一种几丁质酶突变体ChiM及应用

摘要

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶比活提升的几丁质酶突变体ChiM及其应用。本发明提供的几丁质酶突变体ChiM是以几丁质酶ChiAm为出发模板，通过定点包含突变、组合突变获得酶比活提升的突变体ChiM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的几丁质酶突变体ChiM酶比活为71U/mg，是ChiAm的1.48倍。本发明以毕赤酵母为重组表达宿主，实现了ChiM的高效表达，可用于制备突变体ChiM，为进一步为其广泛应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶比活提升的几丁质酶突变体ChiM及其应用。

背景技术

几丁质作为一种生物活性多糖，来源广泛，在自然界含量仅次于纤维素。几丁质和纤维素一样，由于存在着致密的结晶区域，使得其溶解性很差，不溶于水和稀酸，因此限制了几丁质的产业化应用。几丁质的水解产物几丁寡糖具有很好的水溶性，在保健食品、农业种植、生物医药等领域具有巨大的应用价值。在农业种植领域，有研究表明几丁寡糖能够促进作物生根、提高作物抗病虫害能力、提升作物品质和产量。此外还有研究表明，在农业种植过程中合理使用几丁寡糖，能够有效减少化肥和农药的使用量，从而缓解化肥和农药残留所带来的环境污染、食品安全等问题。

目前几丁寡糖的制备主要分为物理法、化学法以及酶法。物理法存在反应速度慢、反应过程不可控等缺点，化学法则存在产物结构不完整、污染环境等缺点。相对于物理法和化学法，酶法制备几丁寡糖具备许多优势如：反应条件温和、产物结构完整、过程易于控制、对环境无污染等优点。几丁质酶作为一种生物酶能够专一性的分解几丁质，从而产生不同分子量的几丁寡糖。目前限制几丁质酶产业化应用的主要问题在于其发酵活力低，生产成本高。因此降低几丁质酶生产成本具有重要意义。

在我们前期研究中通过筛选和高效表达获得了几丁质酶ChiAm（专利申请号CN202010795529.2），几丁质酶ChiAm能够分解胶体几丁质生成几丁寡糖（几丁二糖和几丁三糖为主）。通过前期的研究我们发现几丁质酶ChiAm的生产成本较高，限制了其在农业种植领域的产业化应用，因此需要进一步提升其酶比活和发酵产量，从而有效降低其生产成本。在本专利中，以几丁质酶ChiAm为出发模板，通过定点包含突变和组合突变获得酶比活提升的突变体ChiM，此外通过毕赤酵母实现了突变体ChiM的高效表达，本专利为突变体ChiM的产业化应用奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种几丁质酶突变体ChiM及其应用。本发明获得的几丁质酶突变体ChiM能在温和条件下能提高酶比活，能够提高制备几丁寡糖的反应效率，同时降低反应成本。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种几丁质酶突变体ChiM，所述几丁质酶突变体ChiM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

ALSNNWYAAAPYLMPASNNPPDPVTVMNATGLKAFQLAFILAPNGGGCSPTWDGTSAVSSDTAVAGVISRIRGAGGDVSVSVGGYGGTKLGQTCGTVAATAAAYQQVITKYSLKAIDFDLEEPEYENTAAIANELGAAKTLQANNPGLFVSVTMPGTAAGTGWFGTQLIDQAKSIGFSPNNFSIMPWDGGFNGGSSQVSALEAFHGLLMSHMGWDSATAYAHEGFSGMNGKSDAAEMFYTSDFQTVYDYATSHGLGRFTFFSVNRDRACVGTTDNGVCSNVPQNDWDFTKFSVRFAGATPPQTTPPVTTTPTTPGNGSCTAAEWDRTKVYVKDNVVSHNSHKWTAKWWTQGEEPGTTGEWGVWQDNGAC（SEQID NO.1）

优选的，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，多聚核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

