中，其以引用的方式并入本文中。

用于扩增TIL成为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如第3代过程)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述进行，其中所述方法还包括通过锌指或锌指核酸酶方法基因编辑至少一部分的TIL。根据具体实施方案，在TIL扩增过程期间使用锌指方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中沉默或减少一个或多个免疫检查点基因的表达。替代地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法造成在至少一部分的治疗性TIL群体中增强一个或多个免疫检查点基因的表达。

呈保守ββα构型的个别锌指含有大约30个氨基酸。α螺旋表面上的数个氨基酸一般接触DNA主沟槽中3bp，并且具有不同的选择性水平。锌指具有两个蛋白质结构域。第一结构域是DNA结合结构域，包括真核转录因子且含有锌指。第二结构域是核酸酶结构域，包括FokI限制酶且负责催化裂解DNA。

个别ZFN的DNA结合结构域一般含有介于三与六个之间的个别锌指重复且各可识别介于9与18个之间的碱基对。如果锌指结构域对它们的意图目标位点具有特异性，则即使一对总共识别18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单一基因座。一种产生新的锌指阵列的方法是组合较小的已知特异性的锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个各可识别3个碱基对DNA序列的分开的锌指，以产生可识别9个碱基对目标位点的3指阵列。替代地，可使用基于选择的方式诸如寡聚池工程改造(OPEN)以从随机分组库选择新的锌指阵列，所述随机分组库考虑邻近指之间的上下文依赖(context-dependent)相互作用。经工程改造锌指可自商业途径获得；Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)已与Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发锌指建构的专用平台

通过以锌指方法永久基因编辑TIL而可被沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

通过以锌指方法永久基因编辑TIL而可被增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。

用于通过锌指方法改变目标基因序列表达且可用于本发明的实施方案的系统、方法和组合物实例描述于美国专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626中，它们以引用的方式并入本文中。

用于通过锌指方法改变目标基因序列表达且可用于本发明的实施方案的系统、方法和组合物的其他实例描述于Beane,等人,Mol.Therapy,2015,23 1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，TIL任选地经基因工程改造以包括额外功能性，包括但不限于高亲和性T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或细胞系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，方法包括基因工程改造TIL群体，以包括高亲和性T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或细胞系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群体可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。

K.用于TIL制造的密闭系统

本发明提供在TIL培养过程期间使用密闭系统。所述密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用较少培养瓶且允许成本降低。在一些实施方案中，密闭系统使用两个容器。

所述密闭系统是本领域中熟知且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidan ces/Blood/ucm076779.htm。

无菌连接装置(STCD)在二件可相容管之间产生无菌缀合。此程序允许无菌连接多种容器和管直径。在一些实施方案中，密闭系统包括例如实施例G所述的鲁尔锁和热封系统。在一些实施方案中，密闭系统在无菌条件下经由注射器进入以维持系统的无菌性和密闭特性。在一些实施方案中，采用如实施例G所述的密闭系统。在一些实施方案中，将TIL根据实施例G“最终制剂和填充”章节所述的方法配制到最终产物制剂容器中。

在一些实施方案中，密闭系统从获得肿瘤片段的时开始一直到TIL即将施用至患者或冷冻保存为止，仅使用一个容器。在一些使用两个容器的实施方案中，第一容器是密闭G容器，并且TIL群体在无需打开第一密闭G容器下离心和转移至输注袋。在一些使用两个容器的实施方案中，输注袋是含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦添加了肿瘤样品和/或肿瘤片段，所述系统即可从外面紧密密封以形成密死循环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。

在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。

密闭系统允许TIL在无微生物污染存在下和/或在微生物污染显著减少下生长。

此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧分压各随细胞培养而异。因此，即使适用于细胞培养的培养基经循环，所述密死循环境仍需要持续维持为适合TIL增生的最优选环境。为达此目的，所希望的是通过传感器监测密死循环境的培养液体内的pH、二氧化碳分压和氧分压物理因子，其信号用于控制安装在培养环境入口的气体交换器，并且密死循环境的气体分压根据培养液体中的变化实时调整，以优化细胞培养环境。在一些实施方案中，本发明提供密闭细胞培养系统，其在到密闭系统的入口处包含配备有监测装置的气体交换器，所述监测装置测量所述密死循环境的pH、二氧化碳分压和氧分压，并且通过基于来自所述监测装置的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。

在一些实施方案中，在密死循环境中的压力经连续或间歇控制。也就是说，在密死循环境中的压力可通过例如压力维持装置而异，因此确保空间适合TIL在正压状态下生长，或促进流体在负压状态下渗出且因此促进细胞增生。此外通过间歇性施加负压，有可能通过暂时性收缩密死循环境的体积而一致地且有效地置换在密死循环境中循环的液体。

在一些实施方案中，用于TIL增生的最优选培养组分可经取代或添加，并且可添加包括诸如IL-2和/或OKT3的因子以及组合。

L.任选的TIL冷冻保存

本体TIL群体(例如第二TIL群体)或经扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)可经任选地冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存发生于治疗性TIL群体。在一些实施方案中，冷冻保存发生于在第二扩增后经收获的TIL。在一些实施方案中，冷冻保存发生于图1(特别是例如图1B和/或图1C)的示例性步骤F中的TIL。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于输注袋中。在一些实施方案中，TIL进行冷冻保存然后放入输注袋中。在一些实施方案中，TIL进行冷冻保存且不放入输注袋中。在一些实施方案中，冷冻保存使用冷冻保存培养基进行。在一些实施方案中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。这通常可通过将TIL群体放入冷冻溶液(例如85％补体去活化AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中完成。将细胞溶液放入冷冻小瓶中且储存在-80℃下24小时，任选的转移至气态氮冷冻器中冷冻保存。参见Sadeghi,等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。

当适当时，将细胞自冷冻器移除并在37℃水浴中解冻，直到大约4/5的溶液解冻。将细胞大致上重悬于完全培养基中且任选地洗涤一或多次。在一些实施方案中，解冻的TIL可经计数且依本领域中已知的方式评估活力。

在一个优选的实施方案中，TIL群体是使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10,BioLife Solutions)冷冻保存。在一个优选的实施方案中，TIL群体是使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在一个优选的实施方案中，TIL群体是使用1:1(体积:体积)比例的CS10和细胞培养基冷冻保存。在一个优选的实施方案中，TIL群体是使用约1:1(体积:体积)比例的CS10和细胞培养基冷冻保存，还包含额外的IL-2。

如上所讨论且例示于如图1(特别是例如图1B和/或图1C)中提供的步骤A至E，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的许多时点。在一些实施方案中，在第二扩增(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)步骤D所提供)后的经扩增TIL群体可进行冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群体放入冷冻溶液(例如85％补体去活化AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中完成。将细胞溶液放入冷冻小瓶中且储存在-80℃下24小时，任选的转移至气态氮冷冻器中冷冻保存。参见Sadeghi,等人,Acta Oncologica 2013,52,978-986。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于5％DMSO中。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于细胞培养基加5％DMSO中。在一些实施方案中，TIL是根据实施例D所提供的方法冷冻保存。

当适当时，将细胞自冷冻器移除并在37℃水浴中解冻，直到大约4/5的溶液解冻。将细胞大致上重悬于完全培养基中且任选地洗涤一或多次。在一些实施方案中，解冻的TIL可经计数且依本领域中已知的方式评估活力。

在一些情况下，步骤B的TIL群体可使用以下讨论的方案立即冷冻保存。替代地，本体TIL群体可进行步骤C和步骤D且接着在步骤D后冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰的TIL将用于疗法中的情况中，步骤B或步骤D的TIL群体可进行遗传修饰以用于合适治疗。

M.经扩增TIL的表型特征

在一些实施方案中，分析TIL在扩增后的许多表型标志物的表达，包括那些在本文和实施例中描述的那些。在一个实施方案中，检查一个或多个表型标志物的表达。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在步骤B的第一扩增之后分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在步骤C的转变期间分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤C的转变期间和冷冻保存之后分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤D的第二扩增之后分析。在一些实施方案中，TIL的表型特征是在根据步骤D的两次或更多次扩增之后分析。

在一些实施方案中，标志物选自由CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，检查CD8的表达。在一些实施方案中，检查CD28的表达。在一些实施方案中，CD8和/或CD28的表达在根据本发明过程产生的TIL相较于其他过程为高(例如，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的第3代过程相较于在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的2A过程)。在一些实施方案中，CD8的表达在根据本发明过程产生的TIL相较于其他过程为高(例如，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的第3代过程相较于在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的2A过程)。在一些实施方案中，CD28的表达在根据本发明过程产生的TIL相较于其他过程为高(例如，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的第3代过程相较于在例如图1(特别是例如图1A)提供的2A过程)。在一些实施方案中，高CD28表达指示较年轻、更持久的TIL表型。在一个实施方案中，测量一个或多个调控标志物的表达。

在一个实施方案中，在本文所述的用于扩增肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法中的任何步骤期间，并未进行基于CD8和/或CD28表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或经收获的TIL群体。

在一些实施方案中，中央记忆细胞的百分比在根据本发明过程产生的TIL相较于其他过程为高(例如，在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的第3代过程相较于在例如图1(特别是例如图1A)提供的2A过程)。在一些实施方案中，中央记忆细胞的记忆标志物选自由CCR7和CD62L组成的组。

在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL记忆子集可分成不同记忆子集。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含中央记忆(CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含效应记忆(EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+TIL包含RA+效应记忆/效应细胞(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施方案中，相较于CD4+群体CD8+有较高的％。

在一些实施方案中，TIL表达一种或多种选自由颗粒溶解酶B、穿孔素和颗粒溶解素组成的组的标志物。在一些实施方案中，TIL表达颗粒溶解酶B。在一些实施方案中，TIL表达穿孔素。在一些实施方案中，TIL表达颗粒溶解素。

在一个实施方案中，也可使用细胞因子释放测定评估再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施方案中，可评估TIL的干扰素γ(IFN-γ)分泌。在一些实施方案中，IFN-γ分泌通过ELISA测定测量。在一些实施方案中，IFN-γ分泌通过ELISA测定在快速第二扩增步骤之后、在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)提供的步骤D之后测量。在一些实施方案中，TIL健康通过IFN-γ分泌测量。在一些实施方案中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施方案中，采用IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种测量。IFN-γ产生可通过确定经抗CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的水平来测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ水平可使用测量IFN-γ释放来确定。在一些实施方案中，例如在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中提供的第3代过程的步骤D的TIL相较于例如在图1(特别是例如图1A)中提供的2A过程的步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，测量离体TIL的IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图1B方法)产生的TIL。

在一些实施方案中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌多至少一倍IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌多至少两倍IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌多至少三倍IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌多至少四倍IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌多至少五倍IFN-γ的TIL是通过本发明的扩增方法(包括例如图1B和/或图1C方法)产生的TIL。

T和B淋巴细胞的多样抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供用于产生展现和增加T细胞谱库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL相较于新鲜收获TIL和/或使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中体现的方法以外的方法)制备的TIL，展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL相较于新鲜收获TIL和/或使用称为过程2A的方法(如在图1(特别是例如图1A)所例示者)制备的TIL，展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，在第一扩增获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。在一些实施方案中，如本文所述的过程(例如第3代过程)相较于其他过程(例如称为第2代的过程)基于样品中独特肽CDR的数量(参见例如图12至14)显示较高的克隆多样性。

在一些实施方案中，TIL的活化和耗竭可通过检查一种或多种标志物确定。在一些实施方案中，TIL的活化和耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施方案中，活化和耗竭标志物包括但不限于一种或多种选自由CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG-3组成的组的标志物。在一些实施方案中，活化和耗竭标志物包括但不限于一种或多种选自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT和/或TIM-3组成的组的标志物。在一些实施方案中，活化和耗竭标志物包括但不限于一种或多种选自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM-3组成的组的标志物。在一些实施方案中，T细胞标志物(包括活化和耗竭标志物)可经确定和/或分析以检查T细胞活化、抑制或功能。在一些实施方案中，T细胞标志物可包括但不限于一种或多种选自由TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59组成的组的标志物。

在一些实施方案中，表型特征是在冷冻保存之后检查。

N.额外过程实施方案

在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增，其中所述引发性第一扩增进行约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至10天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至8天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至8天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至8天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5至7天。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增，其中所述引发性第一扩增进行约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至8天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至8天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至6天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至6天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至5天。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样品加工成多个肿瘤片段而获得来自从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增，其中所述引发性第一扩增进行约1至7天的第一时间段以获得第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；(c)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约1至11天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及(d)收获获自步骤(c)的所述治疗性TIL群体。在一些实施方案中，快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(1)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第二TIL群体约4天来进行快速第二扩增，接着(2)实现来自第一小规模培养中的第二TIL群体转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，从小规模培养转移至所述第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5天。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过使第一TIL群体与还包含外源性抗原呈递细胞(APC)的培养基接触来进行，其中步骤(c)的培养基的APC数量大于步骤(b)的培养基的APC数量。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，培养基补充有额外的外源性APC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约20:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约9:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约8:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约7:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约6:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约1.1:1至为或为约2:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约10:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约5:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约4:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约3:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.9:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.8:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.7:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.6:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.5:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.4:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.3:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.2:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例处于为或为约2:1至为或为约2.1:1的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例为或为约2:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数量与步骤(b)中添加的APC数量的比例为或为约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在初级第一扩增中添加的APC数量是为或为约1×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在初级第一扩增中添加的APC数量处于为或为约1×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在初级第一扩增中添加的APC数量处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在初级第一扩增中添加的APC数量处于为或为约2×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中为或为约2.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个肿瘤片段是分布至多个分开的容器中，在各所述分开的容器中，第一TIL群体在步骤(a)中获得，第二TIL群体在步骤(b)中获得且第三TIL群体在步骤(c)中获得，并且将来自步骤(c)的多个容器的TIL治疗性群体组合以产生来自步骤(d)的经收获的TIL群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个肿瘤平均分布于多个分开的容器中。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括至少两个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括二至二十个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括二至十五个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括二至十个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括二至五个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个分开的容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个分开的容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在每个容器中，引发性第一扩增在步骤(b)中在第一TIL群体上进行，步骤(c)中的快速第二扩增在相同容器中在产生自所述第一TIL群体的第二TIL群体上进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中各分开的容器包括第一气体可渗透表面区域。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个肿瘤片段分布于单一容器中。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中单一容器包括第一气体可渗透表面区域。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中，APC以为或为约一个细胞层至为或为约三个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1.5个细胞层至为或为约2.5个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约2个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3个细胞层至为或为约10个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4个细胞层至为或为约8个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的第一容器中进行，并且在步骤(c)中，快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的第二容器中进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二容器大于第一容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中，APC以为或为约一个细胞层至为或为约三个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1.5个细胞层至为或为约2.5个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约2个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修饰的如适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3个细胞层至为或为约10个细胞层的平均厚度层叠在第二气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4个细胞层至为或为约8个细胞层的平均厚度层叠在第二气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠在第二气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠在第二气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的第一容器中进行，并且在步骤(c)中，快速第二扩增在第一容器中进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中，APC以为或为约一个细胞层至为或为约三个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1.5个细胞层至为或为约2.5个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约2个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以为或为约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3个细胞层至为或为约10个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4个细胞层至为或为约8个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中，APC以为或为约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面区域上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:10的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:9的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:8的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:7的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:6的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:5的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:4的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:3的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.1至为或为约1:2的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.2至为或为约1:8的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.3至为或为约1:7的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.4至为或为约1:6的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.5至为或为约1:5的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.6至为或为约1:4的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.7至为或为约1:3.5的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.8至为或为约1:3的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:1.9至为或为约1:2.5的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例处于为或为约1:2的范围内。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，初级第一扩增通过用额外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基来进行，其中在步骤(c)中添加的APC数量是大于在步骤(b)中添加的APC数量，并且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比例选从为或为约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL的数量与第一TIL群体中的TIL的数量的比例为或为约1.5:1至为或为约100:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL的数量与第一TIL群体中的TIL的数量的比例为或为约50:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL的数量与第一TIL群体中的TIL的数量的比例为或为约25:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL的数量与第一TIL群体中的TIL的数量的比例为或为约20:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体中的TIL的数量与第一TIL群体中的TIL的数量的比例为或为约10:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体在数量上是第一TIL群体的至少或至少约50倍。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二TIL群体在数量上是第一TIL群体的至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第二时间段开始后为或为约2天或为或为约3天，细胞培养基补充额外的IL-2。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，以还包含在步骤(d)中使用冷冻保存过程将经收获的TIL群体冷冻保存的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，以包含在步骤(d)后进行将来自步骤(d)的经收获的TIL群体转移至任选地含有HypoThermosol的输注袋的额外步骤(e)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，以包含在步骤(e)中使用冷冻保存过程将包含经收获的TIL群体的输注袋冷冻保存的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中冷冻保存过程是使用1:1比例的经收获的TIL群体与冷冻保存培养基进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中抗原呈递细胞是外周血单核细胞(PBMC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中PBMC经照射且为异体的。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中添加至细胞培养的APC总数是2.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中添加至细胞培养的APC总数是5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中APC是PBMC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中PBMC经照射且为异体的。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(d)中的收获是使用基于膜的细胞加工系统进行的。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(d)中的收获是使用LOVO细胞加工系统进行的。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约5至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约10至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约15至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约20至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约25至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约30至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约35至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约40至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约45至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约50至为或为约60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括在步骤(b)中每容器为或为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个片段。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约27mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约20mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约21mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约22mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约23mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约24mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约25mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约26.5mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中每个片段具有为或为约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括为或为约30至为或为约60个片段且总体积为为或为约1300mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括为或为约50个片段且总体积为为或为约1350mm

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中多个片段包括为或为约50个片段且总质量为为或为约1克至为或为约1.5克。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中细胞培养基提供于为G容器或Xuri细胞袋的容器中。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度是约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度是约6,000IU/mL。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中冷冻保存培养基包含7％至10％DMSO。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中的第一时间段在为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第二时间段在为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中的第一时间段和在步骤(c)中的第二时间段各自单独地于为或为约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中的第一时间段和在步骤(c)中的第二时间段各自单独地于为或为约5天、6天或7天的时间段内进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中的第一时间段和在步骤(c)中的第二时间段各自单独地于为或为约7天的时间段内进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约14天至为或为约18天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约15天至为或为约18天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约16天至为或为约18天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约17天至为或为约18天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约14天至为或为约17天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约15天至为或为约17天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约16天至为或为约17天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约14天至为或为约16天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约15天至为或为约16天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约14天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约15天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约16天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约17天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约18天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约14天或更少天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约15天或更少天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约16天或更少天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约17天或更少天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)至(d)在总共为或为约18天或更少天进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(d)中收获的治疗性TIL群体包含对治疗有效剂量的TIL而言足够的TIL。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中对治疗有效剂量而言足够的TIL数量是为或为约2.3×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第三TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干扰素γ产生。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第三TIL群体相较于通过长于17天的过程所制备的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干扰素γ产生。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中的第三TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干扰素γ产生。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中获自步骤(c)第三TIL群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞相对于获自步骤(b)第二细胞群体的效应T细胞和/或中央记忆T细胞展现增加的CD8和CD28表达。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中方法中引述的每个容器为密闭容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中方法中引述的每个容器为G容器。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-10。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-100。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中方法中引述的每个容器为GREX-500。

