灯盏花素作为化疗药物心肌毒性预防和治疗药物的应用

摘要

本发明属于防治心脏毒性的药物技术领域，具体涉及灯盏花素作为化疗药物心肌毒性预防和治疗药物的应用。根据现有上市产品右雷佐生存在的不足，本发明显示灯盏花素在蒽环类化疗药物心肌毒性保护等方面体现其在预防和治疗应用中的特点、优势，同时原料成本低廉、安全性基础好，可作为蒽环类化疗药物心肌保护的活性成分或药物组方成分，降低化疗药导致的心脏毒性，提升肿瘤患者生存质量以及治疗预后。

说明书

技术领域

本发明属于防治心脏毒性的药物技术领域，具体涉及灯盏花素作为化疗药物心肌毒性预防和治疗药物的应用。

背景技术

随着癌症发病率日趋上升，包括蒽环类化疗药在内的抗肿瘤药物用药周期以及累积用量不断增加，化疗药物的不良反应越加凸显，其中以心肌损伤带来的危害最受关注，因而就化疗药物的心肌损伤新临床需求以及学科趋势，近年来全球肿瘤心脏病这一新学科得以迅速发展。其宗旨是在确保化疗药物抗肿瘤作用的同时，如何评估、预防、治疗化疗药带来的心血管不良反应。

目前，蒽环类化疗药物在乳腺癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤、多发性骨髓瘤等肿瘤的化疗中依然具有基石性价值。临床常用的蒽环类药物如多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、表柔比星等，其化学结构均含有如下的1个四环发色团，不同之处只是四环发色团上的取代基变化而已。其中，最经典且具代表性的药物是多柔比星(阿霉素)。

尽管蒽环类化疗药物不断推陈出新，如表柔比星、吡柔比星、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星等，但心脏毒性仍然是蒽环类药物具有共性的不良反应，如多柔比星、表柔比星引起化疗性心衰的最低累积剂量分别为：500mg/m

右雷佐生是目前被纳入临床指南用于治疗蒽环类药物心肌损伤的唯一药物，价格昂贵、给药剂量大(建议剂量为阿霉素的5～10倍)，且易加重骨髓抑制，临床对于用药控制较为严格。因此，研发新一代心肌损伤保护性药物非常重要。

灯盏花素以灯盏花乙素为主，包括少量灯盏花甲素，已有注射剂、口服剂型药物上市，具有广泛、确切的药理活性，如抗组织缺血再灌注的损伤、抗血栓、增加血流量、改善微循环、扩张血管等。迄今，尚无灯盏花素对于其在化疗药物心肌损伤治疗价值的研发报道。灯盏花乙素和灯盏花甲素的化学结构式如下。

发明内容

根据现有技术上存在的缺陷，结合目前的研究前沿，本发明提供了灯盏花素作为化疗药物心肌毒性预防和治疗药物的应用，灯盏花素可作为一类蒽环类化疗药物心肌保护的活性物质，改善氧化应激反应，缓解细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性。灯盏花素可通过老药新用，用于蒽环类药物心肌损伤的治疗药物。

本发明是采用以下的技术方案实现的：

本发明提供了灯盏花素作为抗肿瘤化疗药心肌毒性预防性药物的应用。

本发明还提供了灯盏花素作为抗肿瘤化疗药心肌毒性治疗性药物的应用。

其中，所述抗肿瘤化疗药为蒽环类抗肿瘤药物。

具体的，所述蒽环类抗肿瘤药物包括阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、表柔比星或米托蒽醌中的至少一种。