GCTTTGTCTAACAACTGGTACGCTGCTGCTCCATACTTGATGCCAGCATCTAACAACCCACCAGACCCAGTTACTGTTATGAACGCTACTGGTTTGAAGGCTTTCCAATTGGCTTTCATCTTGGCTCCAAACGGTGGTGGTTGTTCTCCAACTTGGGACGGTACTTCTGCTGTTTCTTCTGACACTGCTGTTGCTGGTGTTATCTCTAGAATCAGAGGTGCTGGTGGTGACGTTTCTGTTTCTGTTGGTGGTTACGGTGGTACTAAGTTGGGTCAAACTTGTGGTACTGTTGCTGCTACTGCTGCTGCTTACCAACAAGTTATCACTAAGTACTCTTTGAAGGCTATCGACTTCGACTTGGAAGAACCAGAATACGAAAACACTGCTGCTATCGCTAACGAATTGGGTGCTGCTAAGACTTTGCAAGCTAACAACCCAGGTTTGTTCGTTTCTGTTACTATGCCAGGTACTGCTGCTGGTACTGGTTGGTTCGGTACTCAATTGATCGACCAAGCTAAGTCTATCGGTTTCTCTCCAAACAACTTCTCTATCATGCCATGGGACGGTGGTTTCAACGGTGGTTCTTCTCAAGTTTCTGCTTTGGAAGCTTTCCACGGTTTGTTGATGTCTCACATGGGTTGGGACTCTGCTACTGCTTACGCTCACGAAGGTTTCTCTGGTATGAACGGTAAGTCTGACGCTGCTGAAATGTTCTACACTTCTGACTTCCAAACTGTTTACGACTACGCTACTTCTCACGGTTTGGGTAGATTCACTTTCTTCTCTGTTAACAGAGACAGAGCTTGTGTTGGTACTACTGACAACGGTGTTTGTTCTAACGTTCCACAAAACGACTGGGACTTCACTAAGTTCTCTGTTAGATTCGCTGGTGCTACTCCACCACAAACTACTCCACCAGTTACTACTACTCCAACTACTCCAGGTAACGGTTCTTGTACTGCTGCTGAATGGGACAGAACTAAGGTTTACGTTAAGGACAACGTTGTTTCTCACAACTCTCACAAGTGGACTGCTAAGTGGTGGACTCAAGGTGAAGAACCAGGTACTACTGGTGAATGGGGTGTTTGGCAAGACAACGGTGCTTGTTAA（SEQ ID NO.2）

本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体pPICZαA-chim，包含编码权利要求2所述的几丁质酶突变体ChiM的多聚核苷酸序列。

本发明又一个目的是提供一种重组菌，包含所述的重组表达载体pPICZαA-chim。

优选的，所述重组菌以毕赤酵母工程菌作为宿主。

优选的，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。

本发明最后一个目的是提供一种所述几丁质酶突变体ChiM在制备几丁寡糖中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种提升酶比活的几丁质酶突变体ChiM及其应用。本发明以几丁质酶ChiAm为出发模板，通过定点包含突变、组合突变获得酶比活提升的突变体ChiM，从而提高了酶活，加强了该酶合成几丁寡糖的能力，为起工业化生产提供了一种实际有效策略。实验结果表明，在pH5时为最适反应pH，突变体ChiM酶比活为71U/mg，是ChiAm的1.48倍。本发明以毕赤酵母为重组表达宿主，实现了ChiM的高效表达，可用于制备突变体ChiM，为进一步为其广泛应用奠定基础。

附图说明

图1为几丁质酶ChiAm分子对接三维构象图；

图2为重组工程菌7升高密度发酵曲线图；

图3为重组几丁质酶突变体ChiM最适反应温度及热稳定性图；

图4为重组几丁质酶突变体ChiM最适反应pH及pH稳定性图；

图5为重组几丁质酶突变体ChiM水解产物应用实验图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10购自深圳辉诺生物科技有限公司、毕赤酵母X33购自美国Invitrogen公司，表达载体pPICZαA-chim前期实验构建（专利申请号CN202010795529.2）。

2、酶与试剂盒

Q5高保真Taq酶MIX 购自NEB公司；质粒提取试剂盒（#DP103-03），胶纯化试剂盒（#DP209-02）购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶SacI、Taq酶MIX（EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix）购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，pH7.0）。LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin（博莱霉素）。