在另一个实施方案中，本发明提供通过如上适用的任何前述段落描述的方法所制造的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)或OKT3下进行的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)下进行的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无添加的抗原呈递细胞(APC)且无添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于17天的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供从患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL提供增加的功效、增加的干扰素γ产生和/或增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的干扰素γ产生。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的多克隆性。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体提供增加的功效。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少一倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于17天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少一倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少一倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少一倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少两倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于17天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少两倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL能够能够产生多至少两倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少两倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于16天的过程所制备的TIL能够产生多至少三倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于17天的过程所制备的TIL能够产生多至少三倍的干扰素γ。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体，其中治疗性TIL群体相较于通过长于18天的过程所制备的TIL能够产生多至少三倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少三倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)下进行的过程所制备的TIL能够能够产生多至少一倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少一倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够能够产生多至少一倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少一倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的APC下进行的过程所制备的TIL能够能够产生多至少两倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少两倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够能够产生多至少两倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少两倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的APC下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少三倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少一倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗性TIL群体，所述治疗性TIL群体相较于通过其中TIL的第一扩增是在无任何添加的OKT3下进行的过程所制备的TIL能够产生多至少三倍的干扰素γ。在一些实施方案中，因为本文所述的扩增过程，举例来说如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如举例来说图1(特别是例如图1B和/或图1C)所示)，使TIL能够产生多至少三倍干扰素-γ。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中肿瘤片段是小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中肿瘤片段是核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中肿瘤片段是细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中肿瘤片段是小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中肿瘤片段是核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中(i)所述方法包括获得来自受试者的肿瘤组织的一个或多个小活检物(包括例如，穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物的第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行引发性第一扩增的步骤之前于包含IL-2的细胞培养基中进行培养第一TIL群体的步骤约3天的时间段；(iii)所述方法包括进行引发性第一扩增约8天的时间段；和(iv)所述方法包括进行快速第二扩增约11天的时间段。在一些前述实施方案中，所述方法的步骤在约22天内完成。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中(i)所述方法包括获得来自受试者的肿瘤组织的一个或多个小活检物(包括例如，穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物的第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行引发性第一扩增的步骤之前于包含IL-2的细胞培养基中进行培养第一TIL群体的步骤约3天的时间段；(iii)所述方法包括进行引发性第一扩增约8天的时间段；和(iv)所述方法包括通过培养第二TIL群体的培养达约5天、将所述培养分成至多5个继代培养且培养所述继代培养达约6天来进行快速第二扩增。在一些前述实施方案中，所述至多5个继代培养中的每一者在与第二TIL群体在快速第二扩增中开始培养的容器的大小相同或较大的容器中培养。在一些前述实施方案中，第二TIL群体的培养等分成至多5个继代培养。在一些前述实施方案中，所述方法的步骤在约22天内完成。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约20个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约10个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约20个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约10个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约20个细针抽吸物。

本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约10个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约20个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约10个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约20个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1至约10个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一TIL群体获自受试者的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中(i)所述方法包括获得来自受试者的肿瘤组织的1至约10个核心活检物的第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行引发性第一扩增的步骤之前于包含IL-2的细胞培养基中进行培养所述第一TIL群体的步骤约3天的时间段；(iii)所述方法包括通过于包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养所述第一TIL群体约8天的时间段来进行引发性第一扩增步骤以获得第二TIL群体；和(iv)所述方法包括通过于包含IL-2、OKT-3和APC的培养基中培养所述第二TIL群体约11天的时间段来进行快速第二扩增步骤。在一些前述实施方案中，所述方法的步骤在约22天内完成。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中(i)所述方法包括获得来自受试者的肿瘤组织的1至约10个核心活检物的第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行引发性第一扩增的步骤之前于包含IL-2的细胞培养基中进行培养所述第一TIL群体的步骤约3天的时间段；(iii)所述方法包括通过于包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养所述第一TIL群体约8天的时间段来进行引发性第一扩增步骤以获得第二TIL群体；和(iv)所述方法包括通过于包含IL-2、OKT-3和APC的培养基中培养所述第二TIL群体的培养约5天、将所述培养分成至多5个继代培养且于包含IL-2的培养基中培养继代培养中的每一者约6天来进行快速第二扩增。在一些前述实施方案中，所述至多5个继代培养中的每一者在与第二TIL群体在快速第二扩增中开始培养的容器的大小相同或较大的容器中培养。在一些前述实施方案中，第二TIL群体的培养等分成至多5个继代培养。在一些前述实施方案中，所述方法的步骤在约22天内完成。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中(i)所述方法包括获得来自受试者的肿瘤组织的1至约10个核心活检物的第一TIL群体；(ii)所述方法包括在进行引发性第一扩增的步骤之前于包含6000IU IL-2/ml于0.5L的CM1培养基的细胞培养基中于G-Rex 100M培养瓶中进行培养所述第一TIL群体的步骤约3天的时间段；(iii)所述方法包括通过添加含有6000IU/ml IL-2、30ng/ml OKT-3和约10

在另一个实施方案中，本发明提供一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：(a)通过培养获自供体的第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的引发性第一扩增以实现所述第一T细胞群体的生长和引发所述第一T细胞群体的活化；(b)在步骤(a)中引发的所述第一T细胞群体的活化开始衰退后，通过培养所述第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的快速第二扩增，以实现所述第一T细胞群体的生长和加强所述第一T细胞群体的活化而获得第二T细胞群体；和(c)收获所述第二T细胞群体。在另一个实施方案中，快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现从小规模培养中转移第一T细胞群体至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自第一小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约4至7天。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至2、3或4个大小比第一容器较大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速第二扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现从小规模培养中转移第一T细胞群体至比第一容器大的第二容器(例如G-REX500MCS容器)且在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约5至7天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自第一小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约5至7天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小大于第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自所述小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至7天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至2、3或4个大小大于第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自所述小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至6天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至2、3或4个大小大于第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自所述小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至2、3或4个大小大于第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自所述小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约6天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中快速扩增的步骤分成以下多个步骤以实现培养规模横向扩大和规模放大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天来进行快速第二扩增，接着(b)实现来自小规模培养中的第一T细胞群体转移和分配至2、3或4个大小大于第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，转移至所述第二容器的来自所述小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约7天。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在至多7天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增在至多8天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(b)的快速第二扩增在至多11天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在7天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在7天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在7天或8天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在7天或8天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多10天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在8天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多9天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中步骤(a)的引发性第一扩增在8天的时间段进行且步骤(b)的快速第二扩增在至多8天的时间段进行。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体在包括第一气体可渗透表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第一APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第二APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，并且其中第二APC群体大于第一APC群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体在包括第一气体可渗透表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第一APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第二APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，并且其中第二APC群体大于第一APC群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体在包括第一气体可渗透表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第一APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第二APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，并且其中第二APC群体大于第一APC群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一T细胞群体在包括第一气体可渗透表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，其中第一APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第一APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，其中第二APC群体对第一T细胞群体的供体而言是外源性的且第二APC群体层叠在第一气体可渗透表面上，并且其中第二APC群体大于第一APC群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第二APC群体中的APC的数量与第一APC群体中的APC的数量的比例是约2:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一APC群体中的APC的数量是约2.5x10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以2层APC的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以在4至8层APC范围内的平均厚度层叠在第一气体可渗透表面上。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中层叠在第一气体可渗透表面上的APC的平均层数与在步骤(a)中层叠在第一气体可渗透表面上的APC的平均层数的比例是2:1。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约2.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以为或为约2.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以处于为或为约2.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以处于为或为约3.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以处于为或为约4.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(b)中，第二APC群体以为或为约4.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约1.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约1.5×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以处于为或为约2.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(a)中，第一APC群体以为或为约2.0×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中APC是外周血单核细胞(PBMC)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中PBMC经照射且对第一T细胞群体的供体而言是外源性的。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中T细胞是骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中T细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体通过从供体的全血分离获得。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体通过从供体的单采血液成分术产物分离获得。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体通过正向或负向选择T细胞表型而从供体的全血或单采血液成分术产物分离。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中T细胞表型是CD3+和CD45+。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在进行第一T细胞群体的引发性第一扩增之前，T细胞与NK细胞分离。在另一个实施方案中，通过从第一T细胞群体移除CD3-CD56+细胞而使T细胞与第一T细胞群体中的NK细胞分离。在另一个实施方案中，CD3-CD56+细胞通过使第一T细胞群体进行细胞分选而从第一T细胞群体移除，所述细胞分选使用移除CD3-CD56+细胞级分且回收负向组分的门控策略。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增特征在于高百分比NK细胞的第一T细胞群体中的T细胞。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增特征在于高百分比CD3-CD56+细胞的第一T细胞群体中的T细胞。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增特征在于存在高数量NK细胞的肿瘤组织中的T细胞。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增特征在于高数量CD3-CD56+细胞的肿瘤组织中的T细胞。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增肿瘤组织中的T细胞，所述肿瘤组织获自患有特征在于存在高数量NK细胞的肿瘤的患者。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增肿瘤组织中的T细胞，所述肿瘤组织获自患有特征在于存在高数量CD3-CD56+细胞的肿瘤的患者。在另一个实施方案中，前述方法用于扩增肿瘤组织中的T细胞，所述肿瘤组织获自患有卵巢癌的患者。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中来自第一T细胞群体的为或为约1×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体分布在多个容器中，并且在每个容器中接种来自第一T细胞群体的为或为约1×10

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在步骤(c)中收获的第二T细胞群体是治疗性TIL群体。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的一个或多个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至20个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至10个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心针活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小活检物(包括例如穿孔活检物)、核心活检物、核心针活检物或细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的一个或多个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至20个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至10个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核心活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的一个或多个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至20个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至10个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细针抽吸物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的一个或多个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至20个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至10个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小活检物(包括例如穿孔活检物)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的一个或多个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至20个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1至10个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中第一T细胞群体获自供体的肿瘤组织的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核心针活检物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养获自受试者肿瘤的一个或多个小活检物、核心活检物或针活检物的肿瘤样品约3天，来获得和/或接受来自所述肿瘤样品的第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增在包括第一气体可渗透表面区域的容器中进行，其中所述引发性第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；(iii)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充所述第二TIL群体的所述第二细胞培养基来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中在所述快速第二扩增中添加的APC数量是步骤(ii)中添加的APC数量的至少两倍，其中所述快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体，其中所述快速第二扩增在包括第二气体可渗透表面区域的容器中进行；(iv)收获获自步骤(iii)的所述治疗性TIL群体；以及(v)将来自步骤(iv)的经收获的TIL群体转移至输注袋。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：(i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养获自受试者肿瘤的一个或多个小活检物、核心活检物或针活检物的肿瘤样品约3天，来获得和/或接受来自所述肿瘤样品的第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行引发性第一扩增以产生第二TIL群体，其中所述引发性第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得所述第二TIL群体，其中所述第二TIL群体在数量上大于所述第一TIL群体；(iii)通过使所述第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增以产生第三TIL群体，其中所述快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体是治疗性TIL群体；以及(iv)收获获自步骤(iii)的所述治疗性TIL群体。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在所述第二时间段的第5天后，将所述培养分成2个或更多个继代培养，并且各继代培养补充有额外量的所述第三培养基且培养约6天。

在另一实施方面中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在所述第二时间段的第5天后，将所述培养分成2个或更多个继代培养，并且各继代培养补充包含IL-2的第四培养基且培养约6天。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中在第二时间段的第5天后，将所述培养分成至多5个继代培养。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的方法，其中所述方法的所有步骤在约22天内完成。

在另一个实施方案中，本发明提供一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：(i)通过培养来自肿瘤样品的第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的引发性第一扩增以实现所述第一T细胞群体的生长和引发所述第一T细胞群体的活化，所述肿瘤样品获自供体肿瘤的一个或多个小活检物、核心活检物或针活检物；(ii)在步骤(a)中引发的所述第一T细胞群体的活化开始衰退后，通过培养所述第一T细胞群体来进行所述第一T细胞群体的快速第二扩增，以实现所述第一T细胞群体的生长和加强所述第一T细胞群体的活化而获得第二T细胞群体；以及(iv)收获所述第二T细胞群体。在一些实施方案中，肿瘤样品获自多个核心活检物。在一些实施方案中，所述多个核心活检物选自由2、3、4、5、6、7、8、9和10个核心活检物组成的组。

III.TIL制造方法(使用确定成分培养基的过程2A实施方案)

含有一些这些特征的示例性TIL过程(被称为过程2A)描绘于图1A和109(此种过程也描述于国际专利公布号WO/2018/182817)。

如本文中所讨论，本发明可包括关于再刺激进行冷冻保存的TIL的步骤，以增加它们的代谢活性和因此在移植至患者中之前的相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自患者样品且经操作以在移植至患者中之前扩增它们的数量。在一些实施方案中，TIL任选地可进行如下讨论的遗传操作。

在一些实施方案中，TIL可进行冷冻保存。一旦解冻后，它们也可进行再刺激以在输注至患者中之前增加它们的代谢。

在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，第一扩增(包括称为REP前的过程以及图109步骤A所示的过程)缩短至3至14天且第二扩增(包括称为REP的过程以及图109步骤B所示的过程)缩短至7至14天。在一些实施方案中，第一扩增(例如，图109步骤B所述的扩增)缩短至11天且第二扩增(例如，图109步骤D所述的扩增)缩短至11天。在一些实施方案中，如以下和实施例和图中所详细讨论的，第一扩增与第二扩增(例如，如图109步骤B和步骤D所描述的扩增)的组合缩短为22天。

以下的“步骤”代号A、B、C等参照图109且参照本文所述的某些实施方案。以下和图109中的步骤顺序为示例性且步骤的任何组合或顺序以及额外步骤、重复步骤和/或步骤省略都在本申请和在本文中公开的方法考虑。

A.步骤A：获得患者肿瘤样品

一般来说，TIL最初获自患者肿瘤样品(“原代TIL”)且接着扩增成较大群体以进行如本文中描述的进一步操作，任选地冷冻保存、如本文概述的再刺激和任选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指标。

患者肿瘤样品可使用本领域中已知的方法获得，通常经由手术切除、针吸活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样品的手段。一般来说，肿瘤样品可来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵入性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可为液体肿瘤，诸如获自血液恶性肿瘤的肿瘤。实体瘤可为任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方案中，有用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高水平的TIL。

术语“实体瘤”是指组织的异常团块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可为良性或恶性。术语“实体瘤癌症”是指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、癌(carcinoma)和淋巴瘤，诸如肺癌、乳腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。

术语“血液恶性肿瘤”是指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”是指影响B细胞的血液恶性肿瘤。

一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器分割片段化成介于1至约8mm

一般来说，将收获的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。

在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，片段化是物理片段化。在一些实施方案中，片段化是分割。在一些实施方案中，片段化通过消化。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶催化性肿瘤消化物和肿瘤片段培养。在一个实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶催化性肿瘤消化物和肿瘤片段培养。

在一些实施方案中，当肿瘤是实体瘤时，在例如(如图109中提供的)步骤A中获得肿瘤样品后，肿瘤进行物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化发生在获得肿瘤之后且不进行任何冷冻保存。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将10、20、30、40或更多个片段或片放入每个容器进行第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将30或40个片段或片放入每个容器进行第一扩增。在一些实施方案中，将肿瘤片段化并将40个片段或片放入每个容器进行第一扩增。在一些实施方案中，多个片段包括约4至约50个片段，其中每个片段具有约27mm

在一些实施方案中，TIL获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤片段介于约1mm

在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在例如但不限于RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶的酶培养基中孵育，随后机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,CA)而产生肿瘤消化物。在将肿瘤放入酶培养基后，可将肿瘤机械解离大约1分钟。接着可将溶液在37℃下在5％CO

在一些实施方案中，将第一扩增步骤之前收获的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。

在一些实施方案中，细胞可在样品收获后任选地冷冻且在进入步骤B描述的扩增之前冷冻储存，所述步骤B在以下进一步详细描述且在图109中例示。

B.步骤B：第一扩增

1.年轻TIL

在一些实施方案中，本方法提供获得年轻TIL，所述年轻TIL在施用至受试者/患者后能够增加复制循环且因此相较于较老TIL(即在施用至受试者/患者之前已进一步进行更多次复制的TIL)可能提供额外治疗好处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia,等人,Scandinavian Journal of Immunology,75:157–167(2012)；Dudley等人,Clin CancerRes,16:6122-6131(2010)；Huang等人,J Immunother,28(3):258–267(2005)；Besser等人,Clin Cancer Res,19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人,J Immunother 32:415–423(2009)；Robbins,等人,J Immunol2004；173:7125-7130；Shen等人,J Immunother,30:123–129(2007)；Zhou,等人,J Immunother,28:53–62(2005)；以及Tran,等人,J Immunother,31:742–751(2008)，所述文献都以引用的方式并入本文中。

T和B淋巴细胞的多样抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供用于产生展现和增加T细胞谱库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL相较于新鲜收获TIL和/或使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图109中体现的方法以外的方法)制备的TIL，展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，在第一扩增获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。

在例如诸如图109步骤A所述的分割或消化肿瘤片段之后，将所得细胞在有利TIL但不利肿瘤及其他细胞生长的条件下于含有IL-2的血清中培养。在一些实施方案中，将肿瘤消化物孵育于2mL孔中的包含去活化人AB血清和6000IU/mL IL-2的培养基中。将此原代细胞群体培养数天的时间段(通常3至14天)，产生通常约1×10

在一个优选的实施方案中，TIL的扩增可使用如以下和本文所述的初始本体TIL扩增步骤(例如诸如那些图109步骤B中所述者，其可包括称为REP前的过程)进行，随后进行如以下步骤D和本文所述的第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行任选的冷冻保存，和随后进行如以下和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可如本文所述的任选地以表型特征和代谢参数鉴定。

在TIL培养起始于24孔板(例如使用Costar 24孔平底细胞培养板(CorningIncorporated,Corning,NY))的实施方案中，各孔可接种1×10

在一些实施方案中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在培养起始于具有40mL容量和10cm

在制备肿瘤片段后，将所得细胞(即片段)在有利TIL但不利肿瘤及其他细胞生长的条件下培养于含有IL-2的血清中。在一些实施方案中，将肿瘤消化物孵育于2mL孔中的包含去活化人AB血清(或在一些如本文概述的情况下，在aAPC细胞群体存在下)和6000IU/mLIL-2的培养基中。将此原代细胞群体培养数天时间段(通常10至14天)，产生通常约1×10

在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。

在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第一扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。