本发明的应用，用于制备抑制蒽环类抗肿瘤药物心肌损伤的药物、药物混合物药物组合物。

进一步地，作为本发明的一个优选方案，所述药物、药物混合物或药物组合物中，包括灯盏花素。

其中，所述灯盏花素包括灯盏花甲素或灯盏花乙素中至少一种。

本发明还提供一种药物、药物混合物或药物组合物，其活性成分包括灯盏花素，

所述药物、药物混合物或药物组合物具有下述1)-5)中至少一种功能：

1)预防和/或治疗蒽环类肿瘤化疗药的心肌毒性；

2)缓解蒽环类化疗药引起的心肌细胞乳酸脱氢酶异常；

3)降低蒽环类化疗药引起的活性氧自由基升高；

4)缓解蒽环类化疗药引起的心肌细胞脂质过氧化；

5)缓解蒽环类化疗药引起的线粒体膜去极化及细胞凋亡。

具体的，所述灯盏花素包括灯盏花甲素或灯盏花乙素中至少一种。

具体的，所述药物、药物混合物或药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。

本技术的核心在于，灯盏花素提升阿霉素损伤心肌细胞的存活率，抑制血小板、红细胞聚集及血小板第3因子活性，提高纤溶活性，利于血栓溶解。灯盏花素可抑制环磷腺苷(cAMP)-磷酸二酯酶活性，升高血小板内cAMP水平，降低胞内钙离子浓度，抑制血小板聚集。灯盏花使脑梗死患者血浆中的超氧化物歧化酶活性增强，提高机体抗氧化能力及一氧化氮水平，扩张毛细血管，降低血管阻力，增加脑血流量，改善微循环。灯盏花素可提高SOD、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，抑制活性氧自由基释放，对脂质过氧化及DNA的羟自由基氧化损伤有显著抑制作用。灯盏花素可抑制机体炎性反应，改善炎症细胞浸润，保护心脏。灯盏乙素可抑制诱导因子-1α和水通道蛋白-9表达，降低半胱氨酸蛋白酶-3活性，抑制细胞凋亡。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过灯盏花素干扰蒽环类药物(以阿霉素和柔红霉素为例)诱导的H9c2心肌细胞的心肌损伤，灯盏花素提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性优于右雷佐生；降低乳酸脱氢酶(LDH)产生和丙二醛(MDA)水平也优于右雷佐生；抑制活性氧自由基(ROS)产生与右雷佐生相媲美。灯盏花素可有效缓解蒽环类药物引起的线粒体膜去极化及细胞凋亡。因此可证明灯盏花素通过抗氧化及减轻氧化应激和细胞凋亡达到抗防蒽环类药物心肌损伤的作用。灯盏花素在改善氧化应激上优于右雷佐生，价格相比于右雷佐生便宜，副作用低，且已有上市药物，因此可作为一个改善蒽环类药物心肌损伤的备选药物。

附图说明

图1为实施例1中灯盏花素对不同蒽环类药物损伤心肌细胞的存活率的影响对比图，其中，Control：空白对照组；*：灯盏花素各浓度处理组与模型组相比，P<0.05；#：表示与模型组1(DOX)相比，存在统计学差异，P<0.05；&：与模型组2(EPI)相比，P<0.05；

图2为实施例2中灯盏花素对阿霉素损伤心肌细胞LDH漏出率的影响对比图，其中，C：空白对照组；*：与模型组相比，P<0.05；

图3为实施例3中灯盏花素对阿霉素损伤心肌细胞总SOD活力的影响对比图，其中，C：空白对照组；*：与模型组相比，P<0.05；

图4为实施例4中灯盏花素对阿霉素损伤心肌细胞GSH的影响对比图，其中，C：空白对照组；*：与模型组相比，P<0.05；

图5为实施例5中灯盏花素对阿霉素损伤心肌细胞MDA的影响对比图，其中，C：空白对照组；*：与模型组相比，P<0.05；

图6为实施例6中灯盏花素对阿霉素损伤心肌细胞ROS的影响对比图，其中，C：空白对照组；*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05；

图7为实施例7中灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞ATP水平的影响对比图；其中，C：空白对照组；*：与空白对照组相比，P<0.05；

图8为实施例8中灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响对比图；其中，C：空白对照组；*：与空白对照组相比，P<0.05；

图9为实施例9中灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞凋亡的影响对比图；其中，C：空白对照组；*：与空白对照组相比，P<0.05。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

1、下列实施例采用的材料如下：

本发明所述蒽环类抗生素优选包括阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、伊达比星、吡柔比星或米托蒽醌中的一种，在本发明实施例中以阿霉素和柔红霉素为例进行相应实验。

H9c2细胞株为大鼠心肌细胞，购买于美国ATCC细胞库。H9c2细胞在心肌细胞完全培养基溶液中培养，培养温度为37℃，在含有95％空气和5％二氧化碳(CO

心肌细胞完全培养基溶液：体积比为89％DMEM+10％FBS(FBS:胎牛血清，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号PWL001)+1％双抗(双抗：青霉素/链霉素溶液，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MA0110)。

右雷佐生(DEXRA)：购自公司湖北威德利化学科技有限公司；货号Y694。

灯盏花素(Breviscapine)：分子式C

DCFH-DA活性氧ROS荧光探针：购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MB4682；用量1ml；孵育时间15～60min；荧光波段：激发波长504nm，发射波长529nm。

CCK-8试剂盒，购自公司大连美仑生物技术有限公司；货号MA0218-L-10000T。

LDH检测试剂盒，购自公司北京索莱宝科技有限公司；货号BC0685。

CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号S0103。

还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒，购自公司北京索莱宝科技有限公司；货号BC1175。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号C1088。

ATP检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号，S0026B。

脂质氧化(MDA)检测试剂盒，购自公司上海碧云天生物技术有限公司；货号S0131S。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，购自公司北京索莱宝科技有限公司；货号M8650-100T。

2、实验过程

将H9c2细胞分别暴露于阿霉素(DOX)为0.5/1/2/10/20μM浓度下，筛选出阿霉素最佳浓度为5μM用于后续实验。H9c2细胞分别暴露于0.5μM Dox+2μM Dextra和0.5μM Dox+20μMBreviscapine下共同处理1天。用DMEM处理的细胞作空白对照，以右雷佐生处理的细胞做阳性对照。