酵母培养基为YPD（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）。酵母筛选培养基为YPDZ（YPD + 不同浓度 zeocin）。

酵母诱导培养基BMGY（1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)）和BMMY培养基（除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同）。

注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。

4. 几丁质酶活性测定所用试剂

胶体几丁质：称10g几丁质加入100ml浓盐酸，在40℃搅拌3分钟，使之溶解。溶液中加入1升5℃的冷水，几丁质就作为胶体悬浮液沉淀下来。用粗滤纸过滤，过滤后的胶体沉淀用蒸馏水洗涤至中性；DNS试剂（6.3‰（w/v）3,5-二硝基水杨酸；18.2%（w/v）四水酒石酸钾钠；5‰（w/v）苯酚；5‰（w/v）无水亚硫酸钠）。

实施例1 几丁质酶ChiAm同源建模和分子对接

通过建模软件Modeller获得几丁质酶ChiAm蛋白三维构象图，通过分子对接软件Autodock viner获得几丁质酶ChiAm与底物结合三维构象图，如图1所示。用软件Pymol分析对接好的三维构象，发现几丁质酶ChiAm与底物结合的关键氨基酸位点包括M14、Q16、D119、E121、F187、D188、D233以及W261，其中D119、E121和D233是酶活性位点。根据分析的结果在本专利中选取M14、Q16、F187和W261进行饱和定点突变以期获得酶比活提升的突变体。

实施例2 定点饱和突变

分别设计引物和构建突变体，其中，8个关键氨基酸位点的引物序列如表1所示，引物序列如SEQ ID NO.3~18所示，二硫键突变体的构建大致如下：

（以M14位点为例，其他以此类推）：以构建好的pPICZαA-chim为模板，先用上下游引物M14-fw和M14-rev进行PCR扩增，上游引物序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述PCR反应体系如下表2所示，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。PCR产物回收过程大致如下：（1）将目标产物进行切胶放入2ml离心管；（2）加入溶胶液，在60℃条件下反应10分钟；（3）将第二步的溶胶液体加入收集管，10000rpm离心1分钟；（4）用75%乙醇洗两次后晾干；（5）加入50μL水，离心3分钟。

表1 二硫键突变体引物

表2 PCR反应体系

PCR反应程序如下：

模板质粒pPICZαA-chim的存在会导致转化以及菌液PCR的时候出现假阳性，因此需要去掉模板质粒pPICZαA-chim。用限制性内切酶DpnI将模板质粒pPICZαA-chim分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，具体的菌液PCR验证实验步骤为：用高压灭菌的牙签挑取单个菌落至含有500μL的LBZ培养基中37℃，200rpm培养4小时；吸取2μL菌液作为PCR的模板，PCR反应体系如表3所示；菌液PCR所用引物为5’AOX-fw和3’AOX-rev，其中，5’AOX-fw的引物序列信息如SEQ ID NO.19所示，3’AOX-rev的引物序列信息如SEQ ID NO.20所示，PCR扩增条件为95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30循环，电泳后，观察结果，对阳性的结果相对应的平板上的菌落进行测序。

引物5’AOX-fw和3’AOX-rev的序列信息为：

5’AOX-fw：GACTGGTTCCAATTGACAAGC（SEQ ID NO.19）；

3’AOX-rev：GGCACCTGGCATTCTGACATCC（SEQ ID NO.20）。

表3 菌液PCR反应体系

使用天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒（#DP103-03）取验证正确的转化子的质粒进行测序，通过测序确定M14位点所对应的19种不同氨基酸突变体。将构建好的19种不同氨基酸突变体分别用SacI线性化，通过电转化方法，转入毕赤酵母X33。电转过程大致如下：（1）将酵母感受态细胞置于冰上放置20分钟；（2）加入80ng线性化后的表达载体，混匀冰上放置5分钟后进行电转化，电转化条件为1.5千伏，400欧姆；（3）电击完后立即加入0.6mL预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；（4）30℃，静止放置2小时后涂布于YPDZ平板，培养2-3天后观察转化子的情况。为了使几丁质酶表达框以单拷贝的形式存在，转入的质粒浓度控制在80ng。