在一些实施方案中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在培养起始于具有40mL容量和10cm

在一些实施方案中，第一扩增(包括诸如例如那些在图109步骤B所述的过程，其可包括那些有时称为REP前者)过程缩短至3至14天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，第一扩增(包括诸如例如那些在图109步骤B所述的过程，其可包括那些有时称为REP前者)过程缩短至7至14天，如实施例中所讨论且显示于图4和5，以及包括例如图109步骤B所述的扩增。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短至10至14天，如实施例中所讨论且显示于图4和5。在一些实施方案中，第一扩增缩短至11天，以及包括例如图109步骤B所述的扩增中所讨论。

在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天。

在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可被包括在第一扩增期间，包括例如在根据图109步骤B过程期间以及如本文所述者。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可被包括在根据图109步骤B过程期间以及如本文所述者。

在一些实施方案中，第一扩增(包括称为REP前的过程；例如根据图109的步骤B)过程缩短至3至14天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短至7至14天，如实施例中所讨论且显示于图4和5。在一些实施方案中，步骤B的第一扩增缩短至10至14天，如实施例中所讨论且显示于图4、5和27。在一些实施方案中，第一扩增缩短至11天。

在一些实施方案中，第一扩增(例如根据图109的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。

C.步骤C：第一扩增至第二扩增的转变

在一些情况下，获自第一扩增的本体TIL群体包括例如获自例如图109所示的步骤B的TIL群体可使用本文以下讨论的方案立即冷冻保存。替代地，获自第一扩增的TIL群体(称为第二TIL群体)可进行第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增)且接着如以下讨论进行冷冻保存。类似地，在其中遗传修饰的TIL将用于疗法中的情况中，第一TIL群体(有时称为本体TIL群体)或第二TIL群体(其在一些实施方案中可包括称为REP TIL群体的群体)可在扩增之前或在第一扩增之后且在第二扩增之前进行遗传修饰以用于合适治疗。

在一些实施方案中，获自第一扩增(例如图109所示的步骤B)的TIL进行储存直到为了选择而测定表型。在一些实施方案中，获自第一扩增(例如图109所示的步骤B)的TIL不进行储存且直接进行第二扩增。在一些实施方案中，获自第一扩增的TIL在第一扩增之后且在第二扩增之前不进行冷冻保存。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约3天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约4天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约4天至10天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约7天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的约14天。

在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的3天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的4天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的5天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的6天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的7天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的8天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的9天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的10天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的11天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的12天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的13天至14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的14天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的1天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的2天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的3天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的4天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的5天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的6天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的7天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的8天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的9天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的10天至11天。在一些实施方案中，从第一扩增转变至第二扩增发生在当片段化发生后的11天。

在一些实施方案中，TIL在第一扩增之后且在第二扩增之前不进行储存，并且TIL直接进行第二扩增(例如在一些实施方案中，在如图109所示的从步骤B至步骤D的转变期间并不进行储存)。在一些实施方案中，转变在如本文所述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二扩增而无转变期。

在一些实施方案中，从第一扩增至第二扩增的转变(例如根据图109的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。

在一些实施方案中，在本文中公开的扩增过程中使用的培养基是无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是用于预防和/或降低部分因为含有血清培养基的批次变异所致的实验变异。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于一种或多种CTS

在一些实施方案中，CTS

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)是总无血清或确定成分培养基体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，国际PCT专利公布号WO/1998/030679(其以引用的方式并入本文中)描述的确定成分培养基可用于本发明。在所述公布，描述无血清真核细胞培养基。无血清、真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含以下或通过组合一种或多种选自以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定成分培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白替代品和一种或多种选自以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，确定成分培养基中的甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度是约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度是约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度是约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度是约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度是约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度是约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度是约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度是约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度是约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度是约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度是约5至500mg/L，硫胺素的浓度是约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度是约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度是约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度是约1至50mg/L，胰岛素的浓度是约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度是约0.000001至0.0001mg/L且白蛋白(例如

在一些实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基的优选实施方案”的栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定成分培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂的优选实施方案”的栏中列出的种类和浓度的非微量部分成分。

表A：非微量元素部分成分的浓度

在一些实施方案中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，Smith,等人,“Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement,”Clin Transl Immunology,4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定成分培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTS

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

D.步骤D：第二扩增

在一些实施方案中，TIL细胞群体在收获和初始本体加工(例如图109所示的步骤A和步骤B)和转变(称为步骤C)之后在数量上扩增。此进一步扩增在本文中称为第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP；如图109步骤D所示的过程)的扩增过程。第二扩增通常使用包含一些组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在气体可渗透容器中完成。

在一些实施方案中，TIL的第二扩增或第二TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图109步骤D所示的过程)可使用任何本领域中的技术人员所知的TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方案中，第二TIL扩增可进行约14天。

在一个实施方案中，第二扩增可在气体可渗透容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图109步骤D所示的过程)进行。例如，TIL可在白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增。非特异性T细胞受体刺激可包括例如抗CD3抗体诸如约30ng/ml的OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)或UHCT-1(可购自BioLegend,San Diego,CA,USA)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括它们的抗原性部分诸如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原任选地在T细胞生长因子诸如300IU/mL IL-2或IL-15存在下任选地从载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合适抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或它们的抗原性部分。TIL也可通过用脉冲至HLA-A2表达性抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激来快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激发生为第二扩增的一部分。在一些实施方案中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下发生。

在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于1000与2000IU/mL之间、介于2000与3000IU/mL之间、介于3000与4000IU/mL之间、介于4000与5000IU/mL之间、介于5000与6000IU/mL之间、介于6000与7000IU/mL之间、介于7000与8000IU/mL之间或介于8000IU/mL的IL-2。

在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含介于0.1ng/mL与1ng/mL之间、介于1ng/mL与5ng/mL之间、介于5ng/mL与10ng/mL之间、介于10ng/mL与20ng/mL之间、介于20ng/mL与30ng/mL之间、介于30ng/mL与40ng/mL之间、介于40ng/mL与50ng/mL之间和介于50ng/mL与100ng/mL之间的OKT3抗体。

在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及任何它们的组合可被包括在第二扩增期间，包括例如在根据图109步骤D过程期间以及如本文所述者。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及任何它们的组合可被包括在根据图109步骤D过程期间以及如本文所述者。

在一些实施方案中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞的经补充的细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二扩增在经补充的细胞培养基中发生。在一些实施方案中，经补充的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。

在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。

在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，第二扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基还包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC和/或抗原呈递细胞的比例是约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC的比例介于1至50和1至300之间。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL对PBMC的比例介于1至100和1至200之间。

在一个实施方案中，REP和/或第二扩增在培养瓶中进行，其中本体TIL与100或200倍过量的去活化饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合。置换培养基(通常经由抽吸新鲜培养基置换2/3培养基)直到细胞转移至替代性生长室。替代性生长室包括G-REX培养瓶和如以下更完整讨论的气体可渗透容器。

在一些实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)缩短至7至14天，如实施例和图中所讨论。在一些实施方案中，第二扩增缩短至11天。

在一个实施方案中，REP和/或第二扩增可使用T-175培养瓶和如先前描述的气体可渗透袋(Tran,等人,J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley,等人,J.Immunother.2003,26,332-42)或气体可渗透培养器皿(G-Rex培养瓶)进行。在一些实施方案中，第二扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175培养瓶中进行，并且可将悬浮于150mL的培养基中的约1x10

在一个实施方案中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及那些于图109步骤D中指称者)可在500mL容量的具有100cm气体可渗透硅底的气体可渗透培养瓶(G-Rex 100，可购自Wilson Wolf Manufacturing Corporation,New Brighton,MN,USA)中进行，5×10

在一个实施方案中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在培养瓶中进行，其中本体TIL与100或200倍过量的去活化饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合。在一些实施方案中，进行置换培养基直到细胞转移至替代性生长室。在一些实施方案中，通过抽吸新鲜培养基置换掉2/3的培养基。在一些实施方案中，替代性生长室包括G-REX培养瓶和如以下更完整讨论的气体可渗透容器。

在一个实施方案中，第二扩增(包括称为REP的扩增)经进行且还包含其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用任何本领域中已知的选择方法。例如，美国专利申请公布号2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)所述的方法可用于选择优异肿瘤反应性的TIL。

任选地，在第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后可使用本领域中已知的标准测定进行细胞活力测定。例如，可在本体TIL的样品上进行台盼蓝排除测定，其选择性地标记死亡细胞且允许活力评估。在一些实施方案中，TIL样品可使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)计算和确定活力。在一些实施方案中，活力是根据例如实施例15所述的细胞计数器K2 Image Cytometer自动细胞计数器方案确定。

在一些实施方案中，TIL的第二扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前描述的T-175培养瓶和气体可渗透袋(Tran KQ,Zhou J,Durflinger KH,等人,2008,J Immunother.,31:742–751，和Dudley ME,Wunderlich JR,Shelton TE,等人2003,J Immunother.,26:332–342)或气体可渗透G-Rex培养瓶进行。在一些实施方案中，第二扩增使用培养瓶进行。在一些实施方案中，第二扩增使用气体可渗透G-Rex培养瓶进行。在一些实施方案中，第二扩增在T-175培养瓶中进行，并且约1x10

在一些实施方案中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在500mL容量的具有100cm

T和B淋巴细胞的多样抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(联结区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供用于产生展现和增加T细胞谱库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，在第二扩增获得的TIL展现增加的T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。

在一些实施方案中，第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更详细讨论的抗原呈递饲养细胞(APC)。

在一些实施方案中，第二扩增(例如根据图109的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。

在一些实施方案中，在本文中公开的扩增过程中使用的培养基是无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是用于预防和/或降低部分因为含有血清培养基的批次变异所致的实验变异。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于一种或多种CTS

在一些实施方案中，CTS

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)是总无血清或确定成分培养基体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，国际PCT专利公布号WO/1998/030679(其以引用的方式并入本文中)描述的确定成分培养基可用于本发明。在所述公布，描述无血清真核细胞培养基。无血清、真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含以下或通过组合一种或多种选自以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定成分培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白替代品和一种或多种选自以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，确定成分培养基中的甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度是约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度是约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度是约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度是约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度是约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度是约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度是约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度是约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度是约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度是约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度是约5至500mg/L，硫胺素的浓度是约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度是约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度是约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度是约1至50mg/L，胰岛素的浓度是约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度是约0.000001至0.0001mg/L且白蛋白(例如

在一些实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基的优选实施方案”的栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定成分培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂的优选实施方案”的栏中列出的种类和浓度的非微量部分成分。

表A：非微量元素部分成分的浓度

在一些实施方案中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，Smith,等人,“Ex vivo expansion of

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

1.饲养细胞和抗原呈递细胞

在一个实施方案中，本文所述的第二扩增程序(例如包括诸如那些图109步骤D所述以及那些称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且如实施例(特别是实施例14)所述用于REP程序，其提供用于评估照射同种异体PBMC的复制不能的示例性方案。

在一些实施方案中，如果第14天存活细胞总数小于在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量，则认为PBMC是复制不能且接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。参见例如实施例14。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的存活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。参见例如实施例13。

在一些实施方案中，如果在OKT3和IL-2存在下培养第7天和第14天的存活细胞总数并未从在REP第0天和/或第二扩增第0天(即第二扩增的起始日)放入培养中的初始存活细胞数量增加，则认为PBMC是复制不能且接受其用于本文所述的TIL扩增程序中。在一些实施方案中，PBMC在5至60ng/ml OKT3抗体和1000至6000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10至50ng/ml OKT3抗体和2000至5000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20至40ng/ml OKT3抗体和2000至4000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25至35ng/ml OKT3抗体和2500至3500IU/ml IL-2存在下培养。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例是约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至50和1至300之间。在一个实施方案中，在第二扩增中TIL对抗原呈递饲养细胞的比例介于1至100和1至200之间。

在一个实施方案中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5x10

在一个实施方案中，本文所述的第二扩增程序在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法诸如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。

一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理去活化，并且用于本文所述的TIL扩增程序。

在一个实施方案中，在第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来置换PBMC或与PBMC组合使用。

2.细胞因子

本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所知。

替代地，使用细胞因子的组合以进行TIL的快速扩增和或第二扩增是额外可能的，如同总体上在国际专利公布号WO 2015/189356和W国际专利公布号WO 2015/189357中概述的两种或更多种IL-2、IL-15和IL-21的组合，特此明确地以引用的方式整体并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞的产生，并且特别是如其中所述的T细胞。

3.抗CD3抗体

在一些实施方案中，用于本文所述的扩增方法(包括那些称为REP者，参见例如图109)中的培养基也包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合诱导TIL群体中的T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab’)2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,J.Immunol.1985,135,1719，特此以引用的方式整体并入本文中。

本领域中的技术人员将会理解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在特定实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体(可购自Ortho-McNeil,Raritan,NJ或Miltenyi Biotech,Auburn,CA)。

E.步骤E：收获TILS

在第二扩增步骤之后，可收获细胞。在一些实施方案中，在例如图109所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方案中，在例如图109所提供的两个扩增步骤之后收获TIL。

TIL可以任何适当且无菌的方式收获，包括例如离心。用于收获TIL的方法是本领域中熟知的且本过程可采用任何此类已知的方法。在一些实施方案中，使用自动化系统收获TIL。

细胞收获器和/或细胞加工系统可购自多个来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。本方法可采用任何基于细胞的收获器。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞加工系统是基于膜的细胞收获器。在一些实施方案中，细胞收获是经由细胞加工系统诸如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞加工系统”也指由任何供货商制造的任何可将包含细胞的溶液泵送通过无菌和/或密闭系统环境中的膜或过滤器诸如旋转膜或旋转过滤器的仪器或装置，允许连续流动和细胞加工以在无需团块化下移除上清液或细胞培养基。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞加工系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞加工步骤。

在一些实施方案中，收获(例如根据图109的步骤E)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器是例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器是单一生物反应器。

F.步骤F：最终制剂/转移至输注袋

在如图109以示例性顺序提供且如以上和本文详细概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器以用于施用至患者。在一些实施方案中，一旦使用上述的扩增方法获得治疗足够数量的TIL后，将它们转移至容器以用于施用至患者。

在一个实施方案中，使用本公开的APC扩增的TIL作为药物组合物施用至患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲剂中的悬浮液。本公开的使用PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，T细胞作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内。

1.药物组合物、剂量和给药方案

在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL作为药物组合物施用至患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲剂中的悬浮液。本公开的使用PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，T细胞作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。

可施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×10

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数量是约1×10

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度是小于例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的药物组合物的范围内。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的药物组合物的范围内。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。

提供于本发明的药物组合物中的TIL在宽广剂量范围内有效。确切剂量将取决于施用途径、化合物的施用形式、待治疗的受试者的性别和年龄、待治疗的受试者的体重和主治医师的偏好和经验。如果适当也可使用TIL的临床建立剂量。使用在本文中的方法所施用的药物组合物的量(诸如TIL的剂量)将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病况的严重性、施用速率、活性药物成分的体内配置(disposition)和处方医师的考虑。

在一些实施方案中，TIL可以单一剂量施用。所述施用可为注射，例如静脉注射。在一些实施方案中，TIL可以多个剂量施用。给药可为每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可为一个月一次、每二周一次、每周一次或每两天一次。TIL的施用可根据需要持续进行。

在一些实施方案中，TIL的有效剂量是约1×10

在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。

在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。

有效量的TIL可以单一或多个剂量经由任何具有类似效用的可接受的剂施用模式施用，包括鼻内和经皮途径、经由动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、局部、经由移植或经由吸入。

IV.药物组合物、剂量和给药方案

在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL作为药物组合物施用至患者。在一个实施方案中，药物组合物是TIL于无菌缓冲剂中的悬浮液。本公开的使用PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，T细胞作为单一动脉内或静脉内输注施用，其优选地持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。

可施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×10

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数量是约1×10

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度是小于例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的药物组合物的范围内。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的药物组合物的范围内。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。

在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。

提供于本发明的药物组合物中的TIL在宽广剂量范围内有效。确切剂量将取决于施用途径、化合物的施用形式、待治疗的受试者的性别和年龄、待治疗的受试者的体重和主治医师的偏好和经验。如果适当也可使用TIL的临床建立剂量。使用在本文中的方法所施用的药物组合物的量(诸如TIL的剂量)将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病况的严重性、施用速率、活性药物成分的处置和处方医师的考虑。

在一些实施方案中，TIL可以单一剂量施用。所述施用可为注射，例如静脉注射。在一些实施方案中，TIL可以多个剂量施用。给药可为每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可为一个月一次、每二周一次、每周一次或每两天一次。TIL的施用可根据需要持续进行。

在一些实施方案中，TIL的有效剂量是约1×10

在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。

在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。

有效量的TIL可以单一或多个剂量经由任何具有类似效用的可接受的剂施用模式施用，包括鼻内和经皮途径、经由动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、局部、经由移植或经由吸入。

在另一个实施方案中，本发明提供包含如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体的输注袋。

在另一个实施方案中，本发明提供包含如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体和药学上可接受的载剂的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供包含如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物的输注袋。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体的冷冻保存制剂。

在另一个实施方案中，本发明提供包含如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体和冷冻保存培养基的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有DMSO。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有7％至10％DMSO。

在一些实施方案中，本发明提供包含于无血清培养基或确定成分培养基中的TIL的TIL组合物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是用于预防和/或降低部分因为含有血清培养基的批次变异所致的实验变异。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTS

在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于一种或多种CTS

在一些实施方案中，CTS

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)是总无血清或确定成分培养基体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度是无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。

在一些实施方案中，无血清或确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，确定成分培养基是CTS

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即

在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。

在一些实施方案中，国际PCT专利公布号WO/1998/030679(其以引用的方式并入本文中)描述的确定成分培养基可用于本发明。在所述公布，描述无血清真核细胞培养基。无血清、真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含以下或通过组合一种或多种选自以下组成的组的成分而获得：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体、一种或多种微量元素和一种或多种抗生素。在一些实施方案中，确定成分培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白替代品和一种或多种选自以下组成的组的成分：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种胶原蛋白前体和一种或多种微量元素。在一些实施方案中，确定成分培养基包含白蛋白和一种或多种选自由以下组成的组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag

在一些实施方案中，确定成分培养基中的甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度是约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度是约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度是约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度是约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度是约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度是约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度是约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度是约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度是约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度是约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度是约5至500mg/L，硫胺素的浓度是约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度是约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度是约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度是约1至50mg/L，胰岛素的浓度是约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度是约0.000001至0.0001mg/L且白蛋白(例如

在一些实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”的栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基的优选实施方案”的栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，确定成分培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂的优选实施方案”的栏中列出的种类和浓度的非微量部分成分。

表A：非微量元素部分成分的浓度

在一些实施方案中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度约2mM)、一种或多种抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度约100μM)。

在一些实施方案中，Smith,等人,“Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement,”Clin Transl Immunology,4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定成分培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTS

在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤细胞培养基可简化扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方案中，在第一气体可渗透容器和/或第二气体可渗透容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物的冷冻保存制剂。

V.治疗患者的方法

治疗方法始于初始TIL收集和培养TIL。此类方法都已在本领域中进行了描述，例如Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35(3):283-292描述，其以引用的方式整体并入本文中。治疗方法的实施方案描述于以下所有章节，包括实施例。