3、药物及分组

实验细胞主要分成6组(n＝6)，空白对照组(control)、模型组(DOX)、阳性对照组(DEX)、灯盏花素处理组(B)、DOX+Dexra组(DD)、DOX+Breviscapine组(DB)。

在检测前24h，模型组给予阿霉素5μM，阳性对照组给予右雷佐生20μM，灯盏花素处理组给予灯盏花素200μM，其余两组分别为5μMDOX+20μMDexra以及5μMDOX+200μMBreviscapin。

实施例1、灯盏花素降低不同蒽环类药物(阿霉素、表柔比星)对H9c2细胞活性影响的对比

H9c2心肌细胞用培养基稀释为10

结果如图1所示，相对于control组细胞活性94.08％，5μM模型组1细胞活性为23.11％，，5μM的模型组2细胞活性为40.50％。阳性对照组细胞活性为56.96％，而合并使用10μM、20μM、50μM、100μM、200μM的灯盏花素后，细胞活性分别为25.75％、59.60％、65.45％、67.40％、69.12％。模型组1、2存活率明显低于空白对照组，灯盏花素各浓度均能明显提高细胞存活率。

EPI+Breviscapine组(5μM EPI+200μM Breviscapine)细胞活性为78.50％。可以看出灯盏花素对两种典型的蒽环类药物均具有保护作用，对心脏毒性较弱的表柔比星保护效果更佳，并显著提高细胞存活率。

后续实验采用200μM灯盏花素，以及阿霉素为蒽环类药物代表进行心肌损伤模型。

实施例2、灯盏花素降低阿霉素H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出的影响

H9c2心肌细胞用培养基稀释为10

实施例3、灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O

实施例4、灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)水平的影响

GSH是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，按照GSH检测试剂盒说明书进行操作。结果显示(图4)，DOX+Breviscapine组能够明显提高总GSH的活力，较模型组显著升高(P<0.05)。

实施例5、灯盏花素抑制阿霉素H9c2心肌细胞脂质过氧化水平的影响

氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此产生脂质过氧化物丙二醛(MDA)。MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，按照MDA检测试剂盒说明书进行操作。结果显示(图5)，模型组MDA含量与空白对照组相比显著增高，P<0.05。DOX+Breviscapine组较模型组均明显降低，证实灯盏花素可抑制活性氧诱导的脂质过氧化。

实施例6、灯盏花素抑阿霉素H9c2心肌细胞活性氧(ROS)水平的影响

利用荧光探针DCFH-DA自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，各组装载DCFH-DA探针，利用激光共聚焦显微镜拍摄，再利用ImageJ图像处理软件处理图像(图6)。

图6中“*”表示与空白对照组相比，“#”表示与模型组相比，均存在统计学差异。模型组ROS含量与空白对照组相比显著增高。DOX+Breviscapine组较模型组均明显降低，证实灯盏花素可抑制活性氧自由基产生。

实施例7、灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞ATP水平的影响

ATP作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降。与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，按照ATP检测试剂盒说明书进行操作。

参照图7，模型组ATP含量与空白对照组相比显著降低。DOX+Breviscapine组较模型组均明显提高，证实灯盏花素可增加ATP产生，维护了线粒体功能。

实施例8、灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响

与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，按照线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)说明书进行操作。经处理，利用激光共聚焦显微镜拍摄，利用ImageJ图像处理软件处理图像(图8)。模型组荧光强度与空白对照组相比显著提高，P<0.05。DOX+Breviscapine组较模型组均明显降低，证实灯盏花素可改善线粒体膜去极化，改善了线粒体功能。

实施例9、灯盏花素对阿霉素H9c2心肌细胞凋亡的影响

与实施例2采用相同的处理方式，培养24h后，进行TUNEL染色。染色后经处理，利用激光共聚焦显微镜摄，利用图像分析软件Image-Pro plus 5.0(Media Cybemetrics Inc,USA)计数TUNEL阳性细胞数，TUNEL阳性细胞数/视野表示(图9)。

根据图9显示，模型组荧光强度与空白对照组相比显著增强，DOX+Breviscapine组较模型组荧光强度均明显降低，证实灯盏花素可改善阿霉素诱导的细胞凋亡。

以上实施例证明，灯盏花素具有抑制血小板凝集，扩张血管，保护神经元，抑制炎症和抗氧化的作用，尤其它可以提高SOD、GSH-Px、CAT等的释放，有效抑制ROS产生。虽然以阿霉素和柔红霉素为例，建立心肌损伤细胞模型，但是，由于其化学结构均含有相同的四环发色团，不同之处只是四环发色团上的取代基变化而已，它们带来细胞损伤的影响是同类型的，灯盏花素可以对蒽环类抗肿瘤化疗药物产生的氧化损伤、凋亡等具有显著作用。

当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。