由于转入的质粒浓度控制在80ng，涂布的YPDZ平板均长出2~4个阳性转化子。阳性转化子的筛选采用24孔板法，具体步骤如下：将YPDZ平板上的重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2mL BMGY培养基的24孔板，30℃，200rpm过夜培养24小时后，4000rpm离心去掉上清，加入2mL的BMMY培养基，30℃，200rpm培养24小时，测定重组转化子几丁质酶活性。几丁质酶活性的测定方法如下：首先将胶体几丁质和酶液在45℃分别进行预热；将预热好的500μL酶液加入10ml玻璃试管，然后在加入500ml胶体几丁质溶液，45℃反应30分钟后加入2mlDNS试剂终止反应，于100℃沸水浴10分钟进行显色，冷却后离心取上清在540nm下测定吸光值。酶活单位的定义为：每分钟生成1μmol乙酰氨基葡萄糖所用酶的量定义为一个活力单位。

通过筛选对应的四个位点分别获得一个有效突变体，分别是F187W、W261F、Q16A和M14G。在24孔培养条件下，F187W、W261F、Q16A和M14G对应的发酵酶活分别为1.7U/mL、1.6U/mL、1.3U/mL和1.4U/mL，而对照ChiAm的酶活则为1.1U/mL，相比于对照ChiAm，F187W、W261F、Q16A和M14G在24孔板条件下分别提升54%、45%、18%和27%。

实施例3 组合突变

以实施列2获得的有效突变F187W、W261F、Q16A和M14G进行组合突变，拟进一步提升几丁质酶ChiAm的比酶活。以F187W为出发模板，分别构建双突变体F187W/W261F、F187W/Q16A和F187W/M14G，实验所用引物分别为实施例2中表1所示。突变体的构建和筛选过程均和实施例2相同，通过实验发现在单拷贝的情况下，双突变体F187W/Q16A、F187W/W261F、F187W/M14G以及对照F187W的发酵酶活分别为2.1U/mL、1.9U/mL、1.7U/mL和1.7U/mL。

以双突变体F187W/Q16A为模板，分别构建组合突变体F187W/Q16A/W261F、F187W/Q16A/ M14G以及F187W/Q16A/W261F/M14G。通过筛选发现只有三突变体F187W/Q16A/W261F（命名为ChiM）能够进一步提升几丁质酶ChiAm比酶活，在单拷贝的情况下其发酵酶活为2.5U/mL，相比ChiAm、F187W以及F187W/Q16A（酶活分别为1.1U/mL，1.7U/mL和2.1U/mL），酶活分别提高127%、47%和19%。

实施例4 高拷贝重组毕赤酵母工程构建及筛选

基因拷贝数和重组酶的表达量具有一定的关联性，在本部分拟通过构建高拷贝来提升突变体ChiM的表达量。电转化时，线性化表达载体的浓度大于3μg/mL，电转后的转化子涂布在不同浓度的YPDZ平板（100mg/L -500 mg/L zeocin）。转化子的筛选方法同实施列2一致，通过筛选获得了一个酶活优势菌命名为Chi56。通过荧光定量PCR分析，重组工程菌Chi56的基因拷贝数，实验过程大致如下：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因gapdh作为内参；用Primer Express Software针对目的基因chim和gapdh设计引物，其中引物gap-fw和gap-rev用于扩增gapdh基因，引物chim-fw和引物 chim-rev用于扩增chim基因，其中，gap-fw的引物序列信息如SEQ ID NO.21所示，gap-rev的引物序列信息如SEQ ID NO.22所示，chim-fw的引物序列信息如SEQ ID NO.23所示，chim-rev的引物序列信息如SEQ IDNO.24所示；用美国伯乐公司CFX ConnectTM Real-Time Systerm荧光定量PCR仪执行所有反应及数据收集。