根据本文所述的方法包括例如以上步骤A至F所述或根据以上步骤A至F(也如例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)所述)产生的经扩增的TIL有治疗癌症患者的具体用途(例如Goff,等人,J.Clinical Oncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容所述；其以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，TIL是如先前描述生长自转移性黑色素瘤的经切除的保藏物(参见Dudley,等人,J Immunother.,2003,26:332-342；其以引用的方式整体并入本文中)。新鲜肿瘤可在无菌条件下分割。可收集代表性样品进行正式病理分析。可使用2mm

在一些实施方案中，可对成功生长的TIL可进行取样以进行表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)且当可用时针对自体肿瘤进行测试。如果过夜共培养产生干扰素-γ(IFN-γ)的水平＞200pg/mL且为背景的两倍，则TIL可被视为反应性。(Goff,等人,J Immunother.,2010,33:840-847；其以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，可选择具有自体反应性或足够生长模式证据的培养物进行第二扩增(例如根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D提供的第二扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在第二扩增期间高增生)的扩增TIL进行额外第二扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D提供的第二扩增期间的高增生)的TIL进行根据图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤D的额外第二扩增。

在一些实施方案中，患者并不直接移入ACT(过继性细胞转移)，例如，在一些实施方案中，不立即利用在肿瘤收获和/或第一扩增后的细胞。在一些实施方案中，TIL可进行冷冻保存且在施用至患者之前2天解冻。在一些实施方案中，TIL可进行冷冻保存且在施用至患者之前1天解冻。在一些实施方案中，TIL可进行冷冻保存且在施用至患者之前立即解冻。

进行冷冻保存的输注袋TIL样品的细胞表型可通过流式细胞术(例如FlowJo)分析表面标志物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA(BD BioSciences)，以及通过本文所述的任何方法分析。可使用标准酶联免疫吸附测定技术测量血清细胞因子。血清IFN-g上升可定义为＞100pg/mL且高于血清IFN-g的基线水平至少4倍或至少3倍或至少2倍或至少1倍。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞1000pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞200pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞250pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞300pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞350pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞400pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞450pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞500pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞550pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞600pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞650pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞700pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞750pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞800pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞850pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞900pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞950pg/mL。在一些实施方案中，血清IFN-g上升定义为＞1000pg/mL。

在一些实施方案中，通过本文提供的方法(例如在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中例示的那些)产生的TIL提供TIL临床功效的意外改善。在一些实施方案中，通过本文提供的方法(例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示者)产生的TIL相较于通过除那些在本文中描述的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示的方法以外的方法)产生的TIL展现增加的临床功效。在一些实施方案中，除那些在本文中描述的方法以外的方法包括称为过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方案中，增加的功效通过DCR、ORR和/或其他临床应答测量。在一些实施方案中，通过本文提供的方法(例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示者)产生的TIL相较于通过除那些在本文中描述的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示的方法以外的方法，例如第1代过程)产生的TIL展现类似的应答时间(time to response)和安全性特征。

在一些实施方案中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种测量。IFN-γ产生可通过确定用通过本发明的方法(包括例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ的水平来测量。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示用通过本发明的方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明的方法(包括例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明的方法(包括例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明的方法(包括例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中测量。

在一些实施方案中，通过本发明的方法(包括那些在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL相较于通过其他方法(包括那些非在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示的方法，诸如例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可表示关于施用通过本发明的方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。

功效的测量可包括疾病控制率(DCR)以及总体应答率(ORR)，如本领域中已知的和本文中所述。

1.治疗癌症及其他疾病的方法

本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方案中，它们用于治疗过度增生性病症。它们也可用于治疗其他如本文和以下段落所述的病症。

在一些实施方案中，过度增生性病症是癌症。在一些实施方案中，过度增生性病症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，实体瘤癌症选自由以下组成的组：成胶质细胞瘤(GBM)、胃肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，过度增生性病症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，实体瘤癌选自由以下组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症是高突变(hypermutated)癌症表型。高突变癌症是广泛描述于Campbell,等人(Cell,171:1042-1056(2017)；其出于所有目的以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)介于9与10个之间的突变。在一些实施方案中，小儿高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)9.91个突变。在一些实施方案中，成人高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)9个突变。在一些实施方案中，增强的高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)介于10与100个之间的突变。在一些实施方案中，增强的小儿高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)介于10与100个之间的突变。在一些实施方案中，增强的成人高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)介于10与100个之间的突变。在一些实施方案中，超高突变(ultra-hypermutated)肿瘤包含每百万碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，小儿超高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，成人超高突变肿瘤包含每百万碱基(Mb)大于100个突变。

在一些实施方案中，高突变肿瘤在复制修复途径中具有突变。在一些实施方案中，高突变肿瘤在与DNA聚合酶有关的复制修复中具有突变。在一些实施方案中，高突变肿瘤具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，超高突变肿瘤在与DNA聚合酶有关的复制修复中具有突变且具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，肿瘤的高突变与对免疫检查点抑制剂的应答有关。在一些实施方案中，高突变肿瘤对免疫检查点抑制剂治疗具有抗性。在一些实施方案中，高突变肿瘤可使用本发明的TIL治疗。在一些实施方案中，肿瘤的高突变由环境因素(外在暴露)造成。例如，UV光可为恶性黑色素瘤的高数量突变的主因(参见例如，Pfeifer,G.P.,You,Y.H.,and Besaratinia,A.(2005).Mutat.Res.571,19–31.；Sage,E.(1993).Photochem.Photobiol.57,163–174.)。在一些实施方案中，以肺和喉肿瘤来说，肿瘤的高突变可由香烟烟雾中大于60种致癌物造成，以及其他肿瘤因直接致突变原暴露所致(参见例如Pleasance,E.D.,Stephens,P.J.,O’Meara,S.,McBride,D.J.,Meynert,A.,Jones,D.,Lin,M.L.,Beare,D.,Lau,K.W.,Greenman,C.,等人(2010).Nature 463,184–190)。在一些实施方案中，肿瘤的高突变由载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样(APOBEC)家族成员失调造成，其已显示在多种癌症导致增加水平的C至T转变(参见例如Roberts,S.A.,Lawrence,M.S.,Klimczak,L.J.,Grimm,S.A.,Fargo,D.,Stojanov,P.,Kiezun,A.,Kryukov,G.V.,Carter,S.L.,Saksena,G.,等人(2013).Nat.Genet.45,970–976)。在一些实施方案中，肿瘤的高突变由破坏校正(proofreading)的突变所致的缺陷性DNA复制修复造成，校正由主要复制酶Pol3和Pold1进行。在一些实施方案中，肿瘤的高突变由DNA错配修复的缺陷造成，其与结肠直肠癌、子宫内膜癌症及其他癌症的高突变相关(参见例如Kandoth,C.,Schultz,N.,Cherniack,A.D.,Akbani,R.,Liu,Y.,Shen,H.,Robertson,A.G.,Pashtan,I.,Shen,R.,Benz,C.C.,等人；(2013).Nature 497,67–73.；Muzny,D.M.,Bainbridge,M.N.,Chang,K.,Dinh,H.H.,Drummond,J.A.,Fowler,G.,Kovar,C.L.,Lewis,L.R.,Morgan,M.B.,Newsham,I.F.,等人；(2012).Nature 487,330-337)。在一些实施方案中，DNA复制修复突变也见于癌症易感性综合征(cancer predisposition syndrome)，诸如体质性或双等位错配修复缺陷(CMMRD)、Lynch氏综合征和聚合酶校正相关息肉症(PPAP)。

在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症是高突变癌症。在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症是增强的高突变癌症。在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症是超高突变癌症。

在一个实施方案中，本发明包括用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在根据本公开输注TIL之前先经非清髓性化学疗法治疗。在一个实施方案中，非清髓性化学疗法是环磷酰胺60mg/kg/d共2天(TIL输注之前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m

在本文中描述的化合物和化合物的组合在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症的功效可使用各种本领域中已知的模型测试，所述模型提供人疾病治疗的指南。例如，用于确定卵巢癌治疗功效的模型描述于例如Mullany,等人,Endocrinology 2012,153,1585-92；和Fong,等人,J.Ovarian Res.2009,2,12中。用于确定胰腺癌治疗功效的模型描述于Herreros-Villanueva,等人,World J.Gastroenterol.2012,18,1286-1294中。用于确定乳腺癌治疗功效的模型描述于例如Fantozzi,Breast Cancer Res.2006,8,212中。用于确定黑色素瘤治疗功效的模型描述于例如Damsky,等人,Pigment Cell&Melanoma Res.2010,23,853–859中。用于确定肺癌治疗功效的模型描述于例如,Meuwissen,等人,Genes&Development,2005,19,643-664中。用于确定肺癌治疗功效的模型描述于例如,Kim,Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009,2,55-60；和Sano,Head Neck Oncol.2009,1,32。

在一些实施方案中，IFN-γ指示过度增生性病症治疗的治疗功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种测量。IFN-γ产生可通过确定用通过本发明的方法(包括例如那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液中的细胞因子IFN-γ的水平来测量。在一些实施方案中，通过本方法获得的TIL提供用本方法的TIL治疗的受试者相较于用使用称为第3代过程(如图1(特别是例如图1B和/或图1C)和本说明书中各处例示)的方法所制备的TIL治疗的受试者的血液中增加的IFN-γ。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示用通过本发明的方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，IFN-γ是使用Quantikine ELISA试剂盒测量。在一些实施方案中，IFN-γ在来自用通过本发明的方法产生的TIL治疗的患者的离体TIL中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明的方法产生的TIL治疗的患者的血液中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明的方法产生的TIL治疗的患者的血清中测量。

在一些实施方案中，通过本发明的方法(包括那些在例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)中描述的方法)制备的TIL相较于通过其他方法(包括那些非在图1(特别是例如图1B和/或图1C)例示的方法，诸如例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性表示治疗功效和/或增加癌症治疗的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞谱库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可表示关于施用通过本发明的方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用其他在本文中提供的方法以外的方法(包括例如除那些在图1(特别是例如图1B和/或图1C)体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。

2.共同施用方法

在一些实施方案中，如本文所述产生的TIL(包括例如源自图1(特别是例如图1B和/或图1C)的步骤A至F所述的方法的TIL)可与一种或多种免疫检查点调节剂(诸如以下描述的抗体)组合施用。例如，靶向PD-1且可与本发明的TIL共同施用的抗体包括例如但不限于纳武单抗(BMS-936558,Bristol-Myers Squibb；

3.任选的患者淋巴细胞耗尽前调理

在一个实施方案中，本发明包括用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在根据本公开输注TIL之前先经非清髓性化学疗法治疗。在一个实施方案中，本发明包括用于治疗已先经非清髓性化学疗法治疗的患者的癌症的TIL群体。在一个实施方案中，TIL群体用于输注施用。在一个实施方案中，非清髓性化学疗法是环磷酰胺60mg/kg/d共2天(TIL输注之前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m

实验发现表示在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，通过清除调控性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子槽”)进行淋巴细胞耗尽扮演增强治疗功效的关键角色。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前，对患者进行淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调理”)。

一般来说，淋巴细胞耗尽是使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)及其组合的施用实现。此类方法描述于Gassner,等人,Cancer Immunol.Immunother.2011,60,75–85,Muranski,等人,Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668–681,Dudley,等人,J.Clin.Oncol.2008,26,5233-5239,和Dudley,等人,J.Clin.Oncol.2005,23,2346–2357中，所有都以引用的方式整体并入本文中。

在一些实施方案中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。

在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/mL至10μg/mL的浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得1μg/mL的浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，环磷酰胺以100mg/m

在一些实施方案中，淋巴细胞耗尽通过一起施用氟达拉滨和环磷酰胺至患者进行。在一些实施方案中，氟达拉滨以25mg/m

在一个实施方案中，淋巴细胞耗尽通过施用环磷酰胺且剂量为60mg/m

4.IL-2方案

在一个实施方案中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中高剂量IL-2方案包括静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体，始于施用治疗有效部分的治疗性TIL群体之后当天，其中阿地白介素或其生物类似物或变体以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者身体质量)的剂量每八小时使用15分钟静脉推注施用直到耐受为止，最多14剂。在休息9天之后，可重复此时程再施用14剂，最多总共28剂。

在一个实施方案中，IL-2方案包括渐减IL-2方案。渐减IL-2方案已描述于O’Day,等人,J.Clin.Oncol.1999,17,2752-61和Eton,等人,Cancer 2000,88,1703-9，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，渐减IL-2方案包括在6小时内静脉内施用18×10

在一个实施方案中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。

5.过继性细胞转移

过继性细胞转移(ACT)是有效的免疫疗法形式且涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者。ACT是涉及体外识别具有抗肿瘤活性的淋巴细胞、体外扩增这些细胞至大量和将它们输注至携带癌症的宿主的治疗方式。用于过继性转移的淋巴细胞可源自经切除的肿瘤的基质(肿瘤浸润性淋巴细胞或TIL)。用于ACT的TIL可如本文所述制备。在一些实施方案中，TIL是根据例如图1(特别是例如图1B和/或图1C)描述的方法制备。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)、经混合的淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC)富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤来源肽克隆，则它们也可源自或来自血液。其中淋巴细胞源自待输注的携带癌症的宿主的ACT称为自体ACT。美国专利公布号2011/0052530关于一种用于进行过继性细胞疗法以促进癌症消退的方法，主要用于治疗患有转移性黑色素瘤的患者，所述专利公布以引用的方式整体并入本文中以用于这些方法。在一些实施方案中，TIL可如本文所述施用。在一些实施方案中，TIL可以单一剂量施用。所述施用可为注射，例如静脉注射。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多个剂量施用。给药可为每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可为一个月一次、每二周一次、每周一次或每两天一次。TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的施用可根据需要持续进行。

6.另外的治疗方法

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任一前述段落描述的治疗性TIL群体。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中在施用如上适用的任何前述段落描述的治疗有效剂量的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的治疗有效剂量的TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包括施用剂量为60mg/m

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，以还包含以始于向受试者施用TIL细胞之后当天的高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟静脉推注施用600,000或720,000IU/kg直到耐受为止。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是实体瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是黑色素瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是HNSCC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是宫颈癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是NSCLC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是高突变癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症是小儿高突变癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的受试者的方法中的如上适用的任一前述段落描述的治疗性TIL群体，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的所述治疗性TIL群体。

在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的受试者的方法中的如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中在向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包括施用剂量为60mg/m

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，以还包含以始于向患者施用TIL细胞之后当天的高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟静脉推注施用600,000或720,000IU/kg直到耐受为止。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中癌症是实体瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中癌症是黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中癌症是黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物，其中癌症是黑色素瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是HNSCC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是宫颈癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是NSCLC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是高突变癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中癌症是小儿高突变癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任一前述段落描述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的所述治疗性TIL群体。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的所述TIL组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案且接着向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中在向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的TIL组合物或至少有效剂量的TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包括施用剂量为60mg/

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体的用途或如上适用的任何前述段落描述的TIL组合物的用途，以还包含以始于向患者施用TIL细胞之后当天的高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟静脉推注施用600,000或720,000IU/kg直到耐受为止。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是实体瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳突瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、成胶质细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、成胶质细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是黑色素瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是HNSCC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是宫颈癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是NSCLC。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是成胶质细胞瘤(包括GBM)。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是胃肠癌。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是高突变癌症。

在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中癌症是小儿高突变癌症。

实施例

在本文中涵盖的实施方案现在参照以下实施例描述。这些实施例仅为说明的目的而提供，在本文中涵盖的本公开不应被视为受到这些实施例的限制，反而应视为包含任何和所有因此处所提供的教示而变得明显的变化。

实施例1：制备用于REP前和REP过程的培养基

此实施例描述用于制备组织培养基的程序，所述组织培养基使用于涉及培养源自各种肿瘤类型包括但不限于转移性黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三阴性乳腺癌和肺腺癌的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方案。此培养基可用于制备本申请和实施例中所述的任何TIL。

将以下试剂移除冷藏并使它们在37℃水浴中温热：(RPMI1640、人AB血清、200mML-谷氨酰胺)。根据下表19，通过添加各成分至待过滤的体积适当的0.2μm过滤器单位的顶部，制备CM1培养基。储存在4℃下。

表19：CM1的制备

在使用当天，在37℃水浴中预热所需量的CM1并添加6000IU/m1 IL-2。

额外补充-根据表20根据需要补充。

表20：CM1的额外补充，根据需要

将制备好的CM1从冰箱移除或如上表19所示制备新鲜CM1。从冰箱移除

在需要使用的当天制备CM3。CM3与

CM4与CM3相同，但额外补充2mM G1utaMAX

实施例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合物的使用

此实施例描述使用IL-2、IL-15和IL-21细胞因子(它们作为额外的T细胞生长因子)与实施例A至G的TIL过程的组合。

使用在本文中描述的过程，在实验的一组中，TIL在IL-2存在下生长自结肠直肠肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、三阴性乳房肿瘤、肺脏肿瘤和肾脏肿瘤，并且在另一组中在培养起始时以IL-2、IL-15和IL-21的组合代替IL-2。在REP前完成时，评估培养的扩增、表型、功能(CD107a+和IFN-γ)和TCR Vβ谱库。IL-15和IL-21在本文他处和Gruijl等人,IL-21promotes the expansion of CD27+CD28+tumor infiltrating lymphocytes withhigh cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets,S.J.,J Transl Med.,2013,11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。

结果显示相对于仅IL-2条件下，在IL-2、IL-15和IL-21处理条件下观察到多个组织中的CD4

实施例3：IL-2储备溶液(CELLGENIX)的制备)

此实施例描述将经纯化、冷冻干燥的重组人白细胞介素-2溶解成适用于进一步组织培养方案的储备溶液样品的过程，包括所有那些于本申请和实施例所述者，包括涉及使用rhIL-2的那些。

程序

制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移至50mL锥形管。添加l mL 1N乙酸至50mL锥形管。倒转管2至3次以混合均匀。将HAc溶液通过使用Steriflip过滤器过滤灭菌。

制备含1％HSA的PBS。添加4mL的25％HSA储备溶液至于150mL无菌过滤器单位中的96mL PBS。过滤溶液。储存在4℃下。对于所制备的各小瓶rhIL-2，填写表格。

制备rhIL-2储备溶液(6×10

使用以下公式计算rhIL-2批量所需的1％HSA体积：

例如，根据CellGenix的rhIL-2批量10200121COA，lmg小瓶的比活性为25×10

用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡胶瓶塞。使用附接至3mL注射器的16G针头，注射建议体积的0.2％HAc至小瓶中。在抽出针头时，小心不要使瓶塞脱出。倒转小瓶3次且涡旋直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。将计算体积的1％HSA添加至小瓶。

RhIL-2溶液的储存。短期储存时(＜72hrs)，将小瓶储存在4℃下。长期储存时(＞72hrs)，将小瓶等分成更小体积且储存在-20℃冷冻小瓶中，直到准备使用为止。避免冷冻/解冻循环。记录制备日期之后6个月的到期日。Rh-IL-2标记包括供货商和目录编号、批号、到期日、操作者姓名首字母、等分试样的浓度和体积。

实施例4：冷冻保存过程

此实施例描述使用CryoMed控速冷冻器型号7454(Thermo Scientific)，将实施例G中所述的简化密闭程序制备的TIL冷冻保存的过程方法。

使用的设备如下：铝盒固定架(与CS750冷冻袋相容)、750mL袋的冷冻储存盒、低压(22psi)液态氮瓶、冰箱、热电偶传感器(用于袋的带型)和CryoStore CS750冷冻袋(OriGenScientific)。

冷冻过程提供0.5℃速率从成核到-20℃和每分钟1℃到-80℃终末温度的冷却速率。程序参数如下：步骤1-在4℃下等待；步骤2：1.0℃/min(样品温度)到-4℃；步骤3：20.0℃/min(室温度)到-45℃；步骤4：10.0℃/min(室温度)到-10.0℃；步骤5：0.5℃/min(室温度)到-20℃；和步骤6：1.0℃/min(样品温度)到-80℃。

实施例5：第3代示例性过程

本实施例提供第2代与第3代过程之间的比较。此实施例描述发展稳健的TIL扩增平台。对第2代过程的改进通过减少操作者介入次数而减少风险且简化方法、减少整体制造时间、优化试剂使用且促进适于商业规模高通量制造的弹性的半密闭和半自动化细胞产生过程。

第2代和第3代过程的TIL由经过外科切除肿瘤且接着离体扩增的源自个别患者的自体TIL构成。第3代过程的引发性第一扩增步骤在白细胞介素-2(IL-2)和单克隆抗体OKT3(其靶向经照射的外周血单核细胞(PBMC)的支架上的T细胞共受体CD3)存在下的细胞培养。

第2代TIL产物的制造由二期组成：1)快速扩增前(REP前)和2)快速扩增方案(REP)。在REP前期间，将经切除的肿瘤切成各尺寸2至3mm的≤50个片段，将它们与含血清培养基(含有10％HuSAB补充的RPMI 1640培养基)和6,000IU/mL的白细胞介素-2(IL-2)培养11天。在第11天，将TIL收获和引入大规模第二REP扩增中。REP由于补充有3000IU/mL的rhIL-2的5L体积的CM2中与载有150μg的单克隆抗CD3抗体(OKT3)的5×10

第3代TIL产物的制造由三期组成：1)引发性第一扩增方案、2)快速第二扩增方案(也称为快速扩增期或REP)和3)继代培养分瓶。为了实现引发性第一扩增TIL增殖，将经切除的肿瘤切成各尺寸2至3mm的≤120个片段。在引发性第一扩增的第0天，在3个100MCS容器各者中大约100cm

整体而言，第3代过程是时间较短、更可扩充且易于改良的扩增平台，可调适以适合稳健制造和过程可比较性。

表21：示例性第2代和示例性第3代制造过程的比较。

在第0天，两个过程的肿瘤都洗涤3次并将片段随机分组并分至两个池；每个过程一个池。以第2代过程而言，将片段转移至一个具有1L含有6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基的GREX 100MCS培养瓶中。以第3代过程而言，将片段转移至一个具有200至500mL含有6,000IU/mL rhIL-2、任选地15μg OKT-3和2.5×10

接种TIL用于Rep起始日根据各过程发生在不同天。以第2代过程而言，其中使G-REX 100MCS培养瓶90％体积减少，在第11天将收集的细胞悬浮液转移至一个新的G-REX500MCS以在含有IL-2(3000IU/mL)加上5e9个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP起始。使细胞扩增且按方案在第16天分瓶至多个具有含IL-2(3000IU/mL)的CM4培养基的GREX 500MCS培养瓶。接着收获培养物且按方案在第22天冷冻保存。

以第3代过程而言，REP起始发生在第7天，其中使用相同的G-REX 100MCS于REP起始。简言之，将200至500mL含有IL-2(6000IU/mL)和5×10

特别地，接种TIL用于Rep起始日根据各过程发生在不同天。以第2代过程而言，其中使G-REX 100MCS培养瓶90％体积减少，在第11天将收集的细胞悬浮液转移至一个新的G-Rex 500MCS以在含有IL-2(3000IU/mL)加上5e9个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP起始。使细胞扩增且按方案在第16天分瓶至多个具有含IL-2(3000IU/mL)的CM4培养基的G-Rex 500MCS培养瓶。接着收获培养物且按方案在第22天冷冻保存。

特别地，以第3代过程的接种而言，REP起始发生在第7天，其中使用相同的G-Rex100MCS于REP起始。简言之，将800mL含有IL-2(6000IU/mL)和1e9个饲养细胞和30ug OKT-3的CM2培养基添加至各培养瓶。在第11天，将培养规模放大以进行三个运行。将G-Rex100MCS的整个体积转移至G-Rex 500MCS且添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将培养瓶孵育5天。收获培养物并第16天冷冻保存。

比较中包括三个不同肿瘤，即两个肺肿瘤(L4054和L4055)和一个黑色素瘤肿瘤(M1085T)。

事先制备用于L4054和L4055的CM1(培养基1)、CM2(培养基2)和CM4(培养基4)培养基且保持在4℃下。制备无过滤的CM1和CM2培养基以比较有或无过滤培养基的细胞生长。

事先将用于L4055肿瘤REP起始和规模放大的培养基在37℃下温热至多24小时。

结果总结

在实现的总存活细胞方面，第3代掉落至第2代的30％以内。第3代最终产物在再刺激后展现较高的INF-γ产生。第3代最终产物展现增加的克隆多样性，如存在的总独特CDR3序列所测量。第3代最终产物展现较长的平均端粒长度。

实现的结果

细胞计数和活力％：

第2代和第3代过程的REP前和REP扩增遵循上述细节。

表22：REP前细胞计数。以每个肿瘤而言，两个池含有相等数量的片段。由于肿瘤大小较小，因此没有实现每个培养瓶最大数量的片段。收获总REP前细胞(TVC)，并且第2代过程在第11天和第3代过程在第7天计数。为了比较两个REP前组，将细胞计数除以提供于培养的片段数量，以计算每片段的平均存活细胞。如下表所示，第2代过程相较于第3代过程一致地生长每片段较多细胞。外推计算第3代过程第11天的预期TVC数量，其通过将REP前TVC除以7再乘以11计算。

表22：REP前细胞计数。

*L4055，未过滤的培养基。

表23：TIL最终产物的总存活细胞计数和倍数扩增：以第2代和第3代过程而言，按过程条件计数TVC且产生过程每一天的存活细胞百分比。收获时，收集第22天(第2代)和第16天(第3代)细胞且建立TVC计数。接着将TVC除以第0天提供的片段数量，以计算每片段的存活细胞平均数。倍数扩增通过将收获TVC除以REP起始的TVC计算。如表中所展现，比较第2代和第3代，L4054的倍数扩增类似；以L4055为例，第2代过程的倍数扩增较高。具体而言，此例的培养基在REP起始日之前温热至多24小时。在M1085T也观察到第3代的较高倍数扩增。外推计算第3代过程第22天的预期TVC数量，其通过将REP TVC除以16再乘以22计算。

表23：TIL最终产物的总存活细胞计数和倍数扩增

*L4055，未过滤的培养基。

表24：TIL最终产物的活力％：在收获后，将最终TIL REP产物的活力％与释放标准比较。第2代和第3代过程的所有条件超过70％活力标准，并且在过程和肿瘤之间是可比较的。

表24：REP的活力％

*L4055，未过滤的培养基。

表25：第3代过程每额外培养瓶的估计细胞计数。由于每培养瓶片段数量低于最大所需数量，因此计算各肿瘤在收获日的估计细胞计数。估计是基于预期临床肿瘤够大可在第0天接种2或3个培养瓶

表25：对第3代过程的全规模2和3个培养瓶的外推估计细胞计数计算

TIL最终产物的表型标志物比较：

三个肿瘤L4054、L4055和M1085T经历第2代和第3代过程的TIL扩增。在收获后，使REP TIL最终产物进行流式细胞术分析以测试纯度、分化和记忆标志物。在所有条件下，TCRa/b+细胞的百分比都超过90％。

自第3代过程收获的TIL相较于自第2代过程收获的TIL显示较高的CD8和CD28表达。第2代过程显示较高百分比的CD4+。参见图3(A、B、C)。

TIL最终产物的记忆标志物比较：

自第3代过程收获的TIL相较于来自第2代过程的TIL显示较高的中央记忆区室表达。参见图4(A、B、C)。

TIL最终产物的活化和耗竭标志物比较：

分析来自两个肿瘤L4054和L4055的TIL的活化和耗竭标志物，以比较来自第2代和第3代TIL扩增过程的最终TIL产物。第2代与第3代过程之间的活化和耗竭标志物是可比较的。参见图5(A、B)；图6(A、B)。

在收获日(第2代第22天和第3代第16天)，L4054和L4055的TIL经历包被的抗CD3板的过夜再刺激。对M1085T的再刺激使用抗CD3、CD28和CD137珠进行。所有条件中再刺激24小时后收集上清液且将上清液冷冻。在相同时间使用相同的ELISA板评估来自两个过程的上清液的IFNγELISA分析。在三个分析的肿瘤中，观察到第3代过程有较高的IFNγ产生。参见图7(A、B、C)。

为了比较第2代与第3代过程之间的IL-2消耗，收集肿瘤L4054和L4055在REP起始、规模放大和收获日的细胞上清液。IL-2在细胞培养上清液中的量是通过来自R&D的Quantitate ELISA试剂盒测量。整体趋势指示，相较于第2代过程，第3代过程维持较高的IL-2浓度。这可能是因为第3代在REP起始时较高的IL-2浓度(6000IU/mL)加上培养基在整个过程中的留存效应所致。参见图8(A、B)。

测量代谢基质诸如D-葡萄糖和L-谷氨酰胺的水平来作为整体培养基消耗的替代指标。测量它们的对等代谢物诸如乳酸和氨。葡萄糖是培养基中为粒线体所利用以产生ATP能量形式的单糖。当葡萄糖经氧化时，产生乳酸(乳酸酯是乳酸的酯)。乳酸酯在细胞指数生长期期间高度产生。高水平的乳酸酯对细胞培养过程具有负面影响。参见图9(A、B)。

在REP起始、规模放大和收获日，收集L4054和L4055在第2代和第3代过程中用过的培养基。用过的培养基收集日为：第2代第11天、第16天和第22天；第3代第7天、第11天和第16天。在CEDEX生物分析仪上分析上清液的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、glutamax和氨浓度。

L-谷氨酰胺是细胞培养基制剂所需的不稳定必需氨基酸。谷氨酰胺含有胺，并且此酰胺结构性基团可运送和递送氮至细胞。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞产生毒性氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，第2代和第3代过程的培养基补充有Glutamax，其在水溶液中较为稳定且不会自发降解。在两个肿瘤细胞系中，第3代组(16天过程)在过程中显示L-谷氨酰胺和Glutamax的降低和氨在整个REP的增加。在第2代组(22天过程)中，观察到恒定浓度的L-谷氨酰胺和Glutamax和稍微增加的氨产生。第2代和第3代过程的氨在收获日(第2代为22；第3代为16)可比较，并且显示L-谷氨酰胺降解有稍微差异。参见图10(A、B、C)。

流式-FISH技术用于测量在第2代和第3代过程下，L4054和L4055上的端粒重复平均长度。相对端粒长度(RTL)的确定是使用DAKO流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算。第3代显示与第2代可比较的端粒长度。

为了确定各过程所产生的细胞产物的克隆多样性，取样L4054和L4055所收获的TIL最终产物且经由测序T细胞受体的CDR3部分来测定克隆多样性分析。

表26：L4054的第2代和第3代的TIL收获细胞产物共享独特CDR3序列的百分比的比较。第3代与第2代最终产物之间共享199个序列，对应97.07％之前80％来自第2代与第3代最终产物所共享的独特CDR3序列。

表26：L4054的第2代过程与第3代过程之间的共享uCDR3序列的比较。

表27：L4055的第2代和第3代的TIL收获细胞产物共享独特CDR3序列的百分比的比较。第3代与第2代最终产物之间共享1833个序列，对应99.45％之前80％来自第2代与第3代最终产物所共享的独特CDR3序列。

表27：L4055的第2代过程与第3代过程之间的共享uCDR3序列的比较。

事先制备无过滤的CM1和CM2培养基且保持在4℃下直到用于肿瘤L4055以用于第2代和第3代过程。

将用于肿瘤L4055的培养基在第2代和第3代过程的REP起始日之前在37℃下温热24小时。

LDH没有在过程中收集的上清液中测量到。

M1085T TIL细胞计数使用K2细胞计数器进行。

在肿瘤M1085T方面，无法取得样品，诸如用于代谢分析的上清液、用于活化和耗竭标志物分析、端粒长度和CD3-TCR vb分析的TIL产物。

此实施例比较3个独立的供体肿瘤组织的功能质量属性加上延伸表型鉴定和第2代和第3代过程的培养基消耗。

第2代和第3代REP前和REP扩增比较就所产生的总存活细胞和总有核细胞群体活力来评估。TVC细胞在收获日的剂量在第2代(22天)与第3代(16天)之间不可比较。第3代细胞剂量低于第2代在收获时所收集的总存活细胞的约40％。

第3代过程的外推细胞数量是假设REP前收获发生在第11天而非第7天且REP收获在第22天而非第16天来计算。两种情况都显示使用第3代过程相较于第2代过程较接近的TVC数量，因此指示早期活化允许TIL生长的整体较好的表达。参见表4和5底，底行。

在第3代过程额外培养瓶(2或3个)的外推值的情况中，假设加工较大大小的肿瘤且达到如所述的过程所需的最大片段数量。观察到可在第3代过程的第16天收获达到相较于第2代过程第22天类似剂量的TVC。此观察结果很重要且指示培养的早期活化可允许TIL在较少加工时间中有优选表达。

第2代和第3代REP前和REP扩增比较就所产生的总存活细胞和总有核细胞群体活力来评估。TVC细胞在收获日的剂量在第2代(22天)与第3代(16天)之间不可比较。第3代细胞剂量低于第2代在收获时所收集的总存活细胞的约40％。

就表型鉴定而言，第3代过程相较于第2代过程观察到三个肿瘤较高的CD8+和CD28+表达。此数据指示第3代过程相较于第2代具有改善的最终TIL产物属性。

第3代过程相较于第2代过程显示稍微较高的中央记忆区室。

第2代和第3代过程显示可比较的活化和耗竭标志物，尽管第3代过程的持续时间较短。

在所分析的三个肿瘤中，第3代最终产物的IFNγ(IFNγ)产生高于第2代3倍。此数据指示第3代过程相较于第2代过程产生具有高度功能性且更有效的TIL产物，有可能是因为第3代的CD8和CD28表达的较高表达所致。在所分析的三个肿瘤中第3代最终产物的IFN-γ产生高于第2代3倍，表明第3代过程产生高度功能性的TIL。表型鉴定表明第3代在三个肿瘤的CD8+、CD28+表达上相较于第2代过程有正面趋势。

第2代与第3代之间的TIL最终产物的端粒长度是可比较的。

第2代与第3代最终产物之间的葡萄糖和乳酸酯水平是可比较的，表明第3代过程的培养基的营养素的水平不受影响，因为相较于第2代，过程中不每天进行体积减少移除且过程中整体培养基体积较少。

总体第3代过程显示加工时间相较于第2代过程减少几乎两倍，其将造成通过第3代过程扩增的TIL产物的商品成本(COG)大幅减少。

IL-2消耗指示第2代过程的IL-2消耗整体趋势，并且在第3代过程中IL-2较高，因为不移除旧的培养基。

第3代过程显示由CDR3 TCRab序列分析所测量的较高的克隆多样性。

在REP前第0天添加饲养细胞和OKT-3允许使用第3代过程的早期活化TIL和整体较好的TIL生长表达。

表28描述第3代过程的各种实施方案和结果并与目前的第2代过程比较：

表28：示例性第3代过程。

实施例6：选择和扩增来自CLL患者的PBMC的PBL的示例性实施方案。

PBMC是从患者收集且经冷冻供稍后使用或新鲜使用。收集足够体积的外周血以产生至少约400,000,000(400×10

所有以下步骤在无菌细胞培养条件下进行。将一等分试样的CM2在50mL锥形管在37℃水浴中温热以用于解冻和/或洗涤经冷冻的PBMC样品。如果使用经冷冻的PBMC样品，将样品自冷冻器储存处移除且保持在干冰上直到准备解冻为止。当准备解冻PBMC冷冻小瓶时，将5mL的CM2培养基放入无菌50mL锥形管中。将PBMC样品冷冻小瓶放入37℃水浴中直到仅剩下少量冰晶。将经温热的CM2培养基以样品:培养基1:1体积比例(约1mL)逐滴添加至样品小瓶。将所有内容物自冷冻小瓶移除且转移至50mL锥形管中剩余的CM2培养基。使用额外1至2mL的CM2培养基润洗冷冻小瓶，并且将冷冻小瓶的所有内容物移除且转移至50mL锥形管。接着使用额外CM2培养基将锥形管中的体积调整至15mL，并且轻柔涡旋以冲洗细胞。接着将锥形管在室温下以400g离心5分钟以收集细胞团块。

将上清液自团块移除，将锥形管加盖，并且接着通过例如将试管沿着粗糙表面刮擦以破坏细胞团块。将约1mL的CM2培养基添加至细胞团块，并且使用移液管将团块和培养基上下抽吸5至10次以断裂细胞团块。将额外3至5mL的CM2培养基添加至试管且经由移液管混合以使细胞悬浮。在此时，记录细胞悬浮液的体积。将100μL的细胞悬浮液自试管移除，使用自动细胞计数器例如Nexcelom细胞计数器K2进行细胞计数。确定样品中的活细胞数量且记录。

保留最少5×10

在以下步骤中，使用预冷却溶液快速作业且保持细胞冷度。下一步骤是纯化PBMC样品中的T细胞级分。这使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi,目录号130-096-535)完成。通过使用含有PBS、0.5％BSA和2mM EDTA且pH为7.2的经无菌过滤的洗涤缓冲液洗涤细胞来制备细胞以进行纯化。将PBMC样品以400g离心5分钟以收集细胞团块。抽吸上清液且将细胞团块重悬于每10

接着将T细胞(PBL)与Dunabeads

T细胞(PBL)和珠一起如下培养。在第0天：在G-Rex 24孔板中，在每孔总共7mL中，添加500,000个T细胞、500,000个CD3/CD28 Dynabeads以及补充有IL-2的CM2。将G-Rex板放在增湿37℃、5％CO

在第7天，制备用于通过REP扩增的细胞。将G-rex板移除孵育箱且将一半的培养基自各孔移除且丢弃。将细胞重悬于剩余培养基中且转移至15mL锥形管。将各孔使用1mL温热至37℃的补充有3000IU/mL IL-2的CM4洗涤且将洗涤培养基转移至与细胞相同的15mL试管中。移除细胞的代表性样品且使用自动细胞计数器计数。如果少于1×10