gap-fw：ACAAGGACTGGAGAGGTGGTAGAAC（SEQ ID NO.21）；

gap-rev：GAGACAACGGCATCTTCAGTGTAAC（SEQ ID NO.22）；

chim-fw：CTGCTATCGCTAACGAAT（SEQ ID NO.23）；

chim-rev：GAAAGTGAATCTACCCAAA（SEQ ID NO.24）

实验过程大致如下：（1）首先建立双标准曲线，将构建的载体pMD20T-chim和pMD20T-gapdh稀释成不同浓度拷贝数（108至103拷贝数/μL），分别用相应引物进行荧光定量PCR，反应体系如表4所示，反应条件为95℃，预变性1分钟；95℃，变性15秒；50℃，退火15秒；72℃，延伸1分钟；40个循环；（2）测定重组工程菌的拷贝数，提取目标菌种的基因组DNA，将提取好的基因组DNA按照10倍梯度稀释（10-1、10-2和10-3），将稀释好的模板进行荧光定量PCR，每个梯度重复进行三次，将荧光定量PCR获得的结果代入标准曲线计算相应的拷贝数。基因拷贝数采取相对定量的方法进行计算，因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为看家基因在毕赤酵母基因组上以单拷贝形式存在，因此chim相对于 gapdh 的值即其在毕赤酵母的基因拷贝数。通过分析Chi56的基因拷贝数为5拷贝。

表4 荧光定量PCR反应体系

将筛选到的酶活优势菌株Chi56进行摇瓶培养，摇瓶培养在250mL三角瓶中进行，首先将相应的重组工程菌种接入含有5mLBMGY培养基的50mL离心管中，30℃，220rpm培养24小时左右，将培养好的重组酵母工程菌种按1%（v/v）的接种量接入含有50mLBMMY培养基的250mL三角瓶中。摇瓶培养条件为30℃，220rpm，每隔24小时加入1%（v/v）的甲醇进行诱导，同时取样进行几丁质酶活性的测定，通过酶活测定发现，诱导培养120小时后，Chi56发酵酶活为6.5U/mL。

实施例5 重组工程菌Chi56高密度发酵培养

重组工程菌Chi56的高密度发酵在5L发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌Chi56接入含有50mLYPDZ培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1%（v/v）的接种量接入含有100 mL YPG培养基的500mL三角瓶中，30℃，200 rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10%（v/v）的接种量接入含有2L BSM培养基的5L发酵罐。重组酵母工程菌在5 L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量（180 g/L左右），停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整，整个培养过程溶氧不低于20%。培养过程中，每24小时取样测定菌体湿重、酶活和总蛋白浓度。由图2可知，当诱导培养至196小时，发酵酶活达到最大（152U/mL），总蛋白浓度最大为2.51g/L。

将发酵液进行蛋白纯化，得到重组几丁质酶突变体ChiM，纯化过程大致如下：

（1）将5L发酵罐的发酵液离心取上清进行纯化回收；

（2）用10 kDa超滤管将上清酶液进行超滤浓缩；

（3）用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒进行纯化。

纯化后的重组突变体ChiM的酶比活为71U/mg。

实施例6 重组突变体ChiM最适反应温度

在pH5.0条件下测定突变体ChiM在30-70℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活，整个实验过程以几丁质酶ChiAm作为对照。由图3可知：突变体ChiM和重组几丁质酶ChiAm的最适反应温度均为50℃；突变体ChiM在低温条件下的相对酶活高于几丁质酶ChiAm，ChiM在30℃和40℃的相对酶活下分别为76%和90%，ChiAm则为53%和75%。

实施例7 重组突变体ChiM最适反应pH

在50℃条件下测定突变体ChiM在pH3.0-8.0下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100%，计算其他pH下的相对酶活，整个实验过程以几丁质酶ChiAm作为对照。由图4可知，突变体ChiM和重组几丁质酶ChiAm的最适反应pH几乎一致，均为5；在pH4~6范围内，相对酶活均大于60%。