第11天，更换培养基。将一半的培养基自G-rex板的各孔或培养瓶移除且使用相同量的在37℃下的补充有3000IU/mL IL-2的新鲜CM4培养基置换。

第14天，收获PBL。如果使用G-rex板，从板的各孔移除约一半的培养基且丢弃。将PBL和珠悬浮于剩余培养基中且转移至无菌15mL锥形管(试管1)。将孔使用1至2mL温热至37℃的新鲜AIM-V培养基洗涤且将洗涤液转移至试管1。将试管1加盖且放在DynaMag

实施例7：使用第3代扩增平台扩增来自血液恶性肿瘤的T细胞的示例性实施方案。

在第0天，使用正向或负向选择方法自富含淋巴细胞的单采血液成分术产物、全血或(新鲜或解冻的)肿瘤消化物分离T细胞级分(CD3+,CD45+)，即使用T细胞标志物(CD2、CD3等或移除其他细胞留下T细胞)或梯度离心移除T细胞。

根据本文所述的第3代过程，通过接种约1×10

在第7天，按照第3.1代过程再活化细胞。

在第9至11天，按照第3.1代过程扩大细胞规模。

在第14至16天，按照第3.1代过程收获细胞。

图42提供使用第3代过程扩增来自造血恶性肿瘤的TIL的示例性实施方案的示意图。

实施例8：第3代扩增平台在第0天的示例性实施方案

制备肿瘤洗涤培养基。在开始之前温热培养基。添加5mL的庆大霉素(50mg/mL)至HBSS的500mL瓶。添加5mL的肿瘤洗涤培养基至待用于OKT3稀释的15mL锥形管。储存在室温下(RT)。

制备饲养细胞袋。将饲养细胞无菌转移至饲养细胞袋且储存在37℃下直到使用或冷冻。如果在37℃下，计数饲养细胞。如果冷冻，解冻且接着计数饲养细胞。

饲养细胞浓度的最优选范围介于5x10

如果总存活饲养细胞数量≥1x10

使用p1000微量移液管，将900μl的肿瘤洗涤培养基转移至OKT3等分试样(100μL)。使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL的OKT3且添加至第二饲养细胞袋。调整培养基体积至总体积2L。将第二饲养细胞袋转移至孵育箱。

OKT3制剂细节：可将OKT3以来自小瓶的原始储备溶液浓度(1mg/mL)以100ul等分试样等分和冷冻。每1mL小瓶约10X等分试样。储存在-80C下。第0天：15ug/培养瓶，即30ng/mL于500mL中-最多60ul约1个等分试样。

制备肿瘤样品。获得6孔板和100mm培养皿(总共4个)。将6孔板标记为“过量肿瘤片”。标示四个100mm培养皿的各一个为“洗涤_01”、“洗涤_02”、“洗涤_03”、“洗涤_04”和“保持”。

将5mL的肿瘤洗涤培养基添加至标记过量肿瘤片的6孔板中的所有孔。保持肿瘤洗涤培养基可用于进一步使用于分割期间保持肿瘤水合。

添加50mL的肿瘤洗涤培养基至标记洗涤_01、洗涤_02、洗涤_03和保持(洗涤_04)的各100mm培养皿。使用标记物，将各培养皿标记为分割1至分割4。使肿瘤在环境温度下孵育于洗涤_01中≥3分钟。使肿瘤在环境温度下孵育于洗涤_02中≥3分钟。使肿瘤在环境温度下孵育于洗涤_03中≥3分钟。洗涤_04在三次洗涤完成后用于保持肿瘤。在洗涤完成后，将肿瘤移至“保持”培养皿以确保组织维持水合。

当肿瘤孵育进行时，将10mL的肿瘤运送培养基转移至标记肿瘤运送培养基的试管中。抽取10mL的肿瘤运送培养基至注射器且使用5mL的肿瘤运送培养基接种各一个厌氧和需氧无菌瓶。

整个分割过程在培养皿盖子下方放置尺。测量和记录肿瘤长度和片段数量。将肿瘤分割成四个中间片或组成具有相等体积的四组且保留各中间片的肿瘤结构。保持肿瘤片水合。

将任何不是正在分割的中间肿瘤片转移至系留培养皿以保持组织水合。

使用分割培养皿盖子下方的尺作为参考，将肿瘤分割成27mm

保留有利组织片段于标记为片段试管1至片段试管4的锥形管中。根据所源自的片段试管数量计算要接种饲养细胞悬浮液的G-Rex 100MCS培养瓶的数量。

将饲养细胞袋移除孵育箱且接种G-Rex 100MCS。标记为D0(第0天)。

在G-REX100MCS中的肿瘤片段添加培养

在无菌条件下，松开标记肿瘤片段培养(D0)1的G-Rex 100MCS和标记片段试管的50mL锥形管的盖子。将打开的片段试管1涡旋，并且同时稍微抬起G-Rex100MCS的盖子。在涡旋时将含有片段的培养基添加至G-Rex100MCS。记录转移至G-Rex100MCS的片段的数量。

一旦片段位于GREX培养瓶的底部之后，抽取7mL的培养基且产生七个1mL等分试样-5mL用于扩大鉴定和2mL用于无菌样品。储存5个用于扩大鉴定的等分试样(最终片段培养上清液)在-20℃下直到需要为止。

接种各含有1mL的最终片段培养上清液的一个厌氧BacT/Alert瓶和一个需氧BacT/Alert瓶。重复各经取样的培养瓶。

实施例9：第3代扩增平台在第7至8天的示例性实施方案

制备饲养细胞袋。当冷冻时，在37℃水浴中解冻饲养细胞袋3至5分钟。如果冷冻，则计数饲养细胞。

饲养细胞浓度的最优选范围介于5x10

如果总存活饲养细胞数量≥2x10

使用p1000微量移液管，将900μl的HBSS转移至100μL OKT3等分试样。通过上下吸放3次来混合。制备两个等分试样。

OKT3制剂细节：可将OKT3以来自小瓶的原始储备溶液浓度(1mg/mL)以100ul等分试样等分和冷冻。每1mL小瓶约10X等分试样。储存在-80C下。第7/8天：30ug/培养瓶，即60ng/mL于500mL中-最多120ul约2个等分试样。

使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL的OKT3且添加至饲养细胞袋，确保所有都添加。调整培养基体积至总体积2L。重复第二OKT3等分试样且添加至饲养细胞袋。将第二饲养细胞袋转移至孵育箱。

制备含有饲养细胞悬浮液的G-REX100MCS培养瓶

根据在第0天产生的G-Rex培养瓶的数量，记录要加工的G-Rex 100MCS培养瓶数量。将G-Rex培养瓶移除孵育箱且将第二饲养细胞袋移除孵育箱。

在添加饲养细胞悬浮液之前移除上清液：

将一支10mL注射器连接至G-Rex100培养瓶且抽取5mL的培养基。产生五个1mL等分试样-5mL用于扩大鉴定，并且将5个等分试样(最终片段培养上清液)储存在-20℃下直到试验委托者请求用于扩大鉴定。标记且重复进行于各G-Rex100培养瓶。

5至20个1mL用于鉴定的样品，取决于培养瓶的数量：

·5mL＝1个培养瓶

·10mL＝2个培养瓶

·15mL＝3个培养瓶

·20mL＝4个培养瓶

持续将饲养细胞接种至G-Rex100 MCS中且重复进行于各G-Rex100 MCS培养瓶。使用无菌转移方法，通过重量将500mL的第二饲养细胞袋(假设1g＝1mL)重力转移至各G-Rex100MCS培养瓶且记录量。标记为第7天培养且重复进行于各G-Rex100培养瓶。将G-Rex100MCS培养瓶转移至孵育箱。

实施例10：第3代扩增平台在第10至11天的示例性实施方案

移除第一G-Rex 100MCS培养瓶且使用无菌条件使用10mL注射器移除7mL之前加工培养上清液。产生七个1mL等分试样-5mL用于扩大鉴定和2mL用于无菌样品。

小心混合培养瓶，使用新的10mL注射器移除10mL上清液且转移至标记为D10/11支原体上清液的15mL试管。

通过轻柔涡旋小心混合培养瓶以将细胞带至悬浮液中。使用新的注射器，根据待加工的培养瓶数量移除以下体积且添加至50mL锥形管。从各培养瓶抽出的样品保持分开且不汇合。

·1个培养瓶＝40mL

·2个培养瓶＝20mL/培养瓶

·3个培养瓶＝13.3mL/培养瓶

·4个培养瓶＝10mL/培养瓶

标记各锥形管第10/11天QC样品培养瓶#。储存在孵育箱中直到第14节需要为止。重复进行于各培养瓶。

应从所有培养瓶抽出总共40mL且汇合于标记“第10/11天QC样品”的50mL锥形管且储存在孵育箱中直到需要为止。进行细胞计数且分配细胞。

储存5个用于扩大鉴定的等分试样(加工前培养上清液)在≤-20℃下直到需要为止。接种各含有1mL的加工前培养上清液的一个厌氧BacT/Alert瓶和一个需氧BacT/Alert瓶。

持续将细胞悬浮液转移至G-Rex 500MCS且重复进行于各G-Rex 100MCS。使用无菌条件，将各G-Rex 100MCS的内容物转移至G-Rex 500MCS，一次监测约100mL的流体转移。当G-Rex 100MCS的体积减少至500mL(或在一些情况下约100mL)时停止转移。

在转移步骤期间，使用10mL注射器且自G-Rex 100MCS抽取10mL的细胞悬浮液至注射器。遵照根据培养中的培养瓶数量的说明。如果仅1个培养瓶：使用二支注射器总共移除20mL。如果2个培养瓶：每培养瓶移除10mL。如果3个培养瓶：每培养瓶移除7mL。如果4个培养瓶：每培养瓶移除5mL。将细胞悬浮液转移至一个共享50mL锥形管。保持在孵育箱中直到细胞计数步骤且QC样品。QC所需的细胞总数是约20e6个细胞：4x0.5mL细胞计数(细胞计数最先未经稀释)。

测定所需的细胞：

·IFN-G测定最少10e6个细胞

·支原体1e6个细胞

·流式CD3+/CD45+5e6个细胞

将G-Rex 500MCS培养瓶转移至孵育箱。

制备QC样品

至少需要15x10

以10x10

实施例11：第3代扩增平台在第16至17天的示例性实施方案

洗涤缓冲液制备(1％HAS PLASMALYTE A)

将HSA和PLasmalyte转移至5L袋以制备LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件，转移总体积125mL的25％HSA至5L袋。储存在室温下。

移除和转移10mL或40mL的洗涤缓冲液至“IL-2 6x10

计算要添加至Plasmalyte+1％HSA的经重构的IL-2的体积：经重构的IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度x最终体积)/IL-2的比活性(基于标准测定和制造方案)。IL-2的最终浓度是6x10

移除经重构的IL-2所需的IL-2经计算的初始体积且转移至“IL-2 6x10

自G-Rex 500MCS培养瓶移除约4500mL的上清液。涡旋剩余上清液且将细胞转移至细胞收集池袋。重复于所有G-Rex 500MCS培养瓶。

移除60mL的上清液且添加至上清液试管以进行质量管理测定，包括支原体检测。储存在+2℃至8℃下。

细胞收集

计数细胞。制备四个含有4.5mL的AIM-V的15mL锥形管。这些可提前制备。最优范围＝介于5x10

计算LOVO前TC(总细胞)(活+死)＝

平均总细胞

浓度(LOVO前TC浓度)

(活+死)

X

来源袋的体积

计算LOVO前TVC(总存活细胞)(活)＝

平均总存活细胞

浓度(LOVO前TVC)

(活)

X

LOVO来源袋的体积

当总细胞(TC)数量＞5x10

当总细胞(TC)数量≤5x10

使用适当大小的注射器自LOVO来源袋移除所需体积。保留在孵育箱中直到冷冻保存步骤为止。

当确定总细胞数量时，待移除的细胞数量应允许保留150x10

计算袋中剩余的剩余总细胞。计算LOVO前TC(总细胞)。[平均总细胞浓度X剩余体积＝剩余的LOVO前TC]

根据剩余的细胞总数，选择下表中对应的过程：

选择对应所使用的过程欲添加的IL-2的体积。体积计算为：滞留物体积x2x300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6x10

均匀混合细胞产物。密封所有袋以进一步加工，适用时包括冷冻保存。

对获得的冷冻小瓶样品进行内毒素、IFN-γ、无菌性及其他根据需要的测定。

实施例12：示例性第3代过程(也称为第3.1代)

目的

此实施例描述关于“第2代和第3代TIL扩增过程之间可比较性”的进一步研究。第3代过程经修改以包括在过程早期的活化步骤，所述步骤的目的在于增加最终总存活细胞(TVC)输出以与第2代可比较(或更好)，同时维持先前见到的表型和功能特征。

范围

经由引入在第0天对经培养的肿瘤片段的活化步骤来评估TVC输出。

在二种独立的患者肿瘤之间显示就功能和延伸表型鉴定方面与第3代标准以及对照组的可比较性。

分析培养基消耗和代谢物产生以证实维持在生理条件下的加工参数。

此实施例的所有运行使用商业供体肿瘤组织作为起始材料以完整规模平台进行。

信息

第3代过程实施方案经修饰为进一步实施方案且在本文此实施例中被称为第3.1代。

第3.1代TIL制造概念具有四次操作者介入：

1.肿瘤片段分离和活化：在过程的第0天，肿瘤经分割且所产生的最终片段是各约3x3mm(至多总共240个片段)且培养于1至4个G-Rex100MCS培养瓶中。各培养瓶含有至多60个片段、500mL的CM1或DM1培养基，并且补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3和2.5x10

2.TIL培养再活化：在第7至8天，经由缓慢添加CM2或DM1培养基(两者都补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3和5x10

3.培养规模放大：发生在第10至11天。在培养规模放大期间，将G-Rex100MCS的所有内容物转移至含有4L的CM4或DM2(两者都补充有3,000IU/mL的IL-2)的G-Rex500MCS培养瓶。使培养瓶在37℃下孵育5至6天直到收获为止。

4.收获/洗涤/配制：在第16至17天，将培养瓶的体积减少和汇合。将细胞浓缩且使用含有1％HSA的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。将经洗涤的细胞悬浮液使用CryoStor10配制为1:1比例且补充rhIL-2至最终浓度300IU/mL。

DP进行控速冷冻下的冷冻保存且储存于汽相液态氮中。*完全标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可被取代为CTS

过程说明

在第0天，将肿瘤洗涤3次，接着片段化成3x3x3最终片段。一旦全肿瘤片段化之后，接着将最终片段相等地随机分组且分成三个池。各组引入一个随机分组的片段池，按照三个实验矩阵添加相同数量的片段。

在整个TIL扩增过程中，肿瘤L4063扩增是使用标准培养基进行且肿瘤L4064扩增是使用确定成分培养基(CTS OpTmizer)进行。培养基的组分在本文进行了描述。

CM1完全培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM Glutamax、10％人AB血清、庆大霉素(50ug/mL)、2-巯基乙醇(55uM)。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。

CM2完全培养基2：50％CM1培养基+50％AIM-V培养基。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。

CM4完全培养基4：AIM-V，补充有Glutamax(2mM)。最终培养基制剂补充有3000IU/mL IL-2。

CTS OpTmizer CTS

DM1：CTS

DM2：CTS

所使用的所有类型的培养基(即，完全(CM)和确定(DM)培养基)提前制备且保持在4℃下直到使用前一天为止，并且在加工日之前提前在37℃孵育箱中温热至多24小时。

两种肿瘤的TIL培养再活化都发生在第7天。L4063的规模放大发生在第10天并且L4064在第11天。在第16天收获两种培养物并冷冻保存。

预期结果

第3.1代相较于第3.0代在第16至17天的收获可达到较高的总存活细胞数量。

第3.1代相对于第3.0代在再刺激后可产生类似水平的IFNγ。

第3.1代和第3.0代可具有类似的克隆多样性，通过存在于最终TIL产物中的总独特CDR3序列来测量。

第3.1代过程中的表型特征可类似于第3.0代。

实现的结果

确定第3.0代和第3.1代过程的细胞计数和活力％。在所有条件中的扩增遵照在此实施例中描述的细节。

总存活细胞计数和倍数扩增

以各肿瘤而言，将片段分成相等数量的三个池。由于肿瘤的大小较小，因此未实现每培养瓶的最大片段数量。以三种不同过程而言，评估各条件的总存活细胞和细胞活力。细胞计数在第7天确定为再活化的TVC，第10天(L4064)或第11天(L4063)为规模放大的TVC和第16/17天为收获的TVC。

第7天和第10/11天的细胞计数是FIO取得。倍数扩增是将收获第16/17天TVC除以第7天再活化日TVC计算。为了比较三个组，将收获日的TVC除以在第0天添加于培养中的片段数量，以计算每片段的平均存活细胞。

进行L4063和L4064的细胞计数和活力测定。如图73所示，第3.1代-测试过程比起第3.0代过程在两种肿瘤产生每片段较多细胞。

图74：总存活细胞计数和倍数扩增

过程期间的活力％

在再活化、规模放大和收获时，对所有条件进行活力百分比。在第16/17天收获时，比较最终TVC的活力％与释放标准。所有经评估的条件超越70％活力标准，并且在过程和肿瘤之间是可比较的，如图74所示。

免疫表型分析

TIL最终产物的表型鉴定。

使最终产物进行流式细胞术分析以测试纯度、分化和记忆标志物。所有条件的TCRα/β、CD4+和CD8+细胞群体百分比一致。

进行REP TIL的延伸表型分析。在两种肿瘤中，第3.1代条件的TIL产物相较于第3.0代显示较高百分比的CD4+细胞，并且两种条件中第3.0代相较于第3.1代条件有较高百分比的来自CD8+群体的CD28+细胞。

从第3.0代和第3.1代过程收获的TIL显示在CD4+和CD8+细胞上可比较的如CD27和CD56表型标志物表达且在CD4+门控细胞群体上可比较的CD28表达。图75显示第3.0代和第3.1代过程的最终TIL产物的表型标志物。图75：L4063和L4064的最终TIL产物的表型鉴定。

TIL最终产物的记忆标志物比较：

图76显示通过多色流式细胞术所确定的TIL最终产物的记忆标志物。在第16天收获的TIL的经冷冻的样品经染色以进行分析。第3.0代与第3.1代过程之间的TIL记忆状态是可比较的。图76：L4063和L4064的TIL产物的记忆标志物分析。

TIL最终产物的活化和耗竭标志物比较：

图77和图78显示通过多色流式细胞术所确定的TIL最终产物的活化和耗竭。活化和耗竭标志物在第3.0代和第3.1代过程所门控的CD4+(图77)和CD8+(图78)细胞之间是可比较的。图77：L4063和L4064所门控的CD4+细胞的活化和耗竭标志物。表78：L4063和L4064所门控的CD8+细胞的活化和耗竭标志物。

再刺激时的干扰素γ分泌：

将L4063和L4064的经收获的TIL使用包被的抗CD3板进行过夜再刺激。在两种分析的肿瘤中，观察到第3.1代过程相较于第3.0代过程有较高的IFNγ产生。各条件的IFNγ产生显示于图79。图79：第3.0代和第3.1代过程的最终产物的IFN-γ产生(pg/mL)。

测量培养基中的IL-2水平

为了比较所有条件和过程之间IL-2消耗的水平，在第7天起始再活化、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模放大和第16/17天收获时收集细胞上清液且冷冻。随后解冻上清液且接着进行分析。IL-2在细胞培养上清液中的量是通过制造商方案测量。数据显示于图80。

整体来说，第3代和第3.1代过程在相同培养基条件之间就所评估的完整过程期间的IL-2消耗方面是可比较的。图80：L4063和L4064所收集的用过的培养基的IL-2浓度(pg/mL)分析。

代谢物分析

在L4063和L4064的每一种条件的第7天再活化起始、第10天(L4064)或第11天(L4063)规模放大和第16/17天收获时，从L4063和L4064收集用过的培养基上清液。在CEDEX生物分析仪上分析上清液的葡萄糖、乳酸酯、谷氨酰胺、glutamax和氨浓度。图81示出L4063和L4064肿瘤第3.0代和第3.1代过程所收集的用过的培养基中的葡萄糖浓度。

确定成分培养基相较于完全培养基(2g/L)具有较高的葡萄糖浓度4.5g/L。总体而言，在各培养基类型内的第3.0代和第3.1代过程的葡萄糖的浓度和消耗是可比较的。图81：L4063和L4064的用过的培养基中的葡萄糖浓度(g/L)。

在两种肿瘤L4063和L4064的所有测试条件中观察到乳酸酯增加。在第3.0代和第3.1代条件之间和用于再活化扩增的二种培养基之间(L4063的完全培养基和L4064的确定成分培养基)乳酸酯的增加是可比较的。

图82示出两种肿瘤L4063和L4064第3.0代和第3.1代过程条件所收集的用过的培养基中的乳酸酯浓度。图82：L4063和L4064的用过的培养基中的乳酸酯浓度(g/L)。

以L4063为例，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM glutamax以补偿培养条件中L-谷氨酰胺天然降解成L-谷氨酸和氨。

以L4064肿瘤而言，所使用的确定(无血清)培养基的基础培养基不含有L-谷氨酰胺且仅补充glutamax至最终浓度2mM。Glutamax是L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的双肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定且不自发降解成谷氨酸和氨。相反地，所述双肽逐渐解离成个别氨基酸，由此维持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺以维持稳健的细胞生长。图83和图84分别示出两种肿瘤L4063和L4064第3.0代和第3.1代过程条件所收集的用过的培养基中的谷氨酰胺和glutamax浓度。

以L4063而言，谷氨酰胺和glutamax的浓度在规模放大日稍微降低，但在收获日显示增加至类似于或接近再活化日的水平。以L4064而言，谷氨酰胺和glutamax浓度在整个过程期间的不同条件之间显示以类似速率稍微降解。图83：L4063和L4064的用过的培养基中的谷氨酰胺浓度(mmol/L)。图84：L4063和L4064的用过的培养基中的glutamax浓度(mmol/L)。

图85示出两种肿瘤L4063和L4064第3.0代和第3.1代过程所收集的用过的培养基中的氨浓度。如所预期，L4063(生长于含有2mM谷氨酰胺+2mM glutamax的标准培养基)的氨浓度高于L4064(生长于含有2mM glutamax的确定成分培养基)。另外，如所预期，在培养期间氨会逐渐增加或累积。三种不同测试条件之间的氨浓度并无差异。图85：L4063和L4064的用过的培养基中的氨浓度(mmol/L)。

流式-FISH的端粒重复：

流式-FISH技术用于测量在第3代和第3.1代过程下，L4063和L4064上的端粒重复平均长度。相对端粒长度(RTL)的确定是使用DAKO流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算。进行端粒测定。

L4063和L4064样品的端粒长度与对照细胞系(1301白血病)比较。对照细胞系是具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞系。在两种肿瘤中评估的第3代和第3.1代过程显示可比较的端粒长度，如图86所示。图86：相较于对照(1301)细胞系的相对端粒长度(RTL)的摘要。

TCR Vβ谱库分析

为了确定各过程所产生的细胞产物的克隆多样性，经由T细胞受体的CDR3部分的测序来测定TIL最终产物的克隆多样性分析。

比较三种条件之间的三个参数：

·独特CDR3(uCDR3)的多样性指数

·共享uCDR3％

·在前80％的uCDR3中：

ο比较共享uCDR3拷贝％

ο比较独特克隆类型的频率

图87：L4063和L4064的TCR Vβ谱库总结。描述肿瘤L4063和L4064的第3代和第3.1代条件的最终TIL产物通过TCR Vβ谱库所测量的TIL克隆性。

图89：比较L4063第3代和第3.1代对照和第3.1代测试收获的TIL细胞产物之间所共享的独特CDR3序列的百分比：第3代和第3.1代测试最终产物之间共享975个序列，相当于88％之前80％来自第3代与第3.1代测试最终产物所共享的独特CDR3序列。

图88：L4063第3.0代和第3.1代过程之间收获的TIL最终细胞产物的独特CDR3序列频率比较。

图90：比较L4064第3代和第3.1代对照和第3.1代测试收获的TIL细胞产物之间所共享的独特CDR3序列的百分比：第3代和第3.1代测试最终产物之间共享2163个序列，相当于87％之前80％来自第3代与第3.1代测试最终产物所共享的独特CDR3序列。

图91：L4064第3.0代和第3.1代过程之间收获的TIL最终细胞产物的独特CDR3序列频率比较。

独特CD3序列的数量是从不同过程的第16天收获所收集的1x10

Shanon熵多样性指数是更可靠且常见的比较衡量法，两种肿瘤的第3.1代条件都比第3代过程显示稍微较高的多样性，表明第3.1代测试条件的TCR Vβ谱库比起第3.0代过程更具多克隆性。

此外，两种肿瘤L4063和L4064的第3.1代测试条件的TCR Vβ谱库显示与第3.0代过程的对应谱库有超过87％重叠。

额外信息

在再活化日第3.1代测试L4064用过的培养基的IL-2浓度的值低于预期值(类似于第3.1代对照和第3.0代条件)。

低值可能是因为移液误差，但由于采集最少样品，因此不可能重复测定。

来自规模放大第10/11天样品L4064的用过的培养基未经收集且不包括于上清液IL-2浓度分析和代谢物分析。

结论

在第0天包括饲养细胞和OKT-3的第3.1代测试条件显示相较于第3.0代和第3.1代对照在收获第16天较高的TVC细胞剂量。第3.1代测试条件的最终产物的TVC高于第3.0代约2.5倍。

在第0天添加OKT-3和饲养细胞的第3.1代测试条件在两种肿瘤L4063和L4064收获时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，如果在第0天起始最多4个培养瓶，最终细胞剂量可能介于80至100E+09个TIL之间。

最终TIL产物的所有质量属性诸如表型鉴定包括纯度、耗竭、活化和记忆标志物在第3.1代测试和第3.0代过程之间经维持且是可比较的。TIL最终产物的端粒长度和用过的培养基的IL-2消耗在第3.0代和第3.1代过程之间是可比较的。

在所分析的两个肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的第3.1代的最终TIL产物的IFNγ产生高于第3.0代3倍，表明第3.1代过程产生有效TIL产物。

未观察到测试条件之间葡萄糖或乳酸酯水平的差异。未观察到在培养基条件之间第3.0代和第3.1代过程之间谷氨酰胺和氨的差异。培养基中低量的谷氨酰胺不限制细胞生长且表明培养基仅添加glutamax足以给出使细胞增生所需的营养素。

L4063和L4064的规模放大日分别在第11天和第10天且就过程收获日达到的细胞数量方面未显示重大差异，并且两者在整个过程期间的代谢物消耗是可比较的。此观察结果表明第3.0代优化过程在加工日上可具有弹性，由此促进制造时程的弹性。

在第0天添加饲养细胞和OKT-3的第3.1代过程相较于第3.0代显示较高的由CDR3TCRab序列分析所测量的克隆多样性。

图92描述第3代过程(第3代优化过程)的实施方案。第3代优化过程TIL扩增可使用标准培养基和CTS Optimizer无血清培养基。以CTS Optimizer无血清培养基为例，建议增加培养基的glutamax至最终浓度4mM。

可行性和可比较性：

可行性：

已在所有实验中建立所有研究条件的可行性。在所有实验和条件中以及在供体肿瘤组织之间，利用相同批量的关键原料诸如IL-2、人血清-AB、同种异体饲养细胞、OKT-3进行所有实验。

可比较性：

可比较性通过研究中任一组符合我们根据LFP-002第22天进行冷冻保存的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的临床产物释放标准的能力确定，如图93概述。

实施例13：使用确定成分培养基的肿瘤扩增过程

进行实施例5至实施例12公开的过程，但将CM1和CM2培养基取代为根据本发明的确定成分培养基(例如，CTS

实施例14：扩增来自胰腺癌受试者的组织核心活检物的肿瘤浸润性淋巴细胞

此实施例描述经进行以扩增来自患者(P7055)的胰腺癌肿瘤核心活检物的TIL的研究。本实施例提供用于扩增来自组织核心活检物样品的TIL的方法的示例性实施方案。

获得包括3个肿瘤片段的胰腺肿瘤核心活检物且根据以下概述的类第2代肿瘤加工方法加工。图111描绘示例性类第2代方案的加工步骤。

第0天－肿瘤加工

收到肿瘤核心活检物和在方法第0天如本文所述洗涤。使用尺测量组织核心的长度和理论质量并记录。

第0天-类第2代(REP前)

将G-Rex 100M标记“肿瘤ID，第2代，姓名首字母，培养基制剂和日期”。将温热至37℃(达至少24至30小时)的0.5L的CM1+6000IU/mL IL-2添加至G-Rex 100M。使用6孔板且将5mL的肿瘤洗涤缓冲液添加至标记“#1”、“#2”和“#3”的三个孔。简言之，将核心活检物容器溶液的所有内容物转移至培养皿(诸如100mm或150mm)。

将样品洗涤3次，洗涤通过使用巴斯德吸管将核心活检物样品转移至孔1。使样品孵育3分钟。接着，将样品转移至孔#2达3分钟且接着将样品转移至孔#3达3分钟。

使用移液管或镊子，将活检物样品从孔#3直接添加至在以上步骤中制备的含有0.5L的CM1+6000IU/mL IL-2的经标记的G-Rex 100M。将G-Rex 100M放入37℃/5％CO

第3天-类第2代(REP前收获/活化)

类第2代过程的第3天如下进行。从汇合的来自2位或更多位不同供体的PBMC群体制备饲养细胞(同种异体PBMC饲养细胞)。饲养细胞进行最小操作且冷冻直到需要为止。将2x1mL小瓶的饲养细胞(同种异体PBMC饲养细胞)解冻且移液至温热至37℃的48mL的CM-1+6000IU/mL IL-2中。

使用血清移液管将PBMC饲养细胞混合均匀且移除4x1mL等分试样。根据本领域中的技术人员已知的标准程序，计数不经稀释的解冻的饲养细胞。接下来，根据以下方程式计算100e6个PBMC饲养细胞所需的体积：100e6/平均活细胞浓度＝100e6个PBMC所需的体积。

将含有REP前培养的G-Rex 100M培养瓶移除孵育箱且放入生物安全柜(BSC)中。

将以上计算的体积和30μL的储备溶液OKT3(30ng/mL)添加至含有500mL CM1+6000IU/mL IL-2的各G-Rex 100M培养瓶。补足(QS)总体积至1L：500mL-添加至各培养瓶的PBMC的计算体积＝添加至培养瓶的CM1+6000IU/mL IL-2的总体积。

第11天-类第2代(REP)

类第2代过程的第11天如下进行。以REP前TIL收获而言，使用开放系统培养瓶。将含有培养的G-Rex 100M培养瓶移除孵育箱且移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析并储存在-80℃下。将无菌150mL瓶称重且记录重量。从G-Rex 100M培养瓶抽吸约900mL的上清液。使用血清移液管将REP前TIL培养转移至称重的无菌150mL培养瓶。

使用血清移液管将REP前TIL培养混合均匀且收集4x1mL等分试样以进行细胞计数。根据本领域中的技术人员已知的标准程序，进行四次不经稀释的细胞计数。在进行计数时，将REP前TIL培养放入孵育箱。

使用具有Ashton移液管的100mL注射器，将超过要接种至REP培养中的最大量(200e6个TIL)的细胞从REP前TIL培养移除。将200e6个TIL经由蓝色NIS端口转移至EV-1000N袋中。

将含有REP前TIL的EV-1000N袋无菌接合至G-Rex 500MCS的红色管线且使TIL重力引流至培养瓶中。在引流后，热封红色管线。

如上述解冻5e9个PBMC饲养细胞。在进行4次细胞计数后，基于细胞计数调整饲养细胞培养的体积以添加5e9个饲养细胞至EV1000N饲养细胞袋。在添加饲养细胞之后，将150uL的OKT3添加至饲养细胞袋。将饲养细胞袋无菌缀合至G-Rex 500MCS的红色管线且使5e9个饲养细胞重力引流至G-Rex中。将4.5L的CM2和3,000IU/mL IL-2添加至G-Rex500MCS。

第16天-类第2代(分瓶)

根据第2代第16天方法(参见例如实施例5的表21)，进行类第2代过程的第16天。

首先，抽取2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析且储存在-80℃下。简言之，将体积减少且将REP细胞培养分成至多5个G-REX 500MCS。在各G-REX 500MCS中，培养体积是4.5L CM4培养基+IL-2(3000IU/mL)且≥1×10

第22天-类第2代(收获)

根据第2代第22天方法(参见例如实施例5的表21)，进行类第2代过程的第22天。

将第22天细胞收获、经由LOVO(TIL收集2cy)加工且使用CRF程序#1冷冻于30x1mL冷冻小瓶(于1:1CS10/PLLA 1％HSA中)。在一些情况下，仅存在1个培养瓶且以理论产率外推任何额外子培养瓶。

保留10e6个LOVO后细胞以在冷冻之前进行鉴别染色。在丢弃上清液废液之前，移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析且储存在-80℃下。

结果

第11天(活化)TVC计数产生47.3e6个细胞。第22天(REP)LOVO后TVC计数产生10.4e9个细胞，活力为93％。因此，类第2代过程的第11天至第22天有8.4次细胞倍增。

实施例15：用于扩增来自组织核心活检物的肿瘤浸润性淋巴细胞的类第2代和第3代过程

此实施例描述使用类第2代过程和第3代过程的来自胰腺癌肿瘤核心活检物样品的TIL扩增的比较研究。本研究利用来自胰腺癌患者的肿瘤核心活检物(P7057)。此肿瘤样品包括3个核心且TIL产物是根据本文所述的类第2代过程产生。本研究也利用来自胰腺癌患者的肿瘤核心活检物(P7058)。此肿瘤样品包括8个核心，并且TIL产物是从根据本文所述的类第2代过程的4个核心和根据第3代过程的4个核心产生。

引言

当诊断癌症时，核心针活检物是用于取样异常组织生长的标准初步诊断程序。所述程序利用大规格(18、16、14等)针头经皮取样可疑区域，接着经进一步分析和测试以确定所述组织是否是癌性。由于核心针活检物不需要切口或手术，这是远不具侵入性的获得肿瘤样品的手段。因此所希望了解的是核心活检物是否可能在经概述的TIL方法中用来替代经切除的肿瘤作为起始材料。

背景

已发展二种方法(第2代和第3代)且用于临床制造以离体扩增源自新近经切除的肿瘤的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。第2代和第3代过程利用相同的生物反应器(G-Rex100 MCS和G-Rex500 MCS)。第2代过程包括快速扩增前方案(REP前)步骤且在第3代过程中此步骤被置换成活化步骤。第2代和第3代两种细胞培养扩增过程中的TIL培养的快速扩增(REP)和规模放大在白细胞介素-2(IL-2)、单克隆抗体OKT3和经照射的外周血单核细胞(“饲养细胞”)存在下进行，所有这些都促进TIL扩增。第3代比起第2代过程具有较短的过程持续时间。第2代和第3代过程用作核心针活检物的过程的设计基础。

目的

本研究的此目的是发展一种使用核心活检物样品作为起始材料的TIL方法。此方法的设计是基于在本文中概述的类第2代和第3代临床方法的设计。

范围

完整规模研究是使用类第2代过程和第3代过程进行(参见例如以上实施例)。类第2代过程相较于第2代过程有两个变化，包括3天的REP前(相较于第2代的11天)和通过在第3天添加饲养细胞和OKT-3的第3天活化步骤。

类第2代与第3代之间的主要过程设计差异如下。快速扩增前方案(REP前)存在于类第2代过程中，其中细胞在IL-2存在但OKT-3和饲养细胞不存在下在一段3天的孵育期间从核心组织或活检物外渗。第3代过程的对应步骤结合TIL自肿瘤的外渗与它们的通过在第0天添加OKT-3和饲养细胞的活化。

第2代过程的快速扩增方案包括在一段11天的时间段使用添加OKT3、饲养细胞至REP前TIL的单一活化且在第16天分瓶。第3代过程的对应REP也使用在第7/8天添加的OKT3和饲养细胞且在第11天规模放大。

第2代过程的REP前使用G-Rex 100MCS且REP使用G-Rex 500MCS。第3代过程的活化和再活化使用G-Rex 100MCS且规模放大使用G-Rex 500MCS。

第3代过程持续时间是16至17天相较于第2代过程的22天(例如第3代比第2代短5至6天)。

第3代过程使用确定成分培养基(即不含人AB血清)，而第2代过程使用含有人AB血清的完全培养基。

图111提供本文描述的类第2代和第3代过程的比较。

程序

本实施例的此小节概述利用类第2代过程以自来自胰腺肿瘤核心活检物样品P7057的核心产生TIL产物。以下描述的类第2代过程和第3代过程用于自来自胰腺肿瘤核心活检物样品P7058的核心产生TIL产物。

本研究利用源自供货商、合作方或伙伴的组织核心/活检物肿瘤样品。同种异体PBMC饲养细胞是从2位或更多位不同供体汇合。饲养细胞经最小操作且直接添加至在冷冻保存基质中的TIL培养，其是由悬浮于CS10中的单核细胞所组成。

第0天-类第2代(肿瘤加工)

类第2代方法的肿瘤加工如下进行。收到肿瘤核心活检物和洗涤3次。使用尺测量各组织核心的长度和理论质量并记录。

第0天-类第2代(REP前)

在类第2代过程的第0天，REP前期如下起始。将G-Rex 100M标记“肿瘤ID，第2代，姓名首字母，培养基制剂和日期”。将温热至37℃(达至少24至30h)的0.5L的CM1+6000IU/mLIL-2添加至G-Rex 100M。使用6孔板且将5mL的肿瘤洗涤缓冲液添加至标记1、2和3的3孔。简言之，将核心活检物容器溶液的所有内容物转移至培养皿(100mm或150mm)。将样品洗涤3次，洗涤通过使用巴斯德吸管将核心活检物样品转移至孔1。孵育3分钟。接着将样品转移至孔2达3分钟且接着将样品转移至孔3达3分钟。使用移液管或镊子，将活检物样品从孔3直接添加至在以上步骤中制备的含有0.5L的CM1+6000IU/mL IL-2的经标记的G-Rex 100M。将G-Rex 100M放入37℃/5％CO