实施例8 重组突变体ChiM水解产物小白菜水培实验

重组几丁质酶突变体ChiM水解几丁质反应如下：称取0.2g胶体几丁质溶于50ml乙酸乙酸钠缓冲液（pH5.0），加入100U重组几丁质酶突变体ChiM，50℃，120rpm进行水解反应，水解8小时后离心取上清，作为实验样品。以小白菜为研究对象，研究ChiM水解产物对水培小白菜生根和促长的应用效果。实验采用水培法，将小白菜种子放置于实验室水培培养瓶中，采用基础营养液进行水培。将几丁寡糖样品分别稀释500倍、1000倍、1500倍以及2000倍进行实验，以基础营养液培养组作为对照，定期测定植株根长和鲜重。培养35天后，对照、500倍、1000倍、1500倍和2000倍小白菜的根长分别为29.8cm、33.5cm、35.1cm、37.7cm和46.5cm；同时这些样品的鲜重分别为17.9g，23.5g，24.3g，25.1g和28.4g。实验结果如图5所示，由图5可知，添加几丁寡糖能够促进小白菜生长，培养35天后，添加几丁寡糖实验组小白菜的鲜重均高于对照组。其中稀释2000倍效果最明显，相比对照组根长和鲜重分别提升51%和58%。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 深圳润康生态环境股份有限公司

<120> 一种几丁质酶突变体ChiM及应用

<130> 2021.6.28

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> 几丁质酶突变体ChiM的氨基酸序列(Amino acid sequence of chitinasemutant ChiM)

<400> 1

Ala Leu Ser Asn Asn Trp Tyr Ala Ala Ala Pro Tyr Leu Met Pro Ala

1 5 10 15

Ser Asn Asn Pro Pro Asp Pro Val Thr Val Met Asn Ala Thr Gly Leu

20 25 30

Lys Ala Phe Gln Leu Ala Phe Ile Leu Ala Pro Asn Gly Gly Gly Cys

35 40 45

Ser Pro Thr Trp Asp Gly Thr Ser Ala Val Ser Ser Asp Thr Ala Val

50 55 60

Ala Gly Val Ile Ser Arg Ile Arg Gly Ala Gly Gly Asp Val Ser Val

65 70 75 80

Ser Val Gly Gly Tyr Gly Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Cys Gly Thr

85 90 95

Val Ala Ala Thr Ala Ala Ala Tyr Gln Gln Val Ile Thr Lys Tyr Ser

100 105 110

Leu Lys Ala Ile Asp Phe Asp Leu Glu Glu Pro Glu Tyr Glu Asn Thr

115 120 125

Ala Ala Ile Ala Asn Glu Leu Gly Ala Ala Lys Thr Leu Gln Ala Asn

130 135 140

Asn Pro Gly Leu Phe Val Ser Val Thr Met Pro Gly Thr Ala Ala Gly

145 150 155 160

Thr Gly Trp Phe Gly Thr Gln Leu Ile Asp Gln Ala Lys Ser Ile Gly

165 170 175

Phe Ser Pro Asn Asn Phe Ser Ile Met Pro Trp Asp Gly Gly Phe Asn

180 185 190

Gly Gly Ser Ser Gln Val Ser Ala Leu Glu Ala Phe His Gly Leu Leu

195 200 205

Met Ser His Met Gly Trp Asp Ser Ala Thr Ala Tyr Ala His Glu Gly

210 215 220

Phe Ser Gly Met Asn Gly Lys Ser Asp Ala Ala Glu Met Phe Tyr Thr

225 230 235 240

Ser Asp Phe Gln Thr Val Tyr Asp Tyr Ala Thr Ser His Gly Leu Gly

245 250 255

Arg Phe Thr Phe Phe Ser Val Asn Arg Asp Arg Ala Cys Val Gly Thr

260 265 270

Thr Asp Asn Gly Val Cys Ser Asn Val Pro Gln Asn Asp Trp Asp Phe

275 280 285

Thr Lys Phe Ser Val Arg Phe Ala Gly Ala Thr Pro Pro Gln Thr Thr

290 295 300

Pro Pro Val Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro Gly Asn Gly Ser Cys Thr

305 310 315 320

Ala Ala Glu Trp Asp Arg Thr Lys Val Tyr Val Lys Asp Asn Val Val

325 330 335

Ser His Asn Ser His Lys Trp Thr Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly Glu

340 345 350

Glu Pro Gly Thr Thr Gly Glu Trp Gly Val Trp Gln Asp Asn Gly Ala

355 360 365

Cys

<210> 2

<211> 1110

<212> DNA

<213> 多聚核苷酸序列(Polynucleotide sequence)

<400> 2

gctttgtcta acaactggta cgctgctgct ccatacttga tgccagcatc taacaaccca 60

ccagacccag ttactgttat gaacgctact ggtttgaagg ctttccaatt ggctttcatc 120

ttggctccaa acggtggtgg ttgttctcca acttgggacg gtacttctgc tgtttcttct 180

gacactgctg ttgctggtgt tatctctaga atcagaggtg ctggtggtga cgtttctgtt 240

tctgttggtg gttacggtgg tactaagttg ggtcaaactt gtggtactgt tgctgctact 300

gctgctgctt accaacaagt tatcactaag tactctttga aggctatcga cttcgacttg 360

gaagaaccag aatacgaaaa cactgctgct atcgctaacg aattgggtgc tgctaagact 420

ttgcaagcta acaacccagg tttgttcgtt tctgttacta tgccaggtac tgctgctggt 480

actggttggt tcggtactca attgatcgac caagctaagt ctatcggttt ctctccaaac 540

aacttctcta tcatgccatg ggacggtggt ttcaacggtg gttcttctca agtttctgct 600

ttggaagctt tccacggttt gttgatgtct cacatgggtt gggactctgc tactgcttac 660

gctcacgaag gtttctctgg tatgaacggt aagtctgacg ctgctgaaat gttctacact 720

tctgacttcc aaactgttta cgactacgct acttctcacg gtttgggtag attcactttc 780

ttctctgtta acagagacag agcttgtgtt ggtactactg acaacggtgt ttgttctaac 840

gttccacaaa acgactggga cttcactaag ttctctgtta gattcgctgg tgctactcca 900

ccacaaacta ctccaccagt tactactact ccaactactc caggtaacgg ttcttgtact 960

gctgctgaat gggacagaac taaggtttac gttaaggaca acgttgtttc tcacaactct 1020

cacaagtgga ctgctaagtg gtggactcaa ggtgaagaac caggtactac tggtgaatgg 1080

ggtgtttggc aagacaacgg tgcttgttaa 1110

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> M14-fw

<400> 3

gctgctccat acttgnnncc acaatctaac aacc 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> M14-rev

<400> 4

ggttgttaga ttgtggnnnc aagtatggag cagc 34

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Q16-fw

<400> 5

ccatacttga tgccannntc taacaaccca ccaga 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Q16-rev

<400> 6

tctggtgggt tgttagannn tggcatcaag tatgg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> F187-fw

<400> 7

ttctctatca tgccannnga cggtggtttc aacgg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> F187-rev

<400> 8

ccgttgaaac caccgtcnnn tggcatgata gagaa 35

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> W261-fw

<400> 9

tagattcact ttcnnntctg ttaacagaga ca 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> W261-rev

<400> 10

tgtctctgtt aacagannng aaagtgaatc ta 32

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> F187W-fw

<400> 11

tctatcatgc catgggacgg tggtttcaac 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> F187W-rev

<400> 12

gttgaaacca ccgtcccatg gcatgataga 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> W261F-fw

<400> 13

agattcactt tcttctctgt taacagagac 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> W261F-rev

<400> 14

gtctctgtta acagagaaga aagtgaatct 30

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Q16A-fw

<400> 15

atacttgatg ccagcttcta acaacccacc ag 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Q16A-rev

<400> 16

ctggtgggtt gttagaagct ggcatcaagt at 32

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> M14G-fw

<400> 17

tgctccatac ttgggcccac aatctaacaa c 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> M14G-rev

<400> 18

gttgttagat tgtgggccca agtatggagc a 31

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 5’AOX-fw

<400> 19

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 3’AOX-rev

<400> 20

ggcacctggc attctgacat cc 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> gap-fw

<400> 21

acaaggactg gagaggtggt agaac 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> gap-rev

<400> 22

gagacaacgg catcttcagt gtaac 25

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> chim-fw

<400> 23

ctgctatcgc taacgaat 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> chim-rev

<400> 24

gaaagtgaat ctacccaaa 19