第3天-类第2代(REP前收获/活化)

在类第2代过程的第3天，REP前收获/活化如下进行。将2x1mL小瓶的PBMC解冻且移液至温热至37℃的48mL的CM-1+6000IU/mL IL-2中。使用血清移液管混合均匀且移除4x1mL等分试样且如标准方法所示计数不经稀释的解冻的饲养细胞。计算100e6个PBMC所需的体积：(100e6/平均活细胞浓度＝100e6个PBMC所需的体积)。将含有培养的G-Rex 100M培养瓶移除孵育箱且放入BSC中。将以上计算的体积和30μL的储备溶液OKT3(30ng/mL)添加至含有500mL CM1+6000IU/mL IL-2的各培养瓶。补足总体积至1L：500mL-在10.5.6添加的体积＝添加至培养瓶的CM1+6000IU/mL IL-2的总体积。

第11天-类第2代(REP)

在类第2代过程的第11天，REP期是如第2代第11天过程所示起始，除了REP前TIL收获和接种至G-Rex 500MCS中。以REP前TIL收获而言，使用开放系统培养瓶。将培养瓶移除孵育箱且移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析并储存在-80℃下。将无菌150mL瓶称重且记录重量。抽吸约900mL的上清液。使用血清移液管将REP前TIL转移至经称重的无菌150mL培养瓶。使用血清移液管混合均匀且获得4x1mL等分试样以进行细胞计数。如标准方法所示在NC-200上进行4次不经稀释的细胞计数。在进行细胞计数时，将REP前TIL保持在孵育箱中。

如有需要，从培养瓶移除适当体积以留下200e6个TIL(要接种至REP中的最大量)且使用具有Ashton移液管的100mL注射器将剩余TIL(200e6个TIL)经由蓝色NIS端口转移至EV-1000N袋中。将含有REP前TIL的EV-1000N袋无菌接合至G-Rex 500MCS的红色管线且使TIL重力引流至培养瓶中。在引流后，热封红色管线。

根据上述方法解冻5e9个饲养细胞。在进行4次细胞计数后，如果有需要调整体积以实现EV1000N饲养细胞袋中5e9个细胞。添加150uL的OKT3至饲养细胞袋。将饲养细胞袋无菌接合至G-Rex 500MCS的红色管线且使5e9个饲养细胞重力引流至G-Rex中。将4.5L的CM2+3000IU/mL IL-2添加至G-Rex 500MCS。

第16天-类第2代(分瓶)

在类第2代过程的第16天，按照第2代第16天步骤(参见实施例5的表21)进行分瓶步骤。抽取2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析且储存在-80℃下。类第2代过程的第16天是如第2代第16天过程所示进行，例外如下。如果仅1个培养瓶进行规模放大/分瓶，在收获时加上子培养瓶数量以外推完整规模。例如，如果需要5个培养瓶，但仅1个进行，则将最终产物TVC乘以5以外推预期的完整规模产率。

第22天-类第2代(收获)

在类第2代过程的第22天，按照第2代第22天过程(参见例如实施例5的表21)进行收获步骤。将类第2代第22天细胞收获、经由LOVO细胞加工系统加工且冷冻于30x1mL冷冻小瓶(于1:1CS10/PLLA 1％HSA中)。在一些情况下，仅存在1个培养瓶且以理论产率外推任何额外子培养瓶。保留10e6个LOVO后细胞以在冷冻之前进行鉴别染色。在丢弃上清液废液之前，移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析且储存在-80℃下。

第0天-第3代(肿瘤加工)

第3代方法的肿瘤加工是如本文概述进行。收到肿瘤核心活检物和洗涤3次。使用尺测量各组织核心的长度和理论质量并记录。

第0天-第3代(活化)

第3代第0天是根据概述过程进行(参见例如实施例5至8)。将如上述剩余的活检物样品分配至含有温热至37℃的500mL的DM+6000IU/mL IL-2的G-Rex 100M培养瓶中。以所使用的各培养瓶而言，在37℃水浴中解冻4x1mL小瓶的经照射的PBMC。使用移液管转移PBMC至含有46mL温热DM+6000IU/mL IL-2的50mL锥形管。使用血清移液管混合均匀且移除4x1mL等分试样且按照本文所述的方案在NC-200上以1:10稀释计数。计算250e6个PBMC所需的体积：(250e6/平均浓度＝250e6个PBMC所需的体积)。将前一步骤计算的体积添加至含有500mLDM+6000IU/mL IL-2和肿瘤片段的各培养瓶。将15uL的储备溶液OKT-3(1mg/mL)添加至含有500mL DM+6000IU/mL IL-2、肿瘤片段和PBMC饲养细胞的各培养瓶。将各培养瓶标记“肿瘤ID，第3代，培养瓶编号，姓名首字母，日期”。放入37℃/5％CO2孵育箱中直到第8天。

第7/8天-第3代(再活化)

第3代过程的第7/8天是如例如实施例5-9所述进行。将含有培养的G-Rex 100M培养瓶移除孵育箱且放入BSC中。移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析且储存在-80℃下。将温热至37℃的500mL的DM+6000IU/mL IL-2添加至G-Rex 100M培养瓶。将温热至37℃的25mL的DM+6000IU/mL IL-2添加至50mL锥形管。在37℃水浴中解冻1x25mL袋的PBMC，使用血浆延长组穿刺袋，使用注射器抽取25mL且分配至经制备的50mL锥形管。以1:10(100uL PBMC于900uL AIM-V中)或1:100(如所述制备1:10且接着转移100uL至另一900uL的AIM-V)进行4次细胞计数，如标准方法所示计数解冻的饲养细胞。计算500e6个PBMC所需的体积：(500e6/平均浓度＝500e6个PBMC所需的体积)。将以上步骤计算的体积的PBMC添加至含有1L DM+6000IU/mL IL-2和核心活检物的G-Rex 100M。添加30uL的储备溶液OKT3(30ng/mL)至培养瓶。将培养瓶放入37℃/5％CO2孵育箱。

第10/11天-第3代(规模放大)

第3代过程的第10/11天规模放大是如例如实施例5-10所述进行。将培养瓶移除孵育箱且移除2x1mL等分试样的上清液以进行代谢物分析并储存在-80℃下。在BSC内将流体转移组无菌接合至G-Rex 500MCS的红色管线，将流体转移组穿过Baxter泵且将Ashton移液管无菌连接至另一端。将约700mL的培养基自G-Rex 100MCS转移至G-Rex 500MCS，停止泵，涡旋以扰动细胞层且将剩余细胞培养转移至G-Rex 500MCS。在所有TIL经转移后，将G-Rex的红色管线无菌接合至温热至37℃的5L或10L DM+3K IU/mL IL-2袋上。重力引流培养基至G-Rex 500MCS的5L标记处。在引流完成后，将培养瓶放回孵育箱。

第16/17天-第3代(收获)

第3代过程的第16/17天是如例如实施例5-1所述进行。将第3代第17天细胞收获、经由LOVO(TIL收获5cy)加工且使用CRF程序#1冷冻于30x1mL冷冻小瓶(于1:1比例的CS10:Plasmalyte含1％HSA中)。在一些情况下，取决于第0天接种的片段数量，收获时仅存在1或2个培养瓶。保留10e6个LOVO后细胞以在冷冻之前进行纯度染色。

最终产物和起始材料鉴定：

可评估起始材料和根据类第2代和第3代过程制造的最终TIL产物。鉴别性(％CD45+/CD3+)是使用标准方案在冷冻前的新鲜TIL产物上测量。例如，测量就干扰素-γ产生和颗粒溶解酶B释放方面的TIL功能。TIL的刺激是根据IFN-γ释放测量。TIL的刺激经由ELISA根据颗粒溶解酶B释放测量。可评估使用分化项目和/或活化/耗竭项目的TIL的CD107a表型、延伸表型、表面抗原染色。可进行TCRvβ测序。可进行端粒酶活性和端粒长度。代谢物可通过CEDEX生物分析仪在培养上清液中测量。

预期结果或接受标准

类第2代过程的REP前细胞和最终产物以及第3代过程的最终产物的预期结果提供于表30和31。

表30.类第2代过程的REP前细胞测试和预期结果

表31.最终产物测试和接受标准(类第2代和第3代过程)

在一些实施方案中，冷冻的最终产物的测试在本文所述的方法(诸如类第2代和第3代方法)所产生的产物上进行。在一些实施方案中，测试包含以下中的一者或多者的评估：分化、活化和耗竭标志物、颗粒溶解酶B、CD107A、TCR vβ测序、端粒长度、端粒酶活性和代谢物。在一些情况中，分化通过流式细胞术评估，例如流式细胞测量TIL 1项目。在一些情况中，活化和耗竭标志物通过流式细胞术评估，例如流式细胞测量TIL 2项目。在一些情况中，颗粒溶解酶B通过珠刺激和ELISA评估。在一些情况中，CD107A通过有丝分裂原刺激和细胞内流式细胞术评估。在一些情况中，TCR vβ测序通过深度测序进行。在一些情况中，端粒长度是使用TAT测定测量。在一些情况中，端粒酶活性通过Q-TRAP确定。在一些情况中，端粒长度是使用TAT测定测量。在一些情况中，代谢物是使用CEDEX代谢物分析仪确定。

提供上述实施例以向本领域中的技术人员给出如何实施和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和说明，并非意图限制发明人对于他们的发明的主张范围。用于实施本发明的上述模式的修改为熟练的技术人员所显见，并且意图属于以下权利要求范围之内。说明书中所提及的所有专利和公布指示本发明所属领域中的技术人员的技能水平。

所有标题和章节名称仅用于清晰和参考目的，并且不应认为以任何方式限制本发明。举例而言，本领域中的技术人员应了解根据本文所述的本发明的精神和范围按需要组合来自不同标题和章节的各种方面的有用性。

本文所引证的所有参考文献都以引用的方式且出于所有目的完整并入本文中，犹如个别公布或专利或专利申请特别且个别明示出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

如本领域中的技术人员显而易见，在不背离本申请的精神和范围的情况下可对其进行许多修改和变化。本文所述的特定实施方案和实施例仅以实施例方式提供，并且本申请仅由随附权利要求的术语以及权利要求有权主张的等效物的全部范围限制。

序列表

<110> 艾欧凡斯生物治疗公司(Iovance Biotherapeutics，Inc.)

<120> 用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在免疫疗法中的用途

<130> 116983-5045

<150> US 62/755,954

<151> 2018-11-05

<150> US 62/903,585

<151> 2019-09-20

<160> 126

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 莫罗单抗重链

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 莫罗单抗轻链

<400> 2

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 3

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人IL-2 (rhIL-2)

<400> 3

Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

85 90 95

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

100 105 110

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser

115 120 125

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阿地白介素

<400> 4

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 5

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人IL-4 (rhIL-4)

<400> 5

Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn

1 5 10 15

Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp

20 25 30

Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg

35 40 45

Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr

50 55 60

Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu

65 70 75 80

Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly

85 90 95

Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn

100 105 110

Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 6

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人IL-7 (rhIL-7)

<400> 6

Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

20 25 30

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

35 40 45

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

50 55 60

Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu

65 70 75 80

Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln

85 90 95

Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys

100 105 110

Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp

115 120 125

Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn

130 135 140

Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人IL-15 (rhIL-15)

<400> 7

Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

1 5 10 15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

20 25 30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

35 40 45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

50 55 60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65 70 75 80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

85 90 95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

100 105 110

Asn Thr Ser

115

<210> 8

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组人IL-21 (rhIL-21)

<400> 8

Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val

1 5 10 15

Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro

20 25 30

Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys

35 40 45

Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg

50 55 60

Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr

65 70 75 80

Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp

85 90 95

Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser

100 105 110

Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly

115 120 125

Ser Glu Asp Ser

130

<210> 9

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9 (智人)

<400> 9

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 10

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 鼠4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9 (小家鼠)

<400> 10

Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln

20 25 30

Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro

35 40 45

Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys

50 55 60

Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro

85 90 95

Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr

100 105 110

Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn

115 120 125

Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg

130 135 140

Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu

165 170 175

Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe

195 200 205

Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln

210 215 220

Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser

225 230 235 240

Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

245 250 255

<210> 11

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的重链

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的轻链

<400> 12

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu

85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的重链可变区

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的轻链可变区

<400> 14

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu

85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的重链CDR1

<400> 15

Ser Thr Tyr Trp Ile Ser

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的重链CDR2

<400> 16

Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的重链CDR3

<400> 17

Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR1

<400> 18

Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR2

<400> 19

Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR3

<400> 20

Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val

1 5 10

<210> 21

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的重链

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的轻链

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的可变重链

<400> 23

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe

35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro

65 70 75 80

Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro

115 120

<210> 24

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的可变轻链

<400> 24

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR1

<400> 25

Gly Tyr Tyr Trp Ser

1 5

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR2

<400> 26

Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR3

<400> 27

Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR1

<400> 28

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR2

<400> 29

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR3

<400> 30

Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr

1 5 10

<210> 31

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fc结构域

<400> 31

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

100 105 110

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 32

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 32

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20

<210> 33

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 33

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20

<210> 34

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 34

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 25

<210> 35

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 35

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 25

<210> 36

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 36

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys

1 5 10 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 25

<210> 37

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 37

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys

1 5 10 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 25

<210> 38

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 38

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

1 5 10 15

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20

<210> 39

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 39

Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

1 5 10 15

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20

<210> 40

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 40

Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Pro Ala Pro Glu

20

<210> 41

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 41

Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His

1 5 10 15

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

20 25

<210> 42

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Fc结构域

<400> 42

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

20 25 30

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

35 40 45

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

50 55 60

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

65 70 75 80

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

85 90 95

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

100 105 110

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

115 120 125

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

130 135 140

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

145 150 155 160

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

165 170 175

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

180 185 190

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

195 200 205

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

210 215 220

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

245

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 43

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 44

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 接头

<400> 45

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BBL

<400> 46

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 47

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BBL可溶性结构域

<400> 47

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

20 25 30

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

35 40 45

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

50 55 60

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

85 90 95

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

100 105 110

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

115 120 125

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

130 135 140

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

145 150 155 160

Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

165

<210> 48

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-1-1变型1的可变重链

<400> 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 49

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-1-1变型1的可变轻链

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 50

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-1-1变型2的可变重链

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 51

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4B4-1-1变型2的可变轻链

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H39E3-2的可变重链

<400> 52

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala

65 70 75 80

Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr

115 120

<210> 53

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H39E3-2的可变轻链

<400> 53

Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala

100 105

<210> 54

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人OX40 (智人)

<400> 54

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 55

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 鼠OX40 (小家鼠)

<400> 55

Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr

20 25 30

Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met

35 40 45

Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu

50 55 60

Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys

65 70 75 80

Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr

85 90 95

Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg

100 105 110

Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro

115 120 125

Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn

130 135 140

Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu

145 150 155 160

Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu

165 170 175

Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val

180 185 190

Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro

195 200 205

Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu

210 215 220

Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp

225 230 235 240

Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr

245 250 255

Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

260 265 270

<210> 56

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的重链

<400> 56

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 57

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的轻链

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 58

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的重链可变区

<400> 58

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 59

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的轻链可变区

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的重链CDR1

<400> 60

Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn

1 5

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的重链CDR2

<400> 61

Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His

1 5 10

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的重链CDR3

<400> 62

Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的轻链CDR1

<400> 63

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5

<210> 64

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的轻链CDR2

<400> 64

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser

1 5 10

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 他伏利昔组单抗的轻链CDR3

<400> 65

Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp

1 5

<210> 66

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的重链

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的轻链

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 68

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的重链可变区

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 69

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的轻链可变区

<400> 69

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的重链CDR1

<400> 70

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的重链CDR2

<400> 71

Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的重链CDR3

<400> 72

Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的轻链CDR1

<400> 73

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的轻链CDR2

<400> 74

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 11D4的轻链CDR3

<400> 75

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 76

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的重链

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg

210 215 220

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 77

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的轻链

<400> 77

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 78

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的重链可变区

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的轻链可变区

<400> 79

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的重链CDR1

<400> 80

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 81

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的重链CDR2

<400> 81

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 82

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的重链CDR3

<400> 82

Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的轻链CDR1

<400> 83

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的轻链CDR2

<400> 84

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 85

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18D8的轻链CDR3

<400> 85

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

1 5

<210> 86

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的重链可变区

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 87

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的轻链可变区

<400> 87

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的重链CDR1

<400> 88

Ser His Asp Met Ser

1 5

<210> 89

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的重链CDR2

<400> 89

Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu

1 5 10 15

Arg

<210> 90

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的重链CDR3

<400> 90

His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的轻链CDR1

<400> 91

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 92

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的轻链CDR2

<400> 92

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu119-122的轻链CDR3

<400> 93

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 94

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的重链可变区

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 95

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的轻链可变区

<400> 95

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的重链CDR1

<400> 96

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的重链CDR2

<400> 97

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 98

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的重链CDR3

<400> 98

Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的轻链CDR1

<400> 99

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 100

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的轻链CDR2

<400> 100

Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr

1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Hu106-222的轻链CDR3

<400> 101

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 102

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OX40L

<400> 102

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 103

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OX40L可溶性结构域

<400> 103

Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu

1 5 10 15

Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu

20 25 30

Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe

35 40 45

Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser

50 55 60

Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val

65 70 75 80

Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys

85 90 95

Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His

100 105 110

Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe

115 120 125

Cys Val Leu

130

<210> 104

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OX40L可溶性结构域(替代)

<400> 104

Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys

1 5 10 15

Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys

20 25 30

Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile

35 40 45

Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr

50 55 60

Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val

65 70 75 80

Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu

85 90 95

Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly

100 105 110

Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

115 120 125

<210> 105

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 008的可变重链

<400> 105

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120

<210> 106

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 008的可变轻链

<400> 106

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

85 90 95

Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100 105

<210> 107

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 011的可变重链

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 108

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 011的可变轻链

<400> 108

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

85 90 95

Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100 105

<210> 109

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 021的可变重链

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120

<210> 110

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 021的可变轻链

<400> 110

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

85 90 95

Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100 105

<210> 111

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 023的可变重链

<400> 111

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 112

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 023的可变轻链

<400> 112

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 113

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链可变区

<400> 113

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 114

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 114

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 115

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链可变区

<400> 115

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro

115 120

<210> 116

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 116

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 117

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的重链可变区

<400> 117

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 118

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的重链可变区

<400> 118

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 119

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的轻链可变区

<400> 119

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 120

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的轻链可变区

<400> 120

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 121

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的重链可变区

<400> 121

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 122

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的重链可变区

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met

50 55 60

Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 123

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的轻链可变区

<400> 123

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 124

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化抗体的轻链可变区

<400> 124

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 125

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链可变区

<400> 125

Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 126

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 126

Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His

1 5 10 15

Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp

100 105 110

Